Schichtmikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern zur biaxialen mechanischen Charakterisierung und mikrostrukturellen Quantifizierung

Diese Methode kann die Beiträge von Gewebeschichten zum gesamten Gewebeverhalten isolieren und neue Einblicke in die Gewebemikrostruktur liefern. Unser Mikrodissektions- und Testrahmen ermöglicht es uns, die mechanischen und mikrostrukturellen Eigenschaften von Herzklappenblättern direkt mit ihren eigenen Verbundschichten zu vergleichen. Die Mikrodissektion kann schwierig zu meistern sein, daher wird dringend empfohlen, so viel wie möglich zu üben, bevor Sie mit der Studie beginnen.

Sammeln Sie zuerst die erforderlichen Materialien, Wachsbrett, DI-Wasser, Pipette, Skalpell, Mikroschere, dünne Pinzette, gebogene Pinzette, dicke Pinzette und Stifte. Demontieren Sie das Gewebe vom biaxialen Tester und messen Sie seine Dicke mit dem Laser-Wegsensor. Legen Sie das Gewebe auf das Wachsbrett.

Untersuchen Sie die ventrikuläre Seite des Gewebes auf große Chorda-Insertionen. Machen Sie ein Foto als Referenz. Verteilen Sie das Gewebe flach auf dem Wachsbrett mit dem Vorhof nach oben.

Um das Gewebe an der Platte zu befestigen, platzieren Sie in jeder Ecke einen vom Gewebe abgewinkelten Stift, so dass er das Gewebe leicht strafft. Stellen Sie sicher, dass sich die Stifte bei der Montage des Gewebes außerhalb der von den Zinken erzeugten Löcher befinden und das Gewebe quadratisch ist und sich während der Schichtmikrodissektion nicht verschiebt. Platzieren Sie bei Bedarf während der Dissektion Stifte entlang der Seite des Gewebes, um das Gewebe mehr zu dehnen.

Entfernen Sie die Glasperlenmarkierungen. Legen Sie DI-Wasser mit einer Pipette auf die Oberfläche des Gewebes, so dass es das Gewebe vollständig blasenartig bedeckt. Um die erste Ecke zu machen, wählen Sie eine Ecke des gepinnten Exemplars aus und vermeiden Sie große Chorda-Einfügungen in zerbrechlichen Bereichen.

Schneiden Sie dann die A / S-Schicht ab, indem Sie das Skalpell für mechanische Tests leicht über die Gewebeoberfläche entlang der Montagelöcher ziehen. Die Kanten des Schnitts beginnen sich auseinander zu ziehen und enthüllen die darunter liegende F / V-Schicht. Mit stumpfen, dünnen Pinzetten fest entlang des Schnitts reiben, um seine Kanten weiter zu trennen.

Wenn sich der Schnitt in der A/S-Schicht nicht auseinander zieht, ziehen Sie mit einem Skalpell noch einmal leicht über den gleichen Schnitt. Machen Sie einen zweiten Schnitt senkrecht zum ersten Schnitt. Wenn die beiden Schnitte nicht miteinander verbunden sind, führen Sie die dünne Pinzette unter den kleinen Gewebebereich, der die beiden Schnitte trennt.

Verwenden Sie dann vorsichtig die Schere, um das Gewebe zu schneiden. Reiben Sie die Schnitte der Ecke mit einer dünnen Pinzette entlang, bis sich das Gewebe von der F / V-Schicht trennt. Sobald ein kleines Stück Gewebe getrennt ist, greifen Sie es mit der großen Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig an, um die Verbundschichten weiter zu trennen.

Schälen Sie das Gewebe weiter, während Sie es mit einer größeren Pinzette greifen, um ein unerwünschtes Reißen und Reißen der A / S-Verbundschicht zu verhindern, und reiben Sie die Naht, bis sie das Ende der beiden Schnitte für die Ecke erreicht. Wenn die erste Ecke größere Probleme mit der Trennung hat, versuchen Sie es mit einer anderen Ecke als Ausgangspunkt. Um dann eine zweite Ecke zu machen, verlängern Sie die beiden Schnitte für die erste Ecke, indem Sie die Skalpellspitze an der Unterseite jedes Schnitts platzieren und leicht entlang der Gewebeoberfläche ziehen, so dass die Schnittverlängerungen mit den ursprünglichen Schnitten verbunden sind und weiterhin den Zinken- oder Nahtlöchern folgen.

Verlängern Sie die Schnitte weiter und schälen Sie die obere A/S-Verbundschicht zurück, während Sie die Naht reiben, bis eine Seite fertig ist. Beachten Sie, dass das Gewebe entlang eines Schnitts vollständig getrennt wird. Als nächstes erstellen Sie eine zweite Ecke senkrecht zum Ende der vollständig geschälten Seite.

Verlängern Sie die verbleibenden Schnitte, während Sie große Chorda-Einfügungen vermeiden. Schließen Sie die Chorda-Insertionen nur dann aus dem A/S-Trennbereich aus, wenn dieser Ausschluss eine A/S-Probe zulässt, die groß genug für experimentelle Charakterisierungen ist. Setzen Sie die Trennung der A/S- und F/V-Schichten fort, indem Sie die für die erste Ecke verwendeten Reib- und Zugtechniken anwenden.

Hören Sie sofort auf, das Gewebe zu trennen, wenn sich ein Riss oder ein Loch bildet. Um zu verhindern, dass sich eine Pinzette verfängt, legen Sie die Schere in ein sich bildendes Loch und schneiden Sie das Gewebe von der Mitte weg. Wenn sich der Defekt entlang der Trennnaht bildet, beginnen Sie, das Gewebe entlang einer anderen Kante zu trennen.

Suchen Sie nach Verbindungen zwischen den Schichten, die bei der Trennung des Gewebes auftreten können, und verhindern Sie eine weitere Gewebetrennung. Beachten Sie, dass es sich um dünne, aber starke Stränge handelt, die sorgfältig mit einer Schere geschnitten werden müssen. Vermeiden Sie es, eine Bohrung in der A/S-Schicht zu erzeugen oder nach unten in die F/V-Schicht zu schneiden.

Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die größtmögliche Probe der A/S-Schicht getrennt wurde. Markieren Sie die Ausrichtung der Probe mit dem OP-Pen. Zum Schluss mit der Schere entlang der Trennnaht für den restlichen Geweberand schneiden.

Legen Sie die abgetrennte A/S-Verbundschicht flach auf die Schneidmatte. Verwenden Sie bei Bedarf das Skalpell, um die Kanten des Gewebes zu begradigen und eine quadratische Gewebeform zu schaffen, die für biaxiale mechanische Tests geeignet ist. Legen Sie die A / S-Schicht in DI-Wasser, bis sie zum Testen bereit ist.

Markieren Sie die Ausrichtung der F/V-Schicht, die auf der Wachsplatte verbleibt. Schneiden Sie das größtmögliche Quadrat aus dem Bereich aus, in dem die A/S-Schicht entfernt wurde. Legen Sie es dann in DI-Wasser.

Eine histologische Analyse des intakten Blättchens und der beiden sezierten Schichten bestätigte, ob das Gewebe entlang der Grenze zwischen Spongiosa und Fibrosa korrekt getrennt war. Die histologischen Mikroaufnahmen wurden verwendet, um die Dicke der Gewebeschicht und die Bestandteile der Masse mit der ImageJ-Software zu bestimmen. Die verdrängungskontrollierte mechanische Prüfung und Nachbearbeitung ergab Membranspannungs- versus Dehnungsdaten der vorderen Trikuspidalklappen-Broschüre, der Trikuspidalklappen-hinteren Packungsbeilage und der Trikuspidalklappen-Septum-Broschüre, die das nichtlineare mechanische Verhalten des Gewebes beschreiben.

Die polarisierten Bildgebungsdaten des räumlichen Frequenzbereichs lieferten Farbkarten der Kollagenfaserorientierung und des Grades der optischen Anisotropie. Insbesondere lieferten diese Farbkarten ein umfassendes Verständnis der Kollagenfaserarchitektur über die gesamte Gewebeprobe hinweg. Es ist wichtig zu beachten, dass die zusammengesetzte Schicht schrumpft, sobald sie vom gepinnten Gewebe getrennt wird.

Sammeln Sie die größtmögliche Probe, um sicherzustellen, dass genügend Gewebe für die anschließenden Tests vorhanden ist.