Amplifikation von Escherichia coli in einem Continuous-Flow-PCR-Mikrofluidik-Chip und deren Detektion mit einem Kapillarelektrophorese-System

Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Continuous-Flow-Polymerase-Kettensystem auf Basis des Mikrofluidik-Chips aufbaut und wie man ein Kapillarelektrophorese-System im Labor aufbaut. Es stellt eine einfache Möglichkeit für die Analyse von Nukleinsäuren im Labor dar. Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine traditionelle Methode zur Amplifikation des Zielgens.

Die herkömmliche PCR ist jedoch aufgrund der Effizienz bei niedrigen Temperaturschwankungen sehr zeitaufwändig. In dieser Arbeit wird ein Continuous-Flow-PCR-System vorgeschlagen, das auf dem Mikrofluidik-Chip basiert. Die Amplifikationszeit kann stark verkürzt werden, indem die PCR-Lösung in einen Mikrokanal geleitet wird, der auf Heizgeräten mit unterschiedlichen Temperaturen platziert ist.

Da CE viele Vorteile hat, wie z. B. hohe Auflösung, hohe Geschwindigkeit und hervorragende Reproduzierbarkeit, wurde es zu einem beliebten Werkzeug im Labor für die Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen. Die meisten Labore, insbesondere die Labore in Entwicklungsländern, können sich diese Technologie jedoch aufgrund des hohen Preises des CE-Instruments nicht leisten. Hier haben wir Protokolle für die Herstellung des CF-PCR-Mikrofluidik-Chips und den Aufbau eines vielseitigen CE-Systems im Labor skizziert.

Wir demonstrieren auch den Prozess der Amplifikation von Escherichia coli durch das CF-PCR-System und den Nachweis der PCR-Produkte durch das CE-System. Durch die Befolgung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sollten Benutzer in der Lage sein, mikrofluidische Chips herzustellen, PCR-Lösungen herzustellen, ein CF-PCR-System für die Nukleinsäureamplifikation aufzubauen und ein einfaches CE-System einzurichten, selbst mit begrenzten Ressourcen, um DNA-Fragmente zu trennen. Erhitzen Sie den Siliziumwafer 25 Minuten lang auf 200 Grad Celsius, um die Feuchtigkeit zu entfernen.

Geben Sie einen Milliliter SU-8 2075 Fotolack pro Zoll des Wafers ab. Drehen Sie es auf dem Siliziumwafer mit einem Spin Coater bei 500 U/min für 5 bis 10 Sekunden mit einer Beschleunigung von 100 U/min und dann bei 2.000 U/min für 30 Sekunden mit einer Beschleunigung von 500 U/min pro Sekunde. Bei 65 Grad Celsius drei Minuten und 15 Minuten bei 95 Grad Celsius weich backen.

Stellen Sie 150 bis 215 Millijoule pro Quadratzentimeter als Belichtungsenergie für das Fotolithographiegerät ein und gravieren Sie das entworfene Muster mit einer Fotolithographiemaske auf den Fotolack. Legen Sie den Siliziumwafer und die Maske für die Belichtung bereit. Nach der Belichtung backen Sie die Waffel zwei Minuten lang bei 65 Grad Celsius und sieben Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Tauchen Sie den Siliziumwafer in eine Entwicklerlösung, um überschüssigen Fotolack zu entfernen, und nehmen Sie ihn heraus, wenn die Mikrokanäle sichtbar sind. Anschließend mit Isopropanol die restliche Entwicklerlösung abspülen. Mischen Sie das Polydimethylsiloxan-Prepolymer und den Härter im Verhältnis 10 zu 1.

Gießen Sie die gemischte PDMS-Lösung in die Replikationsform und erstarren Sie sie bei 80 Grad Celsius für 60 Minuten. Kleben Sie den PDMS-Mikrofluidik-Chip nach der Aktivierung mit einem Plasmareiniger auf einen Objektträger und verfestigen Sie ihn so schnell wie möglich bei 80 Grad Celsius für 30 Minuten. Verwenden Sie einen Vortex-Mischer und eine Zentrifuge, um sicherzustellen, dass die Reagenzien gut gemischt sind.

Bereiten Sie ein Zentrifugenröhrchen vor. Geben Sie zunächst Wasser in das Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann die DNA-Vorlage, den Primer, den Puffer, die dNTP-Mischung, Tween 20, PVP und schließlich die DNA-Polymerase hinzu.

Zum Schluss mischen Sie die Lösung durch Vortex. Bereiten Sie zwei PTC-Keramikheizungen, zwei Halbleiterrelais, zwei Temperaturregler, zwei Temperatursensoren und ein Netzkabel vor. Schließen Sie die Heizung an das Halbleiterrelais an.

Schließen Sie das Halbleiterrelais an den PID-Temperaturregler an. Befestigen Sie dann die Temperaturfühlersonde an der Unterseite der beiden Heizungen und verbinden Sie die Klemme mit dem PID-Temperaturregler. Zum Schluss schalten Sie zwei Halbleiterrelais in Reihe und schließen Sie das Netzkabel an.

Drucken Sie einen Schlitz für die beiden Heizungen in 3D und halten Sie die Heizungen auf derselben Ebene. Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf den beiden Heizungen. Bereiten Sie eine Spritzenpumpe und eine Spritze vor und befestigen Sie dann die Spritze auf der Spritzenpumpe.

Verbinden Sie einen Silikonschlauch mit einer Spritze und verbinden Sie eine Stahlnadel mit der Oberseite des Silikonschlauchs. Führen Sie die Stahlnadel in den Einlass des Mikrofluidik-Chips ein. Platzieren Sie eine Pipettenspitze am Ausgang des Chips, um die PCR-Produkte aufzufangen.

Verwenden Sie ein Hochspannungsnetzteil, um ein elektrisches Feld mit gepulstem Feld zu erzeugen. Schauen Sie, das ist ein Hochspannungsnetzteil. Dabei handelt es sich um positive und negative Elektroden.

Verwenden Sie eine Quecksilberlampe als Lichtquelle und filtern Sie die Anregungswellenlänge der Quecksilberlampe durch einen Filter. Platzieren Sie die Kapillare auf dem Mikroskoptisch. Sammeln Sie die Fluoreszenzemission mit dem Objektiv und detektieren Sie sie dann mit einer Photomultiplier-Röhre.

Das ist unser Mikroskop und das ist unsere Kapillare. Jetzt schalten wir das Licht unter dunklen Raumbedingungen ein. Das Anregungslicht wird vom Objektiv gesammelt.

Verwenden Sie die selbst entwickelte Software LABVIEW, um die Stromversorgung zu steuern und die Datenerfassung abzuschließen. Stellen Sie die Temperatur der Heizungen des CF-PCR-Systems auf 65 Grad Celsius und 95 Grad Celsius ein. Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf den beiden Heizblöcken.

Führen Sie die Spitze des Silikonröhrchens in ein Zentrifugenröhrchen ein, das 50 Mikroliter der PCR-Lösung enthält. Ziehen Sie am Kolben der Spritze, um die Lösung langsam herauszuziehen. Befestigen Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe.

Führen Sie die Stahlnadel in den Einlass des Mikrofluidik-Chips ein. Stellen Sie die Durchflussmenge der Pumpe auf 10 Mikroliter pro Minute ein und drücken Sie den Startknopf, um die Lösung in den Mikrokanal am Einlass des Mikrochips zu drücken. Sammeln Sie die PCR-Produkte am Ausgang des Mikrofluidik-Chips.

Bereiten Sie eine Kapillare mit 8 Zentimetern Gesamtlänge und 6 Zentimetern effektiver Länge vor. Bereiten Sie den Trennpuffer vor, indem Sie 100 Mikroliter 1 % HEC, zwei Mikroliter 100 x SYBR Green und 98 Mikroliter Reinstwasser mischen, um 0,5 % HEC mit 1x SYBR Green zu erhalten. Füllen Sie die Kapillare mit dem vorbereiteten Trennpuffer mit einer Vakuumpumpe.

Geben Sie die Injektionsspannung und die Injektionszeit auf der Softwareoberfläche ein, klicken Sie auf die Startschaltfläche und warten Sie, bis die PCR-Produkte elektrodynamisch in die Kapillare eingeführt wurden. Geben Sie die Gleichspannung auf der Softwareoberfläche ein, klicken Sie auf die Starttaste und führen Sie die Elektrophorese mit 100 Volt pro Zentimeter elektrischer Feldstärke durch. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, nachdem alle DNA-Fragmente in der Kapillare getrennt wurden.

Spülen Sie die Kapillare nach jedem Lauf eine Minute lang mit sterilisiertem Wasser. Dieses Bild stellt das Elektropherogramm von PCR-Produkten und DNA-Markern dar. Wir haben zunächst das Zielgen von Escherichia coli im CF-PCR-System amplifiziert, und die PCR-Lösung dauerte etwa 10 Minuten und 30 Sekunden vom Einlass bis zum Auslass des Chips.

Die Größe des Zielamplikons von Escherichia coli betrug 544 bp. Danach analysierten wir die amplifizierten PCR-Produkte im Kapillarelektrophorese-System. Darüber hinaus führten wir auch die Kapillarelektrophorese einer 100 bp DNA-Leiter unter den gleichen experimentellen Bedingungen durch.

Die Größe des PCR-Produkts kann anhand des Elektropherogramms der DNA-Leiter beurteilt werden. Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Daten in diesem Bild zeigen, dass der Peak, der PCR-Produkten von Escherichia coli entspricht, nach der Trennung beobachtet wurde und die Migrationszeit der PCR-Produkte im Mikrofluidik-Chip mit der in einem Thermocycler übereinstimmte.

Sowohl PCR als auch CE sind zwei beliebte Biotechnologien in der Analyse von Nukleinsäuren. Dieser Artikel beschreibt die Amplifikation von Escherichia coli und den Nachweis der PCR-Produkte mit den CF-PCR- und CE-Systemen, die beide im eigenen Haus entwickelt wurden. Das Zielgen von Escherichia coli wurde innerhalb von 10 Minuten erfolgreich amplifiziert und die DNA-Fragmente, die kleiner als 1.500 bp waren, wurden innerhalb von acht Minuten getrennt.

Auch das CF-PCR-System, das auf dem Mikrofluidik-Chip basiert, und das CE-System, das in dieser Arbeit vorgestellt wurde, sind einfach herzustellen und können eine einfache Möglichkeit für die Analyse von Nukleinsäuren im Labor bieten. Es kann jeweils nur eine Probe amplifizieren und detektieren, was seine breite Anwendung einschränkt. Daher ist die Entwicklung eines integrierten CF-PCR- und CE-Mikrofluidik-Chip-Arrays für den Hochdurchsatznachweis von Krankheitserregern noch auf dem Weg.