Name: Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat mit sichtbarem violettem Licht zur Inaktivierung pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus und E. coli. Diese sichere Methode eignet sich für therapeutische Anwendungen und Lebensmittelsanierung.

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Die Autoren danken Dr. Tak-Wah Wong und Herrn Zong-Jhe Hsieh für ihre Unterstützung bei den Experimenten.

1. Einrichtung des Photolysesystems
<ol><li>Sechs Leuchtdioden (LED) (DC 12 V) werden an der Innenseite eines undurchsichtigen Kunststoffbechers (8 cm x 7 cm) montiert, wie in Figur 1 gezeigt, um ein Photolysesystem31 einzurichten.</li>
	<li>Geben Sie Reaktanten (siehe unten) in die Glasreagenzgläser (13 mm Durchmesser und 100 mm Höhe) und befestigen Sie die Röhrchen oben im Becher, wie in Abbildung 1 gezeigt. Stellen Sie den Versuchsaufbau in einen Raum mit einer konstanten Temperatur von 25 ± 3 °C.</li>
	<li>Überwachen und erfassen Sie die Temperatur der Testeinheiten während der photolytischen Reaktionen mit einem Infrarot-Thermometer. HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Emissionsspektren für blaues, grünes, rotes und violettes Licht, wie sie mit einem kalibrierten optischen UV-Vis-Spektrometer aufgezeichnet wurden. Die Wellenlängen, die dem Extinktionsmaximum für blaue, grüne, rote und violette LED-Lichter entsprechen, die in der Studie verwendet wurden, sind 465, 529, 632 bzw. 405 nm. Die LED-Chips können die Apparatur bei Bestrahlungsexperimenten erwärmen. Das gesamte Photoreaktionssystem wurde daher in jedem Experiment in einem Raum platziert, in dem die Temperatur konstant bei 25 ± 3 °C gehalten wurde.</li>
</ol>2. Der Einfluss der Lichtwellenlänge auf die Photolyse von FMN (Abbildung 3)
<ol><li>Bereiten Sie eine 0,1 mM FMN-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (PB) (pH 7,8) vor. Belichten Sie FMN-Proben (jeweils 3 ml) 5 Minuten lang blauem, grünem, rotem oder violettem Licht mit einer Intensität von 10 W/m2 . Bewahren Sie 3 ml FMN-Lösung als Kontrolle im Dunkeln auf.</li>
	<li>Aufzeichnung der Absorption von bestrahlten FMN-Proben im Bereich von 250-750 nm mit einem UV/Visible-Spektralphotometer.</li>
</ol>3. Nitroblautetrazolium (NBT)-Reduktionsmethode zum Nachweis <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> (Abbildung 4).
ANMERKUNG: Die hier verwendete NBT-Reduktionsmethode wurde gegenüber dem Assay für Riboflavin-Photoreaktion leicht modifiziert. Die NBT-Reduktionsmethode wird verwendet, um das Niveau der durch die FMN-Photolyse erzeugten <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> Werte zu bewerten. Das photochemisch angeregte FMN wird zunächst durch L-Methionin zu einem Semichinon reduziert, das dann ein Elektron an Sauerstoff abgibt, wodurch 31 entsteht<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">. Das erzeugte <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> NBT reduziert zu Formazan, das eine charakteristische Absorption bei 560 nm32 aufweist.
<ol><li>Fügen Sie 109,3 mg L-Methionin zu 73,3 ml PB (100 mM; pH 7,8) hinzu. Vortex die Lösung, um das L-Methionin aufzulösen.</li>
	<li>Nachdem das L-Methionin vollständig aufgelöst ist, fügen Sie der Lösung 10 mg NBT-Pulver und 1,53 ml 0,117 mM FMN hinzu. Für jeden 1 ml der Reaktionslösung (d. h. eine Mischung aus FMN, L-Methionin und NBT) betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M bzw. 1,6 x 10-4 M.</li>
	<li>Die Reaktionslösung (1 ml) wird 1-5 min lang blauer oder violetter LED-Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 ausgesetzt.</li>
	<li>Detektieren Sie die Spezies (aus der Absorption bei 560 nm), die durch die photochemische Reaktion erzeugt wird, die <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> NBT reduziert und Formazan produziert.</li>
</ol>4. Lebensfähigkeit von S. aureus nach FMN-Photolyse (Abbildung 5)
<ol><li>Eine Kolonie von S. aureus (BCRC 10451) wird von einer kultivierten Platte in 10 ml Lysogenbrühe übertragen, die in einem 15-ml-Reagenzglas mit Schraubverschluss entnommen wird. Kultur in einem Shaker bei 37 °C für 16 h.</li>
	<li>Übertragen Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Geben Sie sterilisiertes Wasser in das Zentrifugenröhrchen, um die Kultur auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 KBE/ml) zu verdünnen.</li>
	<li>Geben Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 x g und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml FMN-gepufferte Lösung (30, 60 und 120 μM FMN in PB) zu den wie in Schritt 4.3 erhaltenen Zellpellets hinzu und wirbeln Sie aus. Für die Bestrahlungskontrolle fügen Sie 1 ml PB allein hinzu.</li>
	<li>Übertragen Sie je 1 ml lebensfähige bakterielle Zelllösungen, die nur 30 μM FMN und PB enthalten, in Glasröhrchen und bestrahlen Sie sie mit violettem Licht bei 10 W/m2 für 30 min.</li>
	<li>Übertragen Sie jeweils 1 ml lebensfähiger bakterieller Zelllösungen, die 30, 60 und 120 μM FMN und PB enthalten, in Glasröhrchen und bestrahlen Sie sie mit blauem Licht bei 20 W/m2 für 120 min. Stellen Sie ein weiteres Glasröhrchen mit 1 ml lebensfähiger Bakterienzelllösung auf, die 120 μM FMN enthält, und bestrahlen Sie es 60 Minuten lang mit blauem Licht bei 20 W/m2 .</li>
	<li>Stellen Sie die Reagenzgläser wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben auf und decken Sie sie mit dicken Aluminiumfolien ab. Diese Röhren dienen als Dunkelregler.</li>
	<li>Bewahren Sie die Bestrahlungskammer (sowie die Dunkelregler) während der Bestrahlungszeit von 30-120 min in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C auf. HINWEIS: Die von LED-Leuchten freigesetzte Wärme kann nicht ignoriert werden, da die im Inneren des Bechers platzierten LED-Chips das Photoreaktionssystem während der Bestrahlungsexperimente erwärmen können. Die Versuche wurden daher in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C durchgeführt.</li>
	<li>Nach der Bestrahlung werden 0,2 ml aus jeder der Reaktionslösungen auf eine Luria-Agarplatte (LA) übertragen. Die Bakterien mit einem L-förmigen Glasstab auf der Platte verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Berechnen Sie die lebensfähige Keimzahl und die Inaktivierungsraten von S. aureus nach nächtlichem Wachstum. ANMERKUNG: Die Inaktivierungsrate von S. aureus wird als prozentuale Reduktion berechnet, die [1 -I / D] ×100% entspricht, wobei I und D die Anzahl der KBE in der bestrahlten Probe bzw. der Dunkelkontrolle bezeichnen. Die prozentuale Minderung ist definiert als negativer Wert der Inaktivierungsrate.</li>
</ol>5. Nachweis von <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="font-size: 14px; margin: auto;"> In S. aureus (Abbildung 6)
<ol><li>Bereiten Sie die S. aureus-Proben wie in Schritt 4 beschrieben vor.</li>
	<li>Die Bakteriendichte der Proben wird mit sterilisiertem Wasser auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600, ~6 x 106 KBE/ml) verdünnt. Übertragen Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 14.000 x g für 10 min und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 0,1093 g L-Methionin, 0,1 g NBT und 25 ml FMN (400, 240 oder 120 μM) zu 75 ml PB hinzu. Für jeden 1 ml des applizierten Reaktanten betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 100 (60 oder 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M bzw. 1,2 x 10-3 M.</li>
	<li>1 ml jeder Reaktantenlösung (d. h. mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen) zu den wie in Schritt 5.2 erhaltenen Zellpellets zugeben. Bestrahlen Sie die Lösungen mit violettem Licht bei 10 W/m2 für 10 min.</li>
	<li>Das Gemisch wird bei 14.000 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um das reduzierte NBT zu extrahieren. Die erzeugten <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> Spezies werden aus der Absorption bei 560 nm nachgewiesen.</li>
</ol>6. Statistische Auswertung
<ol><li>Drücken Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Tests aus.</li>
	<li>Wenden Sie einen homoskedastischen Zweistichproben-t-Test an, um zu beurteilen, ob zwei Messungen unterschiedlich sind. p-Werte &lt; 0,05 gelten als statistisch signifikant.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Ein Photosensibilisator erhöht die photochemische Reaktion chemischer Verbindungen, um ROS zu erzeugen. Pathogene Mikroorganismen können durch Lichtbestrahlung in Gegenwart von Photosensibilisatoren inaktiviert werden. Diese Studie bestimmt den aPDI von S. aureus aufgrund von ROS, das durch violette Lichtbestrahlung eines exogenen Photosensibilisators FMN erzeugt wird.
Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die Extinktion bei FMN bei 444 nm nach 5 Minuten Be...

Riboflavin-5′-phosphat (FMN) entsteht durch Phosphorylierung an der Riboflavin-5′-Position der Ribitylseitenkette und wird von allen Flavoproteinen für zahlreiche zelluläre Prozesse zur Energiegewinnung benötigt. Es spielt auch die Rolle des Vitamins für einige Funktionen im menschlichen Körper1. FMN ist etwa 200-mal wasserlöslicher als Riboflavin2.
Die antibakterielle photodynamische Inaktivierung (aPDI) von Bakterien ist ein wirksames Mittel zur Kontrolle der Resistenz gegen Bakterien3,4, da sie nicht von der Art der bakteriellen Resistenz abhängt. Klinisch wird aPDI zur Behandlung von Weichteilinfektionen eingesetzt, um die Infektion der nosokomialen Haut durch multiresistente Bakterienzu verringern 5,6,7,8,9. aPDI erzeugt auch den Zelltod, indem es reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt. ROS, wie Superoxidradikale (), Singulett-Sauerstoff, Hydroxylradikale (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">•OH) und Peroxyl-Radikale, sind freie Radikale oder Moleküle, die reaktiven Sauerstoff 10,11,12 enthalten und normalerweise reaktiv sind 13. Ähnlich wie DNA-Schäden, die durch ROS verursacht werden, sind auch die Membranperoxidation und die Zerstörung von Endothelzellen nachteilige biochemische Reaktionen, die auf ROS in Zellenzurückzuführen sind 12.
Die Verwendung von aPDI für pathogene Bakterien beinhaltet eine sichtbare oder UV-Lichtquelle zur Inaktivierung von Mikroorganismen in Gegenwart chemischer Verbindungen wie Methylthioniniumchlorid 14, PEI-c e6-Konjugat 15, Porphyrin16, Titandioxid 17, Toluidinblau O 18 und Zinkoxid-Nanopartikel 19. Toluidinblau O und Methylenblau sind Phenothiaziniumfarbstoffe und Methylenblau hat toxische Eigenschaften. Zinkoxid-Nanopartikel und UV-Strahlung sind mit negativen Auswirkungen auf Gesundheit und Umwelt verbunden. Daher verdient die Nutzung eines zuverlässigen, sicheren und einfachen Photosensibilisators durch Photolyse unter sichtbarer Bestrahlung weitere Untersuchungen.
Der Mikronährstoff, Riboflavin oder FMN, ist nicht toxisch und wird in der Tat für die Lebensmittelherstellung oder Fütterungverwendet 20. Sowohl FMN als auch Riboflavin sind sehr empfindlich gegenüber Lichteinstrahlung2. Unter UV 1,2,21,22,23 und Blaulichteinstrahlung 10,24 erreichen diese beiden Verbindungen einen angeregten Zustand. Das aktivierte Riboflavin oder FMN, das durch Photolyse erzeugt wird, wird in seinen Triplett-Zustand befördert und ROS werden gleichzeitigerzeugt 2,25. Kumar et al. berichteten, dass Riboflavin, das durch UV-Licht aktiviert wird, selektiv eine erhöhte Schädigung des Guanin-Anteils der DNA in pathogenen Mikroorganismen verursacht26. Unter Bestrahlung mit UV-Licht wird gezeigt, dass photodynamisch aktiviertes Riboflavin die Bildung von 8-OH-dG, einem Biomarker für oxidativen Stress, in doppelsträngiger DNAfördert 27. Es wird berichtet, dass S. aureus und E. coli während der Riboflavin- oder FMN-Photolyse durch ROS deaktiviert werden10,24,28. Eine frühere Studie der Autoren zeigte, dass die photolytischen Reaktionen mit Riboflavin und FMN Kristallviolett, einen Triarylmethanfarbstoff und ein antibakterielles Mittel, das Kristallviolett erzeugt und den größten Teil der antimikrobiellen Fähigkeit von Kristallviolett28 erzeugt<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;">, reduzieren und eliminieren. Wenn Flavin-Adenin-Dinukleotid oder FMN mit blauem Licht bestrahlt wird, erzeugen die resultierenden ROS Apoptose in HeLa-Zellen für ihre Vergiftung in vitro29. Unter Verwendung einer photochemischen Behandlung in Gegenwart von Riboflavin inaktivierten Cui et al. Lymphozyten durch Hemmung ihrer Proliferation und Zytokinproduktion30.
Die Photolyse von Riboflavin wird zur Inaktivierung von Blutpathogenen durch UV 10,24 verwendet, jedoch können Blutbestandteile unter UV-Lichtbestrahlung beeinträchtigt werden30. Es wird auch berichtet, dass Thrombozyten, die UV-Strahlung ausgesetzt sind, die Leistung der Aktivierungsmarker P-Selektin und LIMP-CD63 auf ihren Membranen progressiv verbessern. Die Zytotoxizität von UV- und hochintensiver Bestrahlung muss untersucht werden, und ein Photosensibilisator, der während einer FMN-Photoreaktion mit sichtbarem Licht unkompliziert und sicher ist, wäre von großem Nutzen.
Licht kürzerer Wellenlängen hat mehr Energie und verursacht viel eher schwere Schäden an Zellen. In Gegenwart eines geeigneten Photosensibilisators kann die Bestrahlung mit violettem Licht geringer Intensität jedoch pathogene Mikroorganismen hemmen. Die Photosensibilisierung und die Erzeugung von FMN bei Bestrahlung mit violettem Licht ist daher wichtig zu untersuchen, um den Weg zu bestimmen, auf dem ROS aus der FMN-Photolyse die Inaktivierung von <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> Bakterien erhöht.
Antimikrobielle Kontrolle ist ein häufiges Problem und die Entwicklung neuer Antibiotika dauert oft Jahrzehnte. Nach der Bestrahlung mit violettem Licht kann die Photoinaktivierung, die durch FMN vermittelt wird, umweltpathogene Bakterien vernichten. Diese Studie stellt ein wirksames antimikrobielles Protokoll in vitro vor, das violettes Licht verwendet, um die FMN-Photolyse zu steuern und somit für aPDI zu erzeugen <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01.jpg" style="margin: auto;"> . Die mikrobielle Lebensfähigkeit von S. aureus wird verwendet, um die Machbarkeit von FMN-induziertem aPDI zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Blaue, grüne und rote LED-Leuchten</td><td>Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan</td><td></td><td>DC 12 V 5050</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>190186</td><td></td></tr><tr><td>Infrarot-Thermometer</td><td>Raytek Co. Santa Cruz, CA</td><td>MT4</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Difco Co., NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>1.05707</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>China tech Co., New Taipei City, Taiwan</td><td>YP30-3-2</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5&prime;-phosphat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R7774</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solarstromzähler</td><td>Tenmars Electronics Co., Taipeh, Taiwan</td><td>TM-207</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus</td><td>Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan</td><td>10451</td><td></td></tr><tr><td>Optisches UV-Vis-Spektrometer</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>USB4000</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japan</td><td>U-2900</td><td></td></tr><tr><td>Violette LED</td><td>Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inaktivierung von krankheitserregern durch photolyse von riboflavin-5′-phosphat im sichtbaren licht

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5'-phosphat (oder Flavinmononukleotid; FMN) ist empfindlich gegenüber sichtbarem Licht. Verschiedene Verbindungen, einschließlich reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), können durch FMN-Photolyse bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht erzeugt werden. Die durch FMN-Photolyse erzeugten ROS sind schädlich für Mikroorganismen, einschließlich pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus (S. aureus). Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Deaktivierung von S. aureus als Beispiel durch photochemische Reaktionen vor, an denen FMN unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht beteiligt ist. Das bei der FMN-Photolyse erzeugte Superoxid-Radikal-Anion () wird mittels Nitroblautetrazolium (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;">NBT)-Reduktion ausgewertet. Die mikrobielle Lebensfähigkeit von S. aureus, die reaktiven <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;"> Spezies zugeschrieben wird, wurde verwendet, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu bestimmen. Die bakterielle Inaktivierungsrate ist proportional zur FMN-Konzentration. Violettes Licht ist bei der Inaktivierung von S. aureus effizienter als die Bestrahlung mit blauem Licht, während das rote oder grüne Licht die FMN-Photolyse nicht antreibt. Der vorliegende Artikel demonstriert die FMN-Photolyse als einfache und sichere Methode für sanitäre Prozesse.

Einfluss der Lichtwellenlänge auf FMN Die Absorptionsspektren von 0,1 mM FMN, die mit blauen, grünen, roten und violetten LEDs bestrahlt werden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt zwei Peaks für FMN (372 nm und 444 nm) für die Dunkelkontrolle. Grünes und rotes Licht haben keine Wirkung, da Änderungen in den Spektren unbedeutend sind. Auf der anderen Seite ist die jeweilige Absorption von FMN bei 444 nm nach blauer und violetter Lichtbestrahlung bei 10 W/m2</sup...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Inaktivierung pathogener Bakterien mit reaktiven Sauerstoffspezies vor, die während der Photolyse von Flavinmononukleotid (FMN) unter blauer und violetter Lichtbestrahlung niedriger Intensität entstehen. Die FMN-Photolyse hat sich als einfache und sichere Methode für hygienische Prozesse erwiesen.

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Dieses Protokoll verwendet die Bestrahlung mit sichtbarem violettem Licht, um die Flavinmononukleotid-Photolyse zu induzieren. Dabei entsteht eine große Menge an freien Radikalen, die pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus und E. coli hemmen. Wir haben Flavinmononukleotid als geeigneten Photosensibilisator getestet.In diesem Protokoll verwenden wir sichtbares violettes Licht, das sicher ist und keine teure Ausrüstung erfordert. Diese Methode kann zur Therapie von verletzter Haut oder infiziertem Unterhautgewebe verwendet werden, indem eine optische Faser zur Beleuchtung eingeführt wird. Es kann auch auf die Hygienepraxis in der Lebensmittelindustrie angewendet werden.Tang-Yu Chen, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren Zunächst montieren Sie sechs Leuchtdioden mit je 12 Volt an der Innenseite eines undurchsichtigen Plastikbechers. Nehmen Sie ein gläsernes Reagenzglas mit einem Durchmesser von 13 Millimetern und einer Höhe von 100 Millimetern und geben Sie die Reaktanten in das Röhrchen. Befestigen Sie die Schläuche oben im Becher und stellen Sie dieses Setup auf eine konstante Temperatur von 25 bis drei Grad Celsius.Überwachen und erfassen Sie die Temperatur der Testeinheiten während der photolytischen Reaktionen mit einem Infrarot-Thermometer. Als nächstes wird eine 0,1-Millimolar-FMN-Lösung in 100-Millimolar-Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,8 hergestellt. Belichten Sie jeweils drei Milliliter FMN-Proben fünf Minuten lang blauem, grünem, rotem oder violettem Licht.Halten Sie parallel drei Milliliter FMN-Lösung im Dunkeln als Kontrolle. Legen Sie die Probe in ein UV-sichtbares Spektralphotometer und zeichnen Sie die Absorption der bestrahlten Proben im Bereich von 250 bis 750 Nanometern auf. Um sich auf den Nachweis von Superoxidradikalen vorzubereiten, fügen Sie zunächst 109,3 Milligramm L-Methionin zu 73,3 Milliliter 100-Millimolarphosphatpuffer bei pH 7,8 hinzu.In die Lösung geben Sie 10 Milligramm NBT-Pulver und 1,5 Milliliter 0,117-Millimolar-FMN. Setzen Sie einen Milliliter der Reaktionslösung für ein bis fünf Minuten blauem oder violettem LED-Licht aus. Notieren Sie die Absorption von 516 Nanometern, um Formazan nachzuweisen, das durch die photochemische Reaktion von NBT erzeugt wird.Impfen Sie eine Kolonie von Staphylococcus aureus in 10 Milliliter Lysogenie-Bouillon in einem 15-Milliliter-Reagenzglas mit Schraubverschluss. Züchten Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden in einem Shaker. Übertragen Sie 0,5 Milliliter der Kultur in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Verdünnen Sie die Kultur auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern durch Zugabe von sterilisiertem Wasser. Dann werden 0,5 Milliliter der Kultur in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Bei 14.000 g für 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand dekantieren.Fügen Sie dem Zellpellet und dem Wirbel einen Milliliter FMN-gepufferte Lösung hinzu. Zur Bestrahlungskontrolle wird ein Milliliter Phosphatpuffer hinzugefügt. Einen Milliliter bakterielle Zelllösung, die 30-mikromolare FMN und Phosphatpuffer enthält, in Glasröhrchen überführen.Platzieren Sie sie für eine Strahlung unter violettem Licht mit 10 Watt pro Quadratmeter für 30 Minuten. Dann wird ein Milliliter bakterielle Zelllösung mit 30-60 und 120 Mikromolar FMN und Phosphatpuffer in Glasröhrchen übertragen. Bestrahlen Sie 120 Minuten lang mit blauem Licht bei 20 Watt pro Quadratmeter Quadratmeter.Bestrahlen Sie auch ein Röhrchen mit einem Milliliter 120-Mikromolar FMN für 60 Minuten. Nach der Bestrahlung werden 0,2 Milliliter der Reaktionslösung auf eine Luria-Agarplatte gegeben. Die Lösung mit einem L-förmigen Glasstab verteilen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.Berechnen Sie am nächsten Tag die lebensfähige Keimzahl und die Inaktivierungsrate von Staphylococcus aureus. Bereiten Sie die Staphylococcus aureus-Proben wie zuvor beschrieben vor, um ein Zellpellet zu erhalten. Zu 75 Milliliter Phosphatpuffer werden 0,1093 Gramm L-Methionin, 0,1 Gramm NBT und 25 Milliliter FMN-Lösung hinzugefügt.Geben Sie einen Milliliter jeder Reaktantenlösung mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen zu den Zellpellets und dem Wirbel. Bestrahlen Sie die Lösungen 10 Minuten lang unter violettem Licht mit 10 Watt pro Quadratmeter Quadratmeter. Das Gemisch wird 10 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert und der Überstand dekantiert.Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Dimethylsulfoxid, um das reduzierte NBT zu extrahieren. Notieren Sie die Absorption bei 560 Nanometern. Die Bestrahlung von FMN mit grünem und rotem Licht zeigte keine Wirkung auf die Peaks bei 372 und 444 Nanometern im Vergleich zur Dunkelkontrolle, während die Verringerung der Absorption von FMN bei 444 Nanometern unter blauem und violettem Licht beobachtet wurde, was auf eine erhöhte Photolyse hindeutet.Der Nachweis von Superoxidradikalen, die während der FMN-Photolyse unter blauem oder violettem Licht gebildet wurden, erfolgte mittels NBT-Reduktion. Die photochemische Wirkung von FMN war abhängig von der Bestrahlungszeit. Die FMN-Photolyse mit blauem oder violettem Licht führte zu einer signifikanten Inaktivierung von Staphylococcus aureus.Bei der Bestrahlung mit blauem Licht wurde eine dosisabhängige Inaktivierung beobachtet, wobei eine Inaktivierung von 97 % für 120-mikromolares FMN erreicht wurde. Unter violettem Licht wurde eine Inaktivierungsrate von 96% für Staphylococcus aureus erreicht, wobei 30-mikromolare FMN eine höhere Wirksamkeit für die bakterielle Inaktivierung zeigte. Die NBT-Reduktion zeigte, dass die photolytische Wirkung von FMN unter violettem Licht bei Staphylococcus aureus proportional zur FMN-Konzentration war.Unter unbehandelten Bedingungen wurde eine geringere Häufigkeit von Superoxidradikalen durch eine geringe Absorption bei 560 Nanometern angezeigt, während höhere Absorptionswerte bei der FMN-Behandlung eine reichliche Produktion von Superoxidradikalen zeigten, was zu einem erhöhten photochemischen Effekt führte. Es ist wichtig, eine gute LED-Lichtquelle zu haben. Die spektrale Breite des violetten Lichtbereichs muss eng sein, um eine Überlappung mit der UV-Absorption zu vermeiden, da UV-Strahlung gefährlich sein kann.Im Anschluss an das Verfahren können andere chemische Verbindungen wie Tetracyclin, Doxycyclin, Catechin und FMN auf Photolyse getestet werden.

inactivation-pathogens-via-visible-light-photolysis-riboflavin-5

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen, dass eine entwickelte biomedizinischen Vorrichtung mit kontinuierlicher oder gepulster sichtbaren Laser basierende Behandlung, die mit Antibiotika (Gentamycin), führt zu einer statistisch signifikanten synergistischen Effekt führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit...

Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismen

Quelle: Cheng, C., et al. Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5'-Phosphat im sichtbaren Licht. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der phototoxischen Wirkungen von Flavinmononukleotid (FMN) auf pathogene Bakterien. Bakterienkulturen werden steigenden Konzentrationen von FMN ausgesetzt und mit sichtbarem Licht beleuchtet, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, die zelluläre Komponenten schädigen. Die überlebenden Bakterien...

Inaktivierung von Bakterien mit lichtaktiviertem Flavin-Mononukleotid

Quelle: Cheng, C., et al. Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5'-Phosphat im sichtbaren Licht. J. Vis. Exp. (2022).In diesem Video wird ein gepuffertes Reaktionsgemisch aus L-Methionin, Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und Flavinmononukleotid (FMN) mit violettem Licht bestrahlt, um die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu induzieren. Dies führt zur bakteriellen Inaktivierung und zur Bildung von spektrometrisch nachweisbarem Formazan.

Quantifizierung der lichtinduzierten bakteriellen Inaktivierung durch Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies

Quelle: Zhao, K. et al. Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Wirkung der 5-Aminolevulinsäure-vermittelten photodynamischen Therapie auf den Biofilm von Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)Das Video demonstriert ein photodynamisches Therapieprotokoll zur Bewertung antibakterieller Effekte auf Gram-positive bakterielle Biofilme. Biofilme werden in vier Gruppen unterteilt: Zwei erhalten einen Photosensibilisierer-Vorläufer, zwei erhalten einen Puffer. Alle werden im Dunkeln inkubiert,...

Lichtaktivierte Behandlung bakterieller Biofilme mit einem Photosensibilisator-Vorläufer

Dieses Video zeigt den auf Riboflavin und UV-Licht basierenden Prozess zur Reduzierung von Krankheitserregern gegen bakterielle Kontamination mit hohen Titern in menschlichen Thrombozytenprodukten. Dieses Verfahren könnte dazu beitragen, das Risiko schwerer unerwünschter Transfusionsereignisse im Zusammenhang mit bakterieller Kontamination zu senken.

Eine Riboflavin- und UV-Lichtbehandlung von Thrombozytenprodukten zur Beseitigung von Bakterien

Die Lagerbedingungen von Thrombozytenprodukten schaffen eine ideale Umgebung für bakterielle Verunreinigungen, um sich auf ein gefährliches Niveau zu vermehren.  Das Ziel dieser Studie war es, einen koloniebildenden Assay zu verwenden, um einen Riboflavin-basierten Erregerreduktionsprozess gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer in humanen Thrombozytenprodukten zu bewerten.

Behandlung von Thrombozyten Produkte mit Riboflavin und UV-Licht: Wirksamkeit gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer

Infektionen, die durch multiresistente (MDR) Bakterienstämme verursacht werden, haben sich zu einer ernsthaften Bedrohung für die öffentliche Gesundheit entwickelt, die die Entwicklung alternativer Therapeutika erforderlich macht. Wir stellen ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit einer antimikrobiellen Blaulichttherapie (aBL) bei MDR-Acinetobacter baumannii-Infektionen bei Mausverbrennungen unter Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu bewerten.

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung

Die zunehmende Inzidenz von arzneimittelresistenten Candida albicans ist weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Pilzinfektionen bieten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die bengalenvermittelte aPDT-Wirksamkeit von Rose auf einem multiresistenten C. albicans-Stamm in vitro.

Rosenbengalen-vermittelte photodynamische Therapie zur Hemmung von Candida albicans

Das vorliegende Protokoll beschreibt Modifikationen des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) mit einem Lichtbeleuchtungssystem, die Herstellung flüssiger Zellen und in situ TEM-Beobachtungen von lichtinduzierten Wechselwirkungen zwischen Bakterienzellen und einem Photosensibilisator. Die Probenvorbereitungsmethoden, die Elektronenstrahlschädigung und die Bildgebung werden ebenfalls diskutiert.

Lichtinduzierte In situ Transmissionselektronenmikroskopie zur Beobachtung der Wechselwirkung zwischen flüssiger und weicher Materie

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Photosensibilisatoren bei der antibakteriellen photodynamischen Inaktivierung (aPDI) unter Verwendung eines 96-Well-Plattenformats in Kombination mit einer LED-Panel-Lichtquelle. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Prüfung mehrerer experimenteller Bedingungen, einschließlich unterschiedlicher Konzentrationen, Verbindungen und Bakterienstämme.

LED-basiertes In-vitro-Screening zur Beurteilung photoaktivierbarer Moleküle bei bakterieller photodynamischer Inaktivierung

Ein 405-nm-Blaulicht-LED-Gerät zeigt eine antimikrobielle Wirksamkeit gegen eine Vielzahl von Wundkrankheitserregern, wenn es an einem kollagenbasierten synthetischen Hautmodell untersucht wird. Dieser vereinfachte In-vitro-Ansatz bietet eine reproduzierbare und ethisch praktikable Alternative für die Frühphasenbewertung lichtbasierter antimikrobieller Therapien.

Untersuchung eines Blaulicht-LED-Geräts zur Unterdrückung von Wundkrankheitserregern mittels eines kollagenbasierten synthetischen Hautmodells

Erfahren Sie die Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat mit sichtbarem violettem Licht zur Inaktivierung pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus und E. coli. Diese sichere Methode eignet sich für therapeutische Anwendungen und Lebensmittelsanierung.

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

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