Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz

Für die Bestimmung von Proteinliganden im mittleren Durchsatz wurde eine Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie etabliert. Es werden unterschiedliche Affinitäten für Bindungsstellenvarianten desselben Moleküls dargestellt, und zwar für die eisenbindenden Hochmanieren von Oligosacchariden auf Viren. SPR ist eine markierungsfreie Technik zur Untersuchung der makromolekularen Echtzeitbindung von oberflächenimmobilisierten Rezeptoren.

Multisite-Interaktionen werden in der kinetischen Analyse durch kompetitive Bindung unabhängig von der Größe der Spezifische Bereiche in der Forschung, die SPR verwenden, sind die Arzneimittelentwicklung zur Suche nach Inhibitoren oder Antikörpercharakterisierung. Kinetische Konstanten und Affinitäten werden direkt aus der Sensorantwort berechnet. Übertragen Sie zunächst 100 Mikroliter der Lösung auf LB-Agarplatten und verteilen Sie sie vorsichtig mit einem sterilen Zellstreuer.

Starten Sie eine Reihe von Probenreaktionen mit mehreren Konzentrationen doppelsträngiger DNA-Schablone im Bereich von fünf bis 50 Nanogramm, während die Primerkonzentration konstant bleibt. Dann fügen Sie das DpnI-Restriktionsenzym unter die Mineralölüberlagerung und inkubieren Sie sofort bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die elterliche supercoiled doppelsträngige DNA zu verdauen. Um die XL1-Blue Supercompetent Cells aufzutauen, aliquoten Sie die Zellen in ein vorgekühltes, kleines, rundes Bodenrohr.

Als nächstes übertragen Sie einen Mikroliter der mit DpnI behandelten einzelsträngigen DNA von jeder Kontroll- und Probenreaktion auf separate Aliquots der superkompetenten Zellen, die den komplementären Strang synthetisieren. Nachdem Sie die Transformationsreaktionen vorsichtig zum Mischen geschwenkt haben, inkubieren Sie die Reaktionen 30 Minuten auf Eis. Wenden Sie 45 Sekunden lang Wärmeimpulse auf die Umwandlungsreaktionen bei 42 Grad Celsius an und legen Sie die Reaktionen dann für zwei Minuten auf Eis.

Dann 0,5 Milliliter NZY+Bouillon hinzufügen und die Umwandlungsreaktionen bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 225 bis 250 U/min für eine Stunde inkubieren. Anschließend wird das korrekte Volumen jeder Umwandlungsreaktion auf LB-Ampicillin-Agar-Platten wie zuvor demonstriert angegeben. Für eine Samenkultur impfen Sie eine kleine Menge Ampicillin-haltiges LB-Medium mit einer einzigen Kolonie aus der transformierten Platte.

Beimpfen Sie die Expressionskultur unter Verwendung der Übernachtkultur mit Zusätzen, einschließlich 10 Millimolar Magnesiumchlorid, 10 Millimolar Magnesiumsulfat und 20 Millimolar Glucose, wobei die Samenkultur auf eins zu 100 verdünnt wird. Als nächstes züchten Sie Zellen mit kräftigem Schütteln bei 37 Grad Celsius auf ein absorbierendes 600 Nanometer zwischen 0,4 und 0,6, bevor Sie die Zellen auf 20 Grad Celsius abkühlen und mit einem Millimolar IPTG induzieren und über Nacht wachsen. Dann ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen den Überstand.

Nach Resuspendierung des Zellpellets in phosphatgepuffertem Salzpuffer, zuletzt Zuflucht bei 4.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann den Überstand mit einer Pipette verwerfen. Als nächstes resuspendieren Sie das verbleibende Pellet in 10 Milliliter Lysepuffer und inkubieren die Suspension für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Dann trennen Sie lösliche und unlösliche Fraktionen durch Zentrifugieren bei 4.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie zusätzlich HIS-Select Ni2+Affinity Gel in 14-Milliliter-Röhrchen, um sein markiertes rekombinant exprimiertes Cyanovirin-N in Pufferlösungen mit 20 Millimolar-Imidazol bzw. 250 Millimolar-Imidazol zu binden und zu resuspendieren. Zwischen diesen Schritten mindestens 30 Minuten im Batch inkubieren.

Zugabe des Elutionspuffers, der 250 Millimolar Imidazol enthält, zu Eluprotein. Die Proteinlösungen werden mit einem 10 Kilo Dalton-Sperrfilter in Zentrifugationsröhrchen überführt und durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 4.500 g und vier Grad Celsius konzentriert. SPR-Laufpuffer auf einen Verdünnungsfaktor von eins bis 10 geben und viermal auf das Ausgangsvolumen für 10 Minuten bei 4, 500 g und vier Grad Celsius zentrifugieren.

Anschließend bestimmen Sie die Proteinkonzentration bei 280 Nanometer mit einem NanoDrop UV-Visible Spectrophotometer basierend auf dem berechneten Extinktionskoeffizienten für das Hauptprotein CVN2L0 mit einer Größe von 23, 474 Dalton. Verwenden Sie für das Zweikanal-SPR-System HBSCP plus als Laufpuffer, 10 Millimolar Glycinsalzsäure mit pH 1,5 bis 1,6 als Regenerationspuffer und schalten Sie den Instrumentenentgaser, den Autosampler und die Pumpe ein. Dann waschen Sie das gesamte System mit doppelt destilliertem Wasser für eine Stunde.

Als nächstes geben Sie Immersionsöl auf den Detektor und montieren einen Glassensorchip, der mit einem dünnen Goldfilm beschichtet ist. Und auf der Oberseite funktionalisiert mit Carboxymethyldextran-Hydrogel direkt auf den Detektor unterhalb der Drei-Port-Durchflusszelle. Korrigieren Sie dann die Einstellung, indem Sie die Handhabung herunterziehen.

Um die proteinhaltigen Liganden auf Sensorchips zu immobilisieren, öffnen Sie eine Run-Tabelle, indem Sie in der Menüleiste auf Formular klicken und den Tabelleneditor in der integrierten SPP-Auto-Link-Software ausführen. Wählen und klicken Sie dann auf Basic Immobilization aus der Liste der verfügbaren Run-Tabellen und folgen Sie den Schritten des experimentellen Verfahrens auf dem Computerbildschirm. Klicken Sie anschließend im Formularbereich auf Sample Set Editor, um die Reagenzienliste für zwei Racks auszufüllen, die zur weiteren Analyse im Autosampler platziert sind.

Klicken Sie auf Autosampler Direct Control als Werkzeug in der Menüleiste, um die Racks nach vorne oder zurück nach Hause zu bringen und wählen Sie vier Grad Celsius als Betriebstemperatur. Starten Sie die Pumpe, um doppelt destilliertes Wasser zu infundieren, indem Sie auf Werkzeuge und die direkte Steuerung der Pumpe klicken. Und zeichnen Sie Daten auf, indem Sie auf SPR Instrument Direct Control klicken.

Beginnen Sie jedes Mal im neu erscheinenden Fenster. Nachdem Sie die Kupplungsreagenzien in 300-Mikroliter-Fläschchen gegeben haben, legen Sie sie in die Autosampler-Racks und starten Sie die Run-Tabelle, indem Sie auf Ausführen klicken. Für die einfache Protein-Protein-Interaktion führen Sie nach dem Nachfüllen der Pumpe mit 25.000 Mikrolitern pro Minute eine Grundlinieneinstellung für 30 Sekunden durch.

Lassen Sie die anschließende Baseline-Einstellung mit doppelt destilliertem Wasser für 1,5 Minuten zu, bevor Sie die aktivierte Chipoberfläche mit einem molaren Ethanolaminhydrochlorid, pH 8,5, abschrecken. Schalten Sie dann die Röhrchen vom Flüssigkeitssammler zum Entgaser von doppelt destilliertem Wasser in die Flasche mit HBS-EP+Klick auf Formular, scrollen Sie nach unten und wechseln Sie zu Nachbearbeitung, indem Sie auf diesen Betriebsmodus klicken. Klicken Sie dann auf Hinzufügen, um für jede Durchflusszelle die im Laufe der Zeit in der Datenplattform generierten Bindungskurven auszuwählen und das Overlay als Scrubber-Datei zu exportieren.

Klicken Sie anschließend auf Datei, um die Dateispeicheroptionen zu öffnen und Antwortkurven zu erhalten, indem Sie linke und rechte Kurven ausrichten und Signale des zweiten Referenzkanals von denen des Ligandenkanals subtrahieren. Einzelne Injektionen von CVN2L0 und Varianz V2 und V5 wurden zunächst auf Bindung an den Hämagglutinin-gekoppelten Sensorchip getestet, um die Bindungskapazitäten mit dem Autosampler und dem Tabelleneditor abzuschätzen. Wiederholte Injektionen wurden im Laufe der Zeit bei verschiedenen Konzentrationen im nanomolaren und mikromolaren Bereich im System automatisiert, was zeigte, dass weder eine Sättigung auf der Chipoberfläche noch eine Gleichgewichtsbindung erreicht wurde.

Die Konzentration versus Reaktion wurde für die CVN-Wildtyp-Bindung an RBD aufgetragen, wobei ein spezifisches Targeting von möglicherweise konservierten Kohlenhydraten auf der RBD S1-Untereinheit mit schwächerer Affinität und einer Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante von 260 Mikromol angenommen wurde. Das gleiche Affinitätsdiagramm für die CVN2L0-V4-Bindung an DM ist aufgrund des Ersatzes von Disulfidbindungen, die die hochaffine Bindung an kleine glykosylierte Peptide stören, nicht mehr analysierbar und ergibt eine höhere Antwort als der Antwortmaximalwert. Die CVN-Wildtyp-Bindung an RBD auf SARS-CoV-2 zeigt eine Bindung an S-Protein und RBD mit einer Dissoziationswütungskonstante von 18,6 Mikromol bzw. 260 Mikromol.

Obwohl die SPR-Reaktion für Analytkonzentrationen zu hohen Reaktionseinheiten und typischen SPR-Sensorgrammen für CVN-Wildtyp- und E41A-Bindung führt. Die Mutante ist jedoch instabil, wenn sie verdünnt wird. SPR-Biosensorik befasst sich mit der hochaffinen und niedrigen Affinitätsbindung von gereinigten Proteinen und ihren Varianten an Liganden.

In unserem Fall Glykoproteine, die die optische Auslesung und das Zweikanal-Durchflusssystem auf der Sensorchipoberfläche nutzen. Der Enzym-Immunosorbens-Assay ist eine alternative immunologische Methode, die Proteinepitope erkennt, aber auch Daten über die Konzentration von Peptiden und kleinen Molekülen aus komplexen Matrices liefert. Das Testen rekombinant exprimierter Proteine durch SPR-Bindungsassays beinhaltete die Biosensorik von Bestätigungsänderungen, was für die Überprüfung und Vorhersage der Proteinstabilität durch computergestützte Proteinseite nützlich ist.