Highly-Multiplexed Tissue Imaging mit Raman-Farbstoffen

Die hochgradig gemultiplexte Schwingungsbildgebung bietet einen optischen One-Shot-Ansatz zur Abfrage mehrerer Proteinmarker in Geweben mit subzellulärer Auflösung. Diese Plattform bietet ein umfassendes Bild der Proteinwechselwirkungen biologischer Systeme. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre zyklusfreie Multiplexie.

Diese Technik eignet sich besonders für Anwendungen, bei denen Zyklusstrategien nicht gut funktionieren, wie z.B. in dicken Gewebeschnitten. Diese Methode ermöglicht die individuelle Zellcharakterisierung in situ für das Verständnis von Strukturen des komplexen Systems, wie z.B. den Aufbau eines Gewebeatlas, die Phänotypisierung von Tumormikroumgebungen und den profilierenden Gehirnschaltkreis. Bereiten Sie zunächst etwa 0,1 molares Natriumbicarbonat im PBS-Puffer bei PHA 0,3 vor, um es als Konjugationspuffer zu verwenden, und lagern Sie es bei vier Grad Celsius.

Dann stellen Sie drei millimolare n-Hydroxysuccinimidester-funktionäre MARS-Sondenlösung in wasserfreiem Dimethylsulfoxid her. Lösen Sie die Antikörperfeststoffe im Konjugationspuffer auf eine Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter auf. Für Antikörper, die in anderen Puffern gelöst sind, konzentrieren Sie sie in einem Zentrifugalfilter und fügen Sie dann in den Konjugationspuffer eine Konzentration von ein bis zwei Milligramm pro Milliliter hinzu.

Um die Konjugationsreaktion für sekundäre Antikörper durchzuführen, fügen Sie der Antikörperlösung in einer Glasdurchstechflasche langsam unter Rühren einen 15-fachen molaren Überschuss an Farbstofflösung hinzu und inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter Rühren für eine Stunde. Um die Reinigung durchzuführen, bereiten Sie die Aufschlämmung vor, indem Sie 10 Milliliter Gelfiltrationsharzpulver in 40 Milliliter PBS-Puffer in einem 50-Milliliter-Rohr geben. Halten Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 90 Grad Celsius für eine Stunde.

Dann dekantieren Sie den Überstand, fügen Sie das PBS bis zu 40 Milliliter hinzu und lagern Sie die Gülle bei vier Grad Celsius. Packen Sie die Größenausschlusssäule mit der Aufschlämmungslösung auf die Höhe von 10 bis 15 Zentimetern, spülen und waschen Sie die Säule dann mit etwa 10 Millilitern PBS, um das Harz weiter zu verpacken. Anschließend pipettieren Sie das Konjugationsreaktionsgemisch an die Säule.

Nach dem Beladen des Reaktionsgemisches sofort einen Milliliter PBS als Elutionspuffer hinzufügen. Anschließend sammeln Sie das Elutionsmittel der konjugierten Lösung, indem Sie die Farbe auf der Säule betrachten oder die Absorption bei 280 Nanometern messen. Konzentrieren Sie die gesammelte Lösung mit dem Zentrifugalfilter auf ein bis zwei Milligramm pro Milliliter.

Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Pen eine Grenze um die Gewebeabschnitte auf dem Objektträger. Dann inkubieren Sie das Gewebe mit 0,3 bis 0,5% PBST für 10 Minuten und einem blockierenden Puffer für 30 Minuten. Um die primäre Färbelösung herzustellen, fügen Sie alle primären Antikörper in den gewünschten Konzentrationen zu 200 bis 500 Mikrolitern Färbepuffer hinzu.

Zentrifugieren Sie die primäre Färbelösung bei 13.000 mal G für fünf Minuten und verwenden Sie den Überstand, wenn Niederschlag auftritt. Dann inkubieren Sie das Gewebe in der primären Antikörperlösung bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Tage. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 0,3 bis 0,5% PBST für fünf Minuten bei Raumtemperatur in einem Schieber-Stehglas und stellen Sie sicher, dass die Taschentücher in die Lösung eingetaucht sind.

Später inkubieren Sie das Gewebe in 200 bis 500 Mikrolitern blockierendem Puffer für 30 Minuten. Um die sekundäre Färbelösung herzustellen, fügen Sie alle sekundären Antikörper zu 200 bis 500 Millilitern Färbepuffer mit den gewünschten Konzentrationen hinzu. Dann zentrifugieren Sie die sekundäre Färbelösung bei 13.000 mal G für fünf Minuten und verwenden Sie den Überstand, wenn Niederschlag auftritt.

Als nächstes inkubieren Sie das Gewebe in 200 bis 500 Mikrolitern sekundärer Antikörperlösung bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Tage. Dann waschen Sie die Dias zweimal mit 0,3 bis 0,5% PBST bei Raumtemperatur für jeweils fünf Minuten. Außerdem mit 200 bis 500 Mikrolitern DAPI-Lösung für 30 Minuten inkubieren.

Waschen Sie die Objektträger erneut dreimal mit PBS bei Raumtemperatur für jeweils fünf Minuten und übertragen Sie die schwimmenden Gewebeabschnitte mit der Glastropfenpipette auf die Glasobjektträger. Verteilen Sie das Gewebe mit einer Taschentuchbürste und reinigen Sie die Umgebung bei Bedarf mit Tüchern. Anschließend montieren Sie das Gewebe in einem Tropfen Anti-Fade-Reagenzien mit einem Glasdeckglas und sichern Sie es mit Nagellack.

Um eine Mehrkanal-eprSRS-Bildgebung durchzuführen, stellen Sie die Laserleistung des Pumpenstrahls auf 10 bis 40 Milliwatt und den Stokes-Strahl auf 40 bis 80 Milliwatt auf dem Laserbedienfeld ein. Stellen Sie dann die Pixelverweilzeit auf zwei bis vier Mikrosekunden ein und verwenden Sie mehrere Frames mit durchschnittlich 10 bis 20 Frames in der Mikroskopie-Software. Stellen Sie außerdem die Zeitkonstanten des Lock-in-Verstärkers auf die Hälfte der Pixelverweilzeit ein.

Raman-Farbstoff-Bildgebung von verschiedenen Proteinmarkern und HeLa-Zellen paraformaldehydfixierte Maus-Hirnrinde und feuchtes Nieren-FFPE-Gewebe wurden durch Immunmarkierung durchgeführt. Die Immun-eprSRS-Bildgebung von HeLa-Zellen mit einem Alpha-Tubulin zeigte feine subzelluläre Strukturen wie Mikrotubuli. Die eprSRS-Bildgebung von MARS 2145-gefärbten Astrozyten und MARS 2228-gefärbten Kleinhirngranula-Neuronen im Hirngewebe der Maus zeigte dreidimensionale Muster mit subzellulärer Auflösung.

Die siebenfarbige SRS-Fluoreszenz-Tandem-Bildgebung von Hormonen und Transkriptionsfaktoren auf gefrorenem Mäuse-Inselgewebe wurde durchgeführt. Die erhaltenen Bilder zeigten einen guten Kontrast und korrekte Muster. Es wurde die achtfarbige SRS-Fluoreszenz-Tandem-Bildgebung von Zelltypmarkern auf paraformaldehydfixiertem Kleinhirngewebe der Maus durchgeführt.

Verschiedene Arten von Zellen wurden identifiziert, wie z.B. Kleinhirngranula-Neuronen, Purkinje-Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und GABAerge Neuronen. Dieses Verfahren kann weiter mit der Gewebereinigung kombiniert werden, um eine hochgradig gemultiplexte Proteinbildgebung in dickem intaktem Gewebe durchzuführen. Unsere Gruppe hat dafür ein Raman-Farbstoff-maßgeschneidertes Gewebereinigungsprotokoll entwickelt.