Name: Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Lernen Sie die globale Quantifizierung posttranslationaler Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe. Diese Methode ermöglicht die umfassende Analyse chromatindynamischer Veränderungen mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Das Sidoli-Labor dankt der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

<ol><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultural+divide%3A+exponential+growth+in+classical+2D+and+metabolic+equilibrium+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments.</a> PLoS One. 9 (9), 106973(2014).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).</li>
<li>Gonda, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+transgenic+cell+model+to+quantify+genotoxic+effects+of+space+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment.</a> Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Tvardovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+and+middle-down+protein+analysis+reveals+that+intact+and+clipped+human+histones+differ+in+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).</li>
<li>Azad, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+chromatin+by+histone+tail+clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modifying chromatin by histone tail clipping.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).</li>
<li>Kragesteen, B. K., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+or+tails%3A+histone+tail+clipping+regulates+macrophage+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity.</a> Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).</li>
<li>Dhaenens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+clipping%3A+the+punctuation+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Histone clipping: the punctuation in the histone code.</a> EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).</li>
<li>Anderson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+histone+proteoforms+using+front-end+electron+transfer+dissociation-enabled+orbitrap+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).</li>
<li>Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+roles+of+histone-modifying+enzymes+and+their+associated+chromatin+modifications+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation.</a> Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Chan, J. C., Maze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothing+is+yet+set+in+%28hi%29stone%3A+novel+post-translational+modifications+regulating+chromatin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Fischle, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+discrimination+of+repressive+methyl-lysine+marks+in+histone+H3+by+Polycomb+and+HP1+chromodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains.</a> Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).</li>
<li>Onder, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+epigenetic+histone+modification+analysis+by+mass+spectrometry+for+clinical+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations.</a> Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Moradian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epiproteomics%3A+quantitative+analysis+of+histone+marks+and+codes+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics%3A+a+still+unexploited+resource+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).</li>
<li>Stampar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+%28HepG2%2FC3A%29+cell-based+3D+model+for+genotoxicity+testing+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals.</a> Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).</li>
<li>Calitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+anti-prolific+properties+of+Xysmalobium+undulatum+water+extract+during+short-term+exposure+to+two-dimensional+and+three-dimensional+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).</li>
<li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+window+acquisition+of+all+theoretical+mass+spectra+%28SWATH%29+analysis+for+characterization+and+quantification+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).</li>
<li>Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+histone+PTMs+using+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+quantifies+histone+peptides+with+modifications+by+extracting+retention+time+and+intensity+in+high-resolution+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Pino, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skyline+ecosystem%3A+Informatics+for+quantitative+mass+spectrometry+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).</li>
<li>Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+protein+fold+change+and+p-value+calculation+for+non-experts+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics.</a> Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).</li>
<li>Lex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UpSet%3A+Visualization+of+intersecting+sets%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">UpSet: Visualization of intersecting sets.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Shah, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTome2%3A+a+database+of+histone+proteins%2C+modifiers+for+multiple+organisms+and+epidrugs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs.</a> Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+succinylation+and+lysine+malonylation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysine succinylation and lysine malonylation in histones.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+succinylation+and+its+function+on+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Histone succinylation and its function on the nucleosome.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).</li>
<li>Howe, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+H3K4me3+instructive+for+transcription+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Is H3K4me3 instructive for transcription activation.</a> Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+H3K9me3+heterochromatin+in+cell+identity+establishment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).</li>
<li>Wojcik, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27+dimethyl+loss+is+highly+specific+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+and+distinguishes+true+PRC2+loss+from+isolated+H3K27+trimethyl+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss.</a> Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).</li>
<li>Sellers, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Farrelly, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+serotonylation+is+a+permissive+modification+that+enhances+TFIID+binding+to+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3.</a> Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP-ribosylation+of+histone+variant+H2AX+promotes+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair.</a> The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+histone+glycation+is+associated+with+disease-related+changes+in+chromatin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture.</a> Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome36). Es ist auch möglich, üb...

Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen 1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren 1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen gewonnen werden, können entweder in zweidimensionalen (2D) oder 3D-Kultursystemen wachsen. In der 2D-Kultur werden Zellen in einer Monoschicht gezüchtet, die an einer flachen Oberflächehaftet 2,4. 2D-Zellkultursysteme zeichnen sich durch exponentielles Wachstum und eine schnelle Verdopplungszeit aus, typischerweise 24 h bis zu einigen Tagen5. Zellen in 3D-Systemen wachsen zu komplizierten Zell-Zell-Interaktionen, die gewebeähnliche Konglomerate genauer modellieren, und sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, ein dynamisches Gleichgewicht zu erreichen, in dem ihre Verdopplungszeit 1 Monat oder länger erreichen kann5.
In diesem Artikel wird eine innovative Methodik zur Züchtung von 3D-Sphäroiden in rotierenden Zellkultursystemen vorgestellt, die eine reduzierte Schwerkraft simulieren6. Dies ist ein vereinfachtes Derivat eines Zellkultursystems, das von der NASA in den 1990er Jahren eingeführtwurde 7. Dieser Ansatz minimiert die Scherkräfte, die bei bestehenden Methoden wie Spinnkolben auftreten, und erhöht die Sphäroidreproduzierbarkeit6. Darüber hinaus erhöht der rotierende Bioreaktor die aktive Nährstoffdiffusion und minimiert die nekrotische Bildung, die in Systemen wie der hängenden Tropfenzellkultur auftritt, in der der Medienaustausch unpraktisch ist6. Auf diese Weise wachsen die Zellen weitgehend ungestört, was die Bildung struktureller und physiologischer Eigenschaften ermöglicht, die mit dem Wachstum von Zellen im Gewebe verbunden sind. Auf diese Weise kultivierte C3A-Hepatozyten (HepG2/C3A) hatten nicht nur ultrastrukturelle Organellen, sondern produzierten auch Mengen an ATP, Adenylatkinase, Harnstoff und Cholesterin, die mit den in vivo 1,2 beobachteten Spiegeln vergleichbar waren. Darüber hinaus weisen Zellen, die in 2D.3D im Vergleich zu Zellkultursystemen gezüchtet wurden, unterschiedliche Genexpressionsmusterauf 8. Die Genexpressionsanalyse von C3A-Hepatozyten, die als 3D-Sphäroide gezüchtet wurden, zeigte, dass diese Zellen eine breite Palette von leberspezifischen Proteinen sowie Gene exprimierten, die an Schlüsselwegen beteiligt sind, die die Leberfunktion regulieren8. Frühere Veröffentlichungen zeigten die Unterschiede zwischen Proteomen exponentiell wachsender Zellen in 2D-Kultur und Zellen im dynamischen Gleichgewicht in 3D-Sphäroidekulturen5. Zu diesen Unterschieden gehört der Zellstoffwechsel, der wiederum die Struktur, Funktion und Physiologie der Zelle beeinflusst5. Das Proteom von Zellen, die in 2D-Kultur gezüchtet wurden, war stärker mit Proteinen angereichert, die an der Zellreplikation beteiligt waren, während das Proteom von 3D-Sphäroiden in der Leberfunktionalitätangereichert war 5.
Die langsamere Replikationsrate von Zellen, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, modelliert genauer spezifische Phänomene, die mit dem Chromatinzustand und Modifikationen verbunden sind (z. B. Histon-Clipping9). Histon-Clipping ist eine irreversible Histon-posttranslationale Modifikation (PTM), die eine proteolytische Spaltung eines Teils des Histon-N-terminalen Schweifs verursacht. Während seine biologische Funktion noch diskutiert wird10,11,12,13, ist es klar, dass seine Anwesenheit in Primärzellen und Lebergewebe von HepG2 / C3A-Zellen modelliert wird, die als Sphäroide gezüchtet wurden, aber nicht als flache Zellen9. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Chromatinzustand und die Modifikationen die DNA-Auslesung hauptsächlich durch Modulation der Zugänglichkeit zu Genen und damit ihrer Expressionregulieren 14. Histon-PTMs beeinflussen entweder den Chromatinzustand direkt, indem sie die Nettoladung der Nukleosomen beeinflussen, in denen Histone zusammengesetzt sind, oder indirekt durch die Rekrutierung von Chromatin-Schreibern, Lesern und Radiergummis14. Hunderte von Histon-PTMs wurden bis heute15 identifiziert, was die Hypothese verstärkt, dass Chromatin einen "Histon-Code" beherbergt, der von der Zelle zur Interpretation von DNA16 verwendet wird. Die Identifizierung einer Vielzahl von PTM-Kombinationen15 und die Entdeckung, dass Kombinationen von Histon-PTMs häufig andere biologische Funktionen haben als PTMs, die isoliert vorliegen (z. B. Fischle, et al.17), zeigen jedoch, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um den "Histoncode" zu entschlüsseln.
Derzeit basiert die Histon-PTM-Analyse entweder auf Techniken, die Antikörper verwenden (z. B. westliche Flecken, Immunfluoreszenz oder Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung [ChIP-seq]) oder Massenspektrometrie (MS). Antikörper-basierte Techniken haben eine hohe Sensitivität und können detaillierte Informationen über die genomweite Lokalisierung von Histonmarkierungen liefern, sind jedoch häufig bei der Untersuchung seltener PTMs oder PTMs in Kombinationenbegrenzt 18,19,20. MS eignet sich besser für den Hochdurchsatz und die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung einzelner und koexistierender Proteinmodifikationen, insbesondere Histonproteine18,19,20. Aus diesen Gründen haben dieses und mehrere andere Labore die MS-Pipeline für die Analyse von Histonpeptiden (Bottom-up-MS), intakten Histonschwänzen (Middle-Down-MS) und Histonproteinen in voller Länge (Top-Down-MS) optimiert21,22,23.
Im Folgenden finden Sie einen Workflow für die Züchtung von HepG2/C3A-Sphäroiden und deren Vorbereitung für die Histonpeptidanalyse (Bottom-up-MS) mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nLC-MS/MS). Eine 2D-Zellkultur wurde gezüchtet und die Zellen wurden geerntet und in einen Bioreaktor gebracht, wo sie Sphäroide bilden würden (Abbildung 1). Nach 18 Tagen in Kultur wurden Sphäroide mit Natriumbutyrat oder Natriumsuccinat behandelt, um die relative Häufigkeit von Histonacetylierung und Succinylierung zu erhöhen. Insbesondere können 3D-Kulturen mit genotoxischen Verbindungen genauso gut behandelt werden wie ihre flachen Kulturäquivalente; Tatsächlich heben neuere Veröffentlichungen hervor, dass die toxikologische Reaktion von Zellen in 3D-Kultur dem Primärgewebe ähnlicher ist als die in 2D-Flachkultur24,25. Zellen wurden dann zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und eine nukleare Isolierung durchgeführt. Dann wurden Histone extrahiert und mit Propionanhydrid vor und nach der Trypsinverdauung nach einem Protokoll abgeleitet, das zuerst von Garcia et al.26 entwickelt wurde. Dieses Verfahren erzeugt Peptide in geeigneter Größe für die Online-Trennung mit Umkehrphasenchromatographie (C18) und den Nachweis mit MS. Schließlich wurden Histonpeptide identifiziert und quantifiziert, und die generierten Daten wurden auf vielfältige Weise für eine vollständigere biologische Interpretation dargestellt.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,5-20 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>BRAND</td><td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro; L Mehrkanalpipette</td><td>BRAND</td><td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td><td>Luer-Lock-Spitze, graduiert auf 12 mL</td></tr><tr><td>10, 20, 200 und 1000 &micro; L Einkanalpipetten</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>18 G Spritzennadel</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td><td>3" Länge, 0,05" Durchmesser</td></tr><tr><td>200 & Mikro; L Mehrkanalpipette</td><td>Corning</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &micro; L Pipettenspitzen</td><td>MARKE</td><td>Z740118 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Mikrotiterplatte mit ultraniedrigem Aufsatz</td><td>Corning</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2&nbsp; U-förmiger Zellkulturkolben</td><td>Corning</td><td>461464U</td><td>Unbehandelt, mit Entlüftungskappe</td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit Rand</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C (Corning)</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>Aceton sollte kalt verwendet werden</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr> Wasser in <tr><td>Zellkulturqualität</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>Bioreaktor für 3D-Zellkulturen</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Clinostat CO2 Inkubator für 3D-Zellkultur</td></tr><tr><td>Steuereinheit</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Tablet für ClinoStar Einstellungen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>17-205-CV</td><td>1X Lösung mit 4,5 g/L Glukose und Natriumpyruvat, ohne L-Glutamin und Phenolrot</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Abzug</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Modell 7121000</td></tr><tr><td>Glas Pasteurpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9", mit Baumwollstecker, Borosilikatglas, unsteriles</td></tr><tr><td>Glutagro-Präparat</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-Ananyl-L-Glutamin</td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1X Lösung ohne Calcium-, Magnesium- und Phenolrot</td></tr><tr><td>HPLC-Qualität Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>Eis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td>100X Lösung</td></tr><tr><td>Oasis HLB-Harz</td><td>Wässer</td><td>186007549</td><td>Hydrophil-Lipophil-Balanced (HLB) Harz mit 30&Mikro; m Partikelgröße</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Hochauflösendes Massenspektrometer</td></tr><tr><td>Oro-Flex I Polypropylen-Filterplatte</td><td>Orochem</td><td>OF1100</td><td>96-Well-Polypropylen-Filterplatte mit 10 & Mikro; M PE-Fritte</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Lösung</td></tr><tr><td>pH-Papier</td><td>Hydrion</td><td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td><td>0-13 pH-Testpapier</td></tr><tr><td>Pipettenpistole</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Polymikro-Kapillare</td><td>Molex</td><td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td><td>Flexibler Kapillarschlauch aus Quarzglas mit Polymidbeschichtung, 75 & Mikro; M ID x 363 & Mikro; M OD</td></tr><tr><td>Polystyrol 10 mL serologische Pipetten, steril</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Propionsäureanhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur Harz</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.0003</td><td>120 & Aring; Porengröße, C18-AQ-Phase, 3 & Mikro; M Bead Size</td></tr><tr><td></td><td>Rotator Clay Adams</td><td>25477 (American Laboratory Trading)</td><td>Nutator Mixer 1105</td></tr><tr><td>Modifiziertes Trypsin in Sequenzierqualität</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Vakuumkonzentrator (1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen)</td><td>Savant</td><td>20249 (American Laboratory Trading)</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Vakuumkonzentrator (96 Well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterilhaube</td><td>Thermo Scientific</td><td>1375</td><td>Klasse II, Typ A2</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker Analysiertes ACS-Reagenz</td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte Schale 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure (TCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC421451000</td><td>Resuspendierung 100 % w/v in Wasser in HPLC-Qualität</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28904</td><td>Sequenzierqualität</td></tr><tr><td>Vakuumverteiler 96-Well-Millipore</td><td></td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung 1000 & Mikro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-703 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung 200 & Mikro; L</td><td>Axygen</td><td>14-222-730 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr></tbody></table>

globale quantifizierung von posttranslationalen histonmodifikationen in einem 3d-zellkulturmodell von lebergewebe

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.

In diesem Protokoll wurden HepG2/C3A-Sphäroide mit 20 mM NaBut und 10 mM NaSuc behandelt, die beide die globalen Konzentrationen von Histon-PTMs beeinflussten (Abbildung 3A). Histon-PTMs wurden dann identifiziert und auf Einzelrückstandsebene mittels MS/MS-Erfassung quantifiziert (Abbildung 3B).
Wenn Stichproben in Replikaten ausgeführt werden, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Anreicherung der Falten...

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Es hat sich gezeigt, dass die globale Chromatindynamik ein wichtiger Mediator für mehrere Krankheitszustände wie Krebs und Altern ist. Unser Protokoll bietet ein physiologisch relevantes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen. Die Standardlaboranalyse von Histon-posttranslationalen Modifikationen oder PTMS beschränkt sich in der Regel auf die Untersuchung eines einzelnen PTM gleichzeitig unter Verwendung von Antikörper-basierten Assays.Die flüssigkeitschromatographische Massenspektrometrie-Analyse von Histon-PTMS ermöglicht es uns, die Häufigkeit von Hunderten von PTMS in einem einzigen Experiment zu messen. Das Verfahren wird von Stephanie Stransky, Ronald Cutler und Julie Kim, einer Postdoktorandin, Doktorandin und Forschungstechnikerin aus dem Labor, demonstriert. Erstens, mit Standard-Wachstumsmedien, züchten Sie die Zellen als Monolayer, bis sie zu 80% konfluent sind.Dann waschen Sie die Zellen mit HBSS. Fügen Sie fünf Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, verdünnt in HBSS. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Zellablösung zu überprüfen. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischen Wachstumsmedien. Fügen Sie 0,5 Milliliter Wachstumsmedien hinzu, um eine extrem niedrige 24-Well-Rundbodenplatte mit jeweils mehreren Mikrovertiefungen auszugleichen.Dann zentrifugieren Sie die Platten bei 3000 x g, um Luftblasen von der Oberfläche der Platte zu entfernen. Übertragen Sie nun die zuvor hergestellte Zellsuspension für drei Minuten bei 120 x g auf die 24-Well-Platte und die Zentrifuge. Überprüfen Sie die Zellen in der 24-Well-Platte und inkubieren Sie dann die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden für die Sphäroidbildung.Um den Bioreaktor auszugleichen, fügen Sie 25 Milliliter steriles Wasser in die Feuchtigkeitskammer und neun Milliliter Wachstumsmedien in die Zellkammer hinzu. Inkubieren Sie den Bioreaktor in einem rotierenden Clinostat-Inkubator für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Lösen Sie die Sphäroide von der extrem niedrig angebrachten 24-Well-Platte, indem Sie sie vorsichtig mit einem Milliliter breiten Bohrungsspitzen pipettieren und in eine Gewebekulturschale geben.Um Sphäroide ausreichend zu formen, überprüfen Sie die Qualität der Sphäroide unter einem Mikroskop. Gute Qualität Sphäroide haben eine gleichmäßige Größe, Kompaktheit und Rundheit. Füllen Sie den ausgeglichenen Bioreaktor mit fünf Millilitern frischem Wachstumsmedium und übertragen Sie die Sphäroide in ihn.Dann füllen Sie den Bioreaktor vollständig mit frischen Wachstumsmedien und legen Sie den Bioreaktor bei 10 bis 11 U / min in den Clinostat-Inkubator. Tauschen Sie alle zwei bis drei Tage Wachstumsmedien aus, indem Sie 10 Milliliter alte Medien durch frische Medien ersetzen. Wenn diese Sphäroide an Größe und Anzahl zunehmen, erhöhen Sie die Rotationsgeschwindigkeit des Inkubators.Nachdem Sie das Sphäroidpellet erhalten haben, fügen Sie dem Pellet fünf Volumina kalte 0,2 molare Schwefelsäure hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um das Pellet zu stören und Histone freizusetzen. Sobald der Überstand nach der Zentrifugation erhalten ist, fügen Sie kalte konzentrierte Trichloressigsäure hinzu, so dass die Endkonzentration 25 bis 30 Volumenprozent beträgt. Und mischen Sie es, indem Sie das Rohr ein paar Mal umkehren und zentrifugieren, wie im Manuskript beschrieben.Nachdem Sie den Überstand mit einer Glasweidepipette entsorgt haben, waschen Sie das Pellet und die Wände des Rohres mit etwa 500 Mikrolitern kaltem Aceton und 0,1% Salzsäure und zentrifugieren Sie dann bei 3.400 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Röhre um, um den Überstand zu verwerfen. Mit einer Glasweidepipette fügen Sie 500 Mikroliter 100% kaltes Aceton hinzu, um das Pellet und die Zentrifuge zu waschen, wie zuvor gezeigt.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, entfernen Sie das Aceton vollständig durch vorsichtiges Pipettieren und lassen Sie die Probe mit einem geöffneten Deckel etwa 20 Minuten trocknen. Resuspendiert das Pellet in 20 Mikrolitern von 15 bis 20% Acetonitril in einem 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat von pH 8. Drehen Sie nach dem Vortexen die Aufhängung bei 1000 x g für 30 Sekunden herunter.Bei acht oder mehr Proben ist jede resuspendierte Probe auf eine 96-Well-Platte zu überführen. Dann fügen Sie in einer Haube zwei Mikroliter Propionanhydrid hinzu und mischen Sie fünfmal durch Pipettieren. Fügen Sie schnell 10 Mikroliter Ammoniumhydroxid hinzu und mischen Sie fünfmal durch Pipettieren.Mischen Sie HLB-Harz auf einer magnetischen Rührplatte. Dann fügen Sie 70 Mikroliter der HLB-Suspension zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Filterplatte auf einer 96-Well-Auffangplatte hinzu. Nachdem Sie den Durchfluss entsorgt haben, waschen Sie das Harz mit 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure.Nachdem Sie jede Probe in 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure resuspendiert haben, laden Sie jede Probe in jede Vertiefung und verhindern Sie das Spritzen mit einem Vakuum. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, waschen Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1% Trifluoressigsäure und legen Sie die Filterplatte auf eine neue Auffangplatte. Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure zu jeder Vertiefung hinzu und verhindern Sie das Spritzen mit Vakuum.Sammeln Sie den Durchfluss durch und trocknen Sie ihn in einem Geschwindigkeitsvakuum. Laden Sie die getrocknete Entnahmeplatte in die HPLC und führen Sie die LC/MS/MS-Methode wie im Manuskript beschrieben aus. In dieser Studie wurde die relative Häufigkeit häufiger posttranslationaler Histonmodifikationen in C3A-Hepatozyten beobachtet, die als dreidimensionale Sphäroide gezüchtet wurden.Posttranslationale Modifikationen konnten auch an einem einzelnen Rest in Peptiden beobachtet werden, die aus Histonproteinen erzeugt wurden. Die Behandlung der Sphäroide mit Natriumbutyrat erhöhte die relative Häufigkeit der Histonacetylierung, während die mit Natriumsuccinat die Histonrestprägnylierung verstärkte. Die Methode zeigte auch das Verteilungsmuster der Histonacetylierung nach der Behandlung mit Natriumbutyrat und das der Histonuccinylierung nach der Behandlung mit Natriumsuccinat.Das Ergebnis zeigte auch gemeinsame Muster verschiedener Histonmodifikationen. Natriumbutyrat-Behandlungen verstärkten signifikant die Acetylierung des Lysinrests 14 auf einem Peptid, das aus dem Histonprotein H3 erzeugt wurde, nur dann, wenn sein neunter Lysinrest zwei Methylgruppen, aber nicht eine oder drei Methylgruppen aufwies. Die relativen Häufigkeiten einzelner Modifikationen und verschiedene Kombinationen posttranslationaler Modifikationen im H3-abgeleiteten Peptid wurden ebenfalls berechnet.Kombinatorische Muster posttranslationaler Modifikationen nach der Behandlung mit Natriumbutyrat wurden auch in einem Peptid beobachtet, das aus dem Histonprotein H4 erzeugt wurde. Auch hier führte die Behandlung mit Natriumbutyrat zu einem signifikanten Anstieg der Acetylierung. Kritische Aufmerksamkeit sollte darauf gelegt werden, die Sphäroide so wenig wie möglich auf der Bank zu halten und in einem Entsalzungsschritt, um ein Verschütten der Probe zu vermeiden. Dieser Workflow kann verwendet werden, um Chromatin in festem Gewebe unter Verwendung eines physiologischeren Modells als schnell replizierender flacher Zellkulturen zu untersuchen.

global-level-quantification-histone-post-translational-modifications

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Reihe von Tests zur Expression von H1 Linker Histonen zu analysieren. mRNA einzelner Gene H1 werden quantitativ durch zufällige Primer basieren reverse Transkription durch real-time PCR gefolgt gemessen, während Protein Quantifizierung der H1-Histone durch HPLC-Analyse erreicht wird.

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf...

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Dieses Protokoll beschreibt einen voll integrierten Workflow für die Charakterisierung von Histon-post-translationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie (MS). Der Workflow umfasst Histon-Reinigung aus Zellkulturen oder Geweben, Histon-Derivatisierung und Verdauung, MS-Analyse unter Verwendung von Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie und Anweisungen für die Datenanalyse. 3 Tage - Das Protokoll wird innerhalb von 2 für die Fertigstellung konzipiert.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Der Zweck dieses Artikels ist es, eine umfassende, systematische Leitfaden für die effiziente Reinigung der Histone H3 und H4 und die Quantifizierung von Schimmelpilzschäden Histon-Rückständen.

Reinigung des H3 und H4-Histon-Proteine und die Quantifizierung der acetylierte Histone Noten in Zellen und Hirngewebe

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung globaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Hirnmikroglia. Die Arbeit enthält auch das Mikroglia-Isolationsprotokoll, das für die Datenerhebung verwendet wurde.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Diese Methode beschreibt eine einfache und schnelle Strategie zur Charakterisierung und Untersuchung von Histon-Proteoformen.

Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Histonextraktion aus verschiedenen klinischen Proben für eine anschließende posttranslationale Modifikationsanalyse mittels LC-MS/MS. Durch die robuste Erkennung wichtiger Histonmodifikationen dient sie als wertvolles Werkzeug für umfassende epigenetische Profilierung in großen klinischen Kohorten.

Extraktion von Histonen aus klinischen Proben für epigenetische Profilierung mittels Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Lernen Sie die globale Quantifizierung posttranslationaler Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe. Diese Methode ermöglicht die umfassende Analyse chromatindynamischer Veränderungen mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie.

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Weitere Videos entdecken