Isolierung, Expansion und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem infrapatellaren Fettpolster des Ziegenwürgegelenks

Infrapatellare Fettpolster-abgeleitete mesenchymale Stammzellen, oder kurz IFP-MSCs, sind ein relativ wenig untersuchter Stammzelltyp. Dieses Protokoll ist eine einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode, die die Isolierung von IFP-MSCs aus dem Ziegenwürgegelenk demonstriert. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von hochwertigen IFP-MSCs erhalten werden kann.

Isolierte IFP-MSCs können sich in mehrere Linien differenzieren und besitzen ein umfangreiches regeneratives Potenzial. Aufgrund ihrer anatomischen Lage haben IFP-MSCs Interesse an der Reparatur von Knorpeldefekten und der Linderung des Knorpelabbaus bei Arthrose gewonnen. Die Methode hat Implikationen für die zellbasierte Therapie im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin.

Das Verfahren zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von IFP-MSCs wird von Dr. Sugata Hazra und Herrn Aman Mahajan demonstriert. Um mit der Isolierung von Infrapatellar Fat Pad Mesenchymal Stammzellen (IFP-MSCs) zu beginnen, werden Femorotibialgelenke von Ziegen, die etwa 15 Zentimeter der Femur- und Tibiaregionen der Hinterbeine umfassen, in einer sterilisierten Probenbox entnommen. Lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius für den Transport ins Labor zur weiteren Verarbeitung.

Legen Sie die Probe auf eine 150-Millimeter-Petrischale und stellen Sie sicher, dass die Probe während des gesamten Verfahrens aseptisch und in einer Biosicherheitswerkbank verarbeitet wird. Spülen Sie es gründlich mit autoklaviertem PBS, das mit Antibiotika ergänzt wird. Halten Sie die Probe mit PBS hydratisiert.

Untersuchen Sie sorgfältig die anatomischen Regionen der Probe. Um den Zugang zu erleichtern, entfernen Sie das zusätzliche Gewebe vollständig von den beiden langen Knochen, indem Sie die Endfläche des Oberschenkelknochens mit einer Hand halten und mit einer scharfen Schere in Längsrichtung zum Gelenk schneiden. Dann, ohne das die Gelenkkapsel umgebende Gewebe zu stören, entfernen Sie die Muskeln und das Fettgewebe aus dem Knochen.

Machen Sie einen weiteren Schnitt am Tibiaende der Probe und entfernen Sie die Muskeln und das Fettgewebe aus dem Tibiaknochen. Stellen Sie sicher, dass sowohl die langen Knochen vollständig freigelegt sind als auch die Gelenkkapsel sichtbar ist. Als nächstes machen Sie einen Schnitt von beiden Seiten der Synovialmembran, um das Gelenk aufzuschneiden.

Schneiden Sie die Kniescheibe von der Synovialmembran und den Patellabändern mit einer frischen, sterilisierten Schere und Pinzette ab. Legen Sie die abgetrennte Patella sofort in eine Petrischale, die PBS enthält. Entfernen Sie das gesamte Fettpolster auf der Innenseite mit Schere und Pinzette aus der abgetrennten Kniescheibe.

Sammeln Sie es in einer anderen frischen Petrischale und zerkleinern Sie es mit einem Skalpell. Fügen Sie andere chirurgische Instrumente hinzu, um die kleinen Fettsegmente von etwa zwei bis drei Millimetern zu erhalten. Übertragen Sie das Hackfleisch mit einem Spatel in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie es dreimal mit PBS, ergänzt mit Antibiotika, für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Reagenzglasmischer.

Für die enzymatische Verdauung inkubieren Sie etwa fünf Gramm des gehackten Gewebes in Dulbecco's Modified Eagle Media oder DMEM, einem Medium mit niedrigem Glukosegehalt, das 1,5 Milligramm pro Milliliter Typ-II-Kollagenase und 2% FBS bei 37 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden enthält. Saugen Sie das verdaute Gewebe vorsichtig ab und filtern Sie es durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um unverdaute Teile zu entfernen. Das Filtrat wird in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen fünf Minuten lang mit 150 mal g zentrifugiert.

Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet zweimal mit DMEM-Low-Glucose waschen. Suspendieren Sie das Pellet in vollständigem DMEM, auch bekannt als Expansionsmedium. Säen Sie die Zellen auf einer 150-Millimeter-Petrischale und kultivieren Sie sie in den Expansionsmedien, die mit fünf Nanogramm pro Milliliter Basic Fibroblast Growth Factor (BFGF) und 50 Mikrogramm pro Milliliter 2-Phospho-L-Ascorbinsäuretrinatriumsalz ergänzt werden.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator, damit die Zellen haften und sich vermehren können. Überwachen Sie täglich die Anheftung und das Wachstum der Zellen. Für eine ordnungsgemäße Wartung und Erweiterung der IFP-MSCs sollten die Medien alle drei Tage gewechselt werden.

Geben Sie beim Wechseln des Mediums frische fünf Nanogramm pro Milliliter BFGF und 50 Mikrogramm pro Millimeter 2-Phospho-L-ascorbinsäure-Trinatriumsalz direkt in die Petrischale. Sobald die Zellen zu 80% bis 90% konfluent sind, subkulturieren Sie sie, indem Sie das Expansionsmedium aus der Petrischale entfernen und die Zellen mit 1X PBS waschen. Dann geben Sie vier Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA in die Schale und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator.

Klopfen Sie nach vier Minuten auf die Seite der Platte, um die Zellen zu entfernen. Bestätigen Sie die vollständige Ablösung aller Zellen unter dem Mikroskop. Nach der Bestätigung fügen Sie ein gleiches Volumen an Expansionsmedien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.

Verwenden Sie eine Pipette, um diese dissoziierten Zellen in einem frischen 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen zu sammeln und zentrifugieren Sie sie bei 150 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in der gewünschten Menge des Expansionsmediums wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Zellzählmethode und subkulturieren Sie sie für die weitere Expansion bei einer Impfdichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter in einer 150-Milliliter-Petrischale.

Für alle Assays ist eine konfluente Monoschicht von Zellen der Passagen P2 bis P5 zu verwenden. Wenn die expandierten Zellen eine Konfluenzrate von 80 % bis 90 % erreichen, dissoziieren Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung, bevor Sie sie fünf Minuten lang in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei 150-mal g pelletieren. Dann resuspendieren Sie das Pellet im Ziegenplasma mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro 50 Mikroliter. Fügen Sie 50 Mikroliter Plasma, das die Zellen enthält, auf eine sterilisierte 90-Millimeter-Petrischale hinzu, gefolgt von der Zugabe von Calciumchlorid in einer Endkonzentration von 0,3%.

Nach der Inkubation des hergestellten Hydrogels bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten werden die Hydrogele auf 24-Well-Gewebekulturplatten übertragen, die chondrogene Medien enthalten. Wechseln Sie die Medien alle drei Tage für 14 Tage. Die Hydrogele, die in vollständigen DMEM-Medien ohne TGF-beta 1 kultiviert werden, gelten als nicht induzierte Kontrollen.

Nach 14 Tagen chondrogener Differenzierung von Zellen in Plasmahydrogel waschen Sie die Hydrogele dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten und fixieren Sie die Proben drei Stunden lang in neutralem gepuffertem Formalin. Isolierte IFP-MSCs waren homogen adhärent und erreichten innerhalb von 24 Stunden nach In-vitro-Kultur eine längliche Morphologie. Die Zellen vermehrten sich innerhalb von sechs Tagen nach der Expansion effizient um 80% bis 90% und zeigten eine klonogene Kapazität, was auf eine effiziente Proliferations- und Selbsterneuerungsfähigkeit hindeutet.

Bei der Behandlung zur Differenzierung in eine adipogene Linie produzierten die isolierten Zellen Lipidtröpfchen, was durch eine Ölrot-O-Färbung an den Tagen 14 und 21 bestätigt wurde. Solche Öltröpfchen waren in den Zellen ohne adipogene induzierende Faktoren nicht sichtbar. Die isolierten Zellen, die in Plasma-Hydrogel eingekapselt waren, zeigten die Bildung von weißem und glänzendem Neo-Gewebe nach 14 Tagen in der induzierten Gruppe, die das chondrogene Potenzial aufwies.

Die nicht induzierte Gruppe hatte blasses weißes Gewebe mit vermindertem Glanz. Darüber hinaus deutete eine positive histologische Färbung für Alcianblau und Safranin O in der induzierten Gruppe darauf hin, dass die Zellen sulfatierte Glykosaminoglykane, einen der Hauptbestandteile der Knorpelmatrix, sezernieren konnten. Im Gegensatz dazu waren die Hydrogel-Abschnitte aus den nicht induzierten Gruppen negativ für die Safranin-O- und Alcian-Blau-Färbung, was das chondrogene Differenzierungspotenzial der mesenchymalen Stammzellen nur in Gegenwart von chondrogenen Stimuli bestätigt.

Die isolierten Zellen, die mit osteogenen Medien induziert wurden, zeigten eine positive Färbung für alkalische Phosphatase, was die Mineralisierung nach 14 Tagen bestätigte. Nach 28 Tagen osteogener Induktion wurden die verkalkten Ablagerungen mit Alizarinrot-S-Färbung beobachtet. Die Ergebnisse unterstrichen das Differenzierungspotenzial induzierter Zellen in adipogene, chondrogene und osteogene Linien.

Es ist wichtig, die Probe unter aseptischen Bedingungen zu verarbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Es ist auch wichtig, die korrekte Position der Kniescheibe zu identifizieren. Dieses Verfahren eröffnet die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen wie Gelenkchondrozyten, Bandfibroblasten und Stammzellen aus Synovia und Synovialflüssigkeit zu isolieren, die breite Anwendungen in der regenerativen Medizin haben.

Nach der Isolierung von IFP-MSCs mit dieser Technik wurde ihre Wirksamkeit insbesondere für die Regeneration von Muskel-Skelett-Geweben wie Knorpel, Knochen und Band unter Verwendung von Gerüsten und gerüstfreien Ansätzen untersucht.