Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Digital Spatial Profiling, kurz DSP, bietet eine effiziente Methode zur räumlich geschichteten Proteinquantifizierung. Seine Implementierung ermöglicht es uns, die Proteinexpression über verschiedene Regionen eines Tumors und die Mikroumgebung hinweg zu charakterisieren. Ein wesentliches Merkmal von DSP ist seine Multiplexing-Fähigkeit, die eine Datenverarbeitung mit hohem Durchsatz ermöglicht.

Die Möglichkeit, benutzerdefinierte Regionen von Interesse zu definieren, bietet der Datenanalyse zusätzlich eine räumliche Dimension. DSP kann auf jede Probe angewendet werden, in der die räumliche Quantifizierung von Protein- oder RNA-Expression helfen kann, einen pathologischen oder physiologischen Prozess aufzuklären. Dies ist besonders relevant in der Onkologie, wo die regionale Zielvariabilität mit malignem Wachstum oder Invasion korrelieren kann.

Das Verfahren wird von Scott Palisoul, einem Histotechnologen, und Rachael Barney, einer genomischen Technologin, demonstriert. Um Objektträger vorzubereiten, nehmen Sie zunächst mehrere Zwei-Millimeter-Kerne aus jeder Biopsie und legen sie in einen einzelnen Gewebe-Microarray-Block. Schneiden Sie vier Mikrometer Abschnitte aus dem Block und montieren Sie sie auf Glasobjektträgern.

Legen Sie jeden Objektträger in die Schlittenhalterdichtung und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Im halbautomatischen IHC-System den Behälter in Position eins mit 150 Mikrolitern Waschpuffer pro Objektträger plus fünf Milliliter Totvolumen befüllen und den Deckel offen lassen. Füllen Sie die gleiche Menge der Blockierlösung in den Behälter an Position zwei.

Legen Sie den Reagenzienbehälterträger auf die Maschine. Wählen Sie im Dropdownfeld des Felds Marker die Option IHC verarbeiten aus, gefolgt von dem Namen der Lösung blockieren. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie für alle Folien auf Schließen.

Klicken Sie dann auf Etiketten drucken, aktivieren Sie Alle noch nicht gedruckten Folienetiketten und klicken Sie auf Drucken. Kleben Sie Beschriftungen oben auf den Folien. Legen Sie die Objektträger auf das Objektträgerfach und stellen Sie sicher, dass die Proben- und Etikettenseite nach oben gerichtet ist.

Drücken Sie die LED-Taste, um das Fach abzusenken, und lassen Sie das Gerät mit dem Scannen und Erkennen von Dias beginnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um das Experiment zu starten. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, drücken Sie die LED-Taste, wenn sie grün blinkt.

Entfernen Sie das Fach aus dem Instrument, und heben Sie die Abdeckplatten vorsichtig von jedem Objektträger ab. Legen Sie die Objektträger in die 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Entfernen Sie überschüssigen Puffer und umreißen Sie jeden Gewebeabschnitt mit einem hydrophoben Stift, um eine hydrophobe Barriere zu schaffen.

Stellen Sie eine Antikörper-PC-Oligo-Lösung her, indem Sie acht Mikroliter jedes Antikörpers pro Objektträger hinzufügen und Buffer W verwenden, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Dann die Antikörper-PC-Oligo-Lösung auf die Objektträger auftragen und die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Schale und waschen Sie sie dreimal für 10 Minuten in 1X TBST.

Nachfixieren in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zweimaligem Waschen für fünf Minuten in 1X TBST. Fügen Sie SYTO 13 Kernfärbung für 15 Minuten bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 1X TBST. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Datenerfassung im Kontrollzentrum, und wählen Sie Neu oder Ausführen fortsetzen.

Legen Sie das Dia in den Diahalter mit dem Etikett in Richtung des Benutzers. Senken Sie die Klemme des Objektträgerfachs ab, um sicherzustellen, dass das Gewebe im länglichen Fenster sichtbar ist. Fügen Sie sechs Milliliter Puffer S hinzu.Folgen Sie den Anweisungen im Control Center.

Zoomen Sie mit den x- und y-Schiebereglern zwischen verschiedenen Achsen, um einen Bereich zum Scannen abzugrenzen. Wählen Sie Scannen und lassen Sie den Scan fortfahren, bis der gesamte definierte Zielbereich abgebildet wurde. Erzeugen Sie ein 20-faches Bild.

Definieren Sie die ROIs, indem Sie drei gleich große kreisförmige ROIs mit einem Durchmesser von 250 Mikrometern für jeden Gewebekern auswählen. Genehmigen Sie die ROIs, indem Sie auf die Schaltfläche Scan-Arbeitsbereich beenden klicken. Warten Sie dann, bis das UV-Licht die Oligos von den Antikörpern trennt.

Wählen Sie nach Abschluss des Reinigungsgerätevorgangs Neue Datensammlung aus, um mit den aktuellen Objektträgern oder der aktuellen Platte fortzufahren. Öffnen Sie das fertige Plattenfenster, indem Sie auf den Plattensymbolbereich doppelklicken. Geben Sie die Chargennummer des Hybridisierungscodepakets ein und klicken Sie auf Aktualisieren.

Klicken Sie dann auf Abschließen. Trennen Sie den Diahalter und die Sammelplatte, indem Sie den Anweisungen folgen. Bewahren Sie die Objektträger in TBST auf oder decken Sie sie mit einem wässrigen Medium und einem Deckbeleg für die Langzeitlagerung ab.

Versiegeln Sie die Platten mit einer durchlässigen Dichtung und trocknen Sie die Aspirate bei 65 Grad Celsius in einem Thermocycler mit geöffnetem Oberteil. Fügen Sie sieben Mikroliter mit Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser hinzu und mischen Sie. Bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren und dann schnell herunterdrehen.

Bereiten Sie die Sondenpuffermischung vor, indem Sie die entsprechenden Gleichungen für die Sonde R und die Sonde U auswählen, wobei die Gleichung wie im Textprotokoll beschrieben angewendet wird. Fügen Sie jedem Hybridisierungscodepaket 84 Mikroliter Sondenpuffermischung hinzu. In einer frischen 96-Well-Hybridisierungsplatte fügen Sie acht Mikroliter jeder Hybridisierungscode-Mastermischung in alle 12 Vertiefungen der angegebenen Reihe hinzu.

Sieben Mikroliter von der DSP-Sammelplatte in die entsprechende Vertiefung in der Hybridisierungsplatte überführen. Heißsiegeln, die Platte schleudern und über Nacht bei 67 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Platte auf Eis abkühlen lassen und eine schnelle Drehung durchführen.

Bündeln Sie die Hybridisierungsprodukte aus jedem Bohrloch in einem Streifenrohr und pipettieren Sie jedes Loch vorsichtig fünfmal. Drehen Sie die Bandrohre herunter und laden Sie sie in das Analysesystem. Speichern Sie die CDF-Datei auf dem DSP-Gerät auf einem USB-Laufwerk und übertragen Sie die Daten an den digitalen Analysator.

Drücken Sie auf dem Bildschirm auf Verarbeitung starten. Wählen Sie High Sensitivity (Hohe Empfindlichkeit) und dann Next (Weiter). Klicken Sie auf Alle auswählen, um die Anzahl der Bohrlöcher mit Proben anzuzeigen, dann auf Fertig stellen, gefolgt von Weiter in der E-Mail-Benachrichtigung.

Klicken Sie dann auf Start. Sobald die Vorbereitungsstation fertig ist, versiegeln Sie die Kartusche und übertragen Sie sie auf den digitalen Analysator. Drücken Sie Zählen starten.

Wählen Sie Bühnenposition. Klicken Sie auf Vorhandene CDF-Datei laden und wählen Sie die zuvor hochgeladene Datei aus. Drücken Sie Fertig.

Wählen Sie erneut Bühnenposition, drücken Sie Fertig, und starten Sie dann, um das Programm auszuführen. Speichern Sie die ZIP-Datei der Reporterzählerkonvertierungsdateien aus dem Analysesystem auf einem USB-Laufwerk. Setzen Sie das Laufwerk in den DSP-Computer ein.

Bewegen Sie den Mauszeiger im DSP-Kontrollzentrum über Datenerfassung und klicken Sie dann auf Konten hochladen. Wählen Sie die entsprechende ZIP-Datei aus. Klicken Sie im DSP Control Center auf Records.

Um Scans in der Warteschlange anzuzeigen, wählen Sie Ausgewählte Scans zur Warteschlange hinzufügen und dann Meine Analysewarteschlange. Wählen Sie Neue Studie aus Warteschlange aus, indem Sie den Mauszeiger über die Option Datenanalyse im Kontrollzentrum bewegen. Das DSP-Experiment wurde an Proben von Glioblastomen durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Heatmap visualisiert.

Zeilen stellen Proteinziele dar, und jede Spalte entspricht einer Region von Interesse. Die Ausdrucksebene wird durch einen Farbbereich dargestellt, der von Blau mit niedrigem Ausdruck bis Rot variiert, was einen hohen Ausdruck bedeutet. Die Variabilität der Farbe innerhalb einer Reihe spiegelt die regionale Proteinheterogenität wider und deutet auf eine mögliche räumliche Assoziation mit differentieller Proteinexpression hin.

In diesem Experiment waren S100 und CD-56 universell hoch, weil sie neuronale Marker sind. Zu den Markern mit der größten Variabilität gehören B7-H3, KI-67, CD-44 und Fibronektin, von denen bekannt ist, dass sie mit Tumorproliferation, Migration und Metastasierung assoziiert sind. Aus einer Vielzahl von Kandidatenzielen kann DSP diejenigen identifizieren, die signifikante regionale Unterschiede aufweisen.

Dies legt die Grundlage für die Untersuchung von Faktoren, die mit Variabilität und ihrer Relevanz für Krankheiten verbunden sind.