Name: Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering. Diese Methode ermöglicht die neuronale Differenzierung von Stammzellen für klinische Anwendungen.

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Das in dieser Studie verwendete Graphen wurde an der Kirklareli University, Fakultät für Maschinenbau, entwickelt. Es wurde von Dr. Karabeyoğlu gespendet. Finanziert wurde der Graphen-Toxizitätstest durch das Projekt "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Antrags-Nr.: 1139B411802273), das im Rahmen des TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program durchgeführt wurde. Der andere Teil der Studie wurde durch den Forschungsfonds der Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713) unterstützt. Mesenchymale Stammzellen mit GFP, die in der Zeitraffer-Bildgebung verwendet wurden, wurden von Virostem Biotechnology gespendet. Die Autoren danken dem Darıcı LAB und dem YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB Team für die produktiven Diskussionen.

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<li>Pathre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTP1B+regulates+neurite+extension+mediated+by+cell-cell+and+cell-matrix+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules.</a> Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).</li>
<li>Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+their+microRNA+cargo%3A+New+players+in+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabilitation+and+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration.</a> Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Das Projekt wurde in Zusammenarbeit mit HD Bioink, dem Entwickler der 3D-Bioprinting-Technologie, durchgeführt.

Die Vorteile von Behandlungen, die mit technischen 3D-Gerüsten gegenüber herkömmlichen 2D-Methoden angewendet werden, werden von Tag zu Tag deutlicher. Stammzellen, die allein in diesen Therapien oder zusammen mit Gerüsten aus verschiedenen Biomaterialien mit geringer Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden, sind in der Regel unzureichend für die periphere Nervenregeneration. Die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs) scheinen eine geeignete Kandidatenzelllinie zu sein, insbeson...

Das Nervensystem, der Mechanismus, der die innere Struktur des Organismus und die Umwelt verbindet, ist in zwei Teile unterteilt: das zentrale und das periphere Nervensystem. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das 1,5 % bis 5 % der Patienten ausmacht, die sich in der Notaufnahme vorstellen und sich aufgrund verschiedener Traumata entwickeln, was zu einem erheblichen Verlust des Arbeitsplatzes führt 1,2,3.
Heute sind zelluläre Ansätze des peripheren Neuro-Engineerings von großem Interesse. Stammzellen stehen bei diesen Ansätzen an erster Stelle. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Diese Zellen sind spezialisiert, können sich aber bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren 4,5. Nach der Stammzellhypothese steht das Stammzellsystem unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Die Konservierung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne das Vorhandensein ihrer Mikroumgebung6 nicht möglich, die durch Tissue Engineering mit Hilfe von Zellen und Scaffolds7 rekonstituiert werden kann. Tissue Engineering ist ein multidisziplinäres Gebiet, das sowohl ingenieurwissenschaftliche als auch biologische Prinzipien umfasst. Tissue Engineering bietet Werkzeuge für die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann und bei der Regeneration dieses Gewebes verwendet werden kann, indem das beschädigte Gewebe entfernt und funktionsfähiges Gewebe bereitgestellt wird8. Gewebegerüste, einer der drei Eckpfeiler des Tissue Engineering, werden mit unterschiedlichen Methoden aus natürlichen und synthetischen Materialien hergestellt9. Der dreidimensionale (3D) Druck ist eine aufstrebende additive Fertigungstechnologie, die häufig eingesetzt wird, um defektes Gewebe durch die einfache, aber vielseitige Herstellung komplexer Formen mit verschiedenen Methoden zu ersetzen oder wiederherzustellen. Bioprinting ist ein additives Fertigungsverfahren, das die Koexistenz von Zellen und Biomaterialien ermöglicht, sogenannte Biotinten10. Unter Berücksichtigung der Interaktion von Nervenzellen untereinander haben sich die Studien auf leitfähige Biomaterialkandidaten wie Graphen verlagert. Graphen-Nanoplatten, die Eigenschaften wie flexible Elektronik, Superkondensatoren, Batterien, Optiken, elektrochemische Sensoren und Energiespeicherung aufweisen, sind ein bevorzugtes Biomaterial im Bereich des Tissue Engineering11. Graphen wurde in Studien verwendet, in denen die Proliferation und Regeneration von geschädigten Geweben und Organen durchgeführt wurde12,13.
Tissue Engineering besteht aus drei Grundbausteinen: Gerüst, Zellen und Biosignalmoleküle. Es gibt Defizite in den Studien zur peripheren Nervenschädigung in Bezug auf die vollständige Bereitstellung dieser drei Strukturen. Bei den in den Studien hergestellten und verwendeten Biomaterialien sind verschiedene Probleme aufgetreten, wie z. B. dass sie nur Stammzellen oder Biosignalmoleküle enthalten, das Fehlen eines bioaktiven Moleküls, das die Differenzierung von Stammzellen ermöglicht, die mangelnde Biokompatibilität des verwendeten Biomaterials und die geringe Auswirkung auf die Proliferation von Zellen in der Gewebenische. und somit wird die Nervenleitung nicht vollständig realisiert 2,13,14,15,16. Dies erfordert die Optimierung der Nervenregeneration, die Verringerung des Muskelschwunds 17,18 und die Schaffung der notwendigen Zielsuche19 mit Wachstumsfaktoren gegen solche Probleme. An dieser Stelle ist die Charakterisierung und Analyse der Neuroaktivität eines chirurgischen Biomaterial-Prototyps, der in die Klinik übertragen werden soll, sehr wichtig.
Dementsprechend untersucht diese Methodenstudie die Biotinten-Hydrogel-Strukturierung mit Graphen-Nanoplatten, die von einem 3D-Biodrucker gebildet werden, und ihre Wirksamkeit auf die neurogene Differenzierung der darin enthaltenen Stammzellen. Außerdem werden die Auswirkungen von Graphen auf die Bildung und Differenzierung von Neurosphären untersucht.

<table><tbody><tr><td> Zentrifugal</td><td>Hitachi</td><td></td><td>Wird in Zellkulturen und Biomaterialien Schritt</td></tr><tr><td>0,1N CaCl2</td><td>HD Bioink</td><td></td><td>verwendet für Vernetzer</td></tr><tr><td>0,22 &; Mikro; m Membranfilter</td><td>A&iota; s&iota; mo</td><td></td><td>Wird für die Sterilisation</td></tr><tr><td>0,45 & Mikro verwendet; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>A&iota; s&iota; mo</td><td></td><td>Wird für die Sterilisation</td></tr><tr><td>verwendet 1,5 ml konisches Röhrchen</td><td>Eppendorfa</td><td></td><td>Wird für Biotintentropfen</td></tr><tr><td>verwendet 15 ml Falcon Röhrchen</td><td>Nest</td><td></td><td>Wird in Zellkulturschritten</td></tr><tr><td>verwendet 25 cm2 Zellkulturflaschen (Falcon, TPP Gewebekulturkolben</td><td>Nest</td><td></td><td>Wird für Zellkulturen</td></tr><tr><td>verwendet 3D Bioprinting</td><td>Axolotl Biosystems Bio A2 (Türkei)</td><td></td><td>Bioprinting Schritt</td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Nest</td><td></td><td>Wird in Zellkultur-Step-6</td></tr><tr><td>/24/48/96-Well-Platten verwendet (Falcon, TPP-Mikrotiterplatten)</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Wird in Zellkultur-Steps</td></tr><tr><td>75 cm2 Zellkulturflaschen verwendet (Falcon, TPP-Gewebekulturflaschen</td><td>Nest</td><td></td><td>Wird für Zellkulturen</td></tr><tr><td>verwendet Anti-Maus-IgG-FTIC-Kaninchen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>J1514</td><td>Seconder-Antikörper, wird für Farbstoffe verwendet</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG-SC2781-Ziege</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>C3109</td><td>Seconder-Antikörper, verwendet für</td></tr><tr><td>Farbstoff-Au-Beschichtungsgerät EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td>für die Vergoldung von Biomaterialschnitt vor der REM-Bildgebung</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>Wird für den Sterilisationsprozess verwendet.</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>NUVE-OT 90L</td><td></td><td>Wird für den Sterilisationsprozess verwendet.</td></tr><tr><td>Cell Cultre Cabine</td><td>Hera Safe KS</td><td></td><td>Wird für den Zellkulturprozess</td></tr><tr><td>verwendet Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12</td><td>Sigma</td><td>RNBJ7249</td><td>Wird als Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>verwendet FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM</td><td>Quanta FEG</td><td>450</td><td>für SEM</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-FBS</td><td>Capricorn</td><td>FBS-16A</td><td>Es wurde durch Zugabe zum Zellkulturmedium verwendet.</td></tr><tr><td>Gefrierschrank -80°; C</td><td>Panasonic</td><td>MDF-U5386S-PE</td><td>Wir wurden zur Lagerung von Zellen und den daraus resultierenden Exosomen verwendet</td></tr><tr><td>Gelatine-Alginat-Biotintenpulver</td><td>HD Bioink</td><td></td><td>Wird für die Herstellung von Biotinte verwendet</td></tr><tr><td>Schritt GFP markiert-WJ-MSCs</td><td>Virostem</td><td></td><td>Wird für die Bildgebung der Zell-Biotinte-Wechselwirkung verwendet</td></tr><tr><td>Graphen-Nanoplättchen (Graphen-IGP2)</td><td>Grafen Chemical Industries Co.</td><td></td><td>Wird für die Herstellung von 3D-G-Biotinte</td></tr> verwendet <tr><td>Immunfluoreszenz-Antikörper (N-CAD; &beta;-III Tubulin)</td><td>Zellsignalisierung und Santa Cruz</td><td></td><td>Wird für den Farbstoff</td></tr><tr><td>JASCO 6600</td><td>Tetra</td><td></td><td>für FTIR</td></tr><tr><td>MTT Assay</td><td>verwendet Sigma</td><td></td><td>Viabilitätstests</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin Lösung</td><td>Capricorn</td><td>PB-S</td><td>Es wurde dem Medium zugesetzt, um eine Kontamination zu verhindern in Zellkultur.</td></tr><tr><td>Thoma Objektträger</td><td>Isolab</td><td></td><td>Wird zur Zählung der Zelle</td></tr><tr><td>verwendet Zeitraffer-Bildgebungssystem</td><td>Zeiss Axio.Observer.Z1</td><td></td><td>Bildgebung</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Multicell</td><td></td><td>Der Kolben wurde verwendet, um die Zellen zu entfernen, die die Oberfläche bedecken.</td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>Biobase</td><td></td><td>Für die Herstellung von Biotinte</td></tr><tr><td>Schritt WJ-MSCs</td><td>ATCC</td><td></td><td>Wird für den Zellkulturprozess verwendet</td></tr></tbody></table>

herstellung und charakterisierung von graphen-basierter 3d-biohybrid-hydrogel-biotinte für das periphere neuroengineering

Preparation and Characterization of Graphene-Based 3D Biohybrid Hydrogel Bioink for Peripheral Neuroengineering

Periphere Neuropathien können als Folge einer axonalen Schädigung und gelegentlich aufgrund von demyelinisierenden Erkrankungen auftreten. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das bei 1,5 % bis 5 % der Notfallpatienten auftritt und zu erheblichen Arbeitsplatzverlusten führen kann. Heute sind auf Tissue Engineering basierende Ansätze, die aus Gerüsten, geeigneten Zelllinien und Biosignalen bestehen, mit der Entwicklung dreidimensionaler (3D) Bioprinting-Technologien anwendbarer geworden. Die Kombination verschiedener Hydrogel-Biomaterialien mit Stammzellen, Exosomen oder Biosignalmolekülen wird häufig untersucht, um die bestehenden Probleme bei der peripheren Nervenregeneration zu überwinden. Dementsprechend hat die Herstellung von injizierbaren Systemen, wie z.B. Hydrogelen, oder implantierbaren Conduit-Strukturen, die durch verschiedene Bioprinting-Methoden gebildet werden, im peripheren Neuro-Engineering an Bedeutung gewonnen. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Dabei handelt es sich nicht um spezialisierte Zellen, sondern sie können sich bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren. Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Bei peripheren Nervenverletzungen, insbesondere bei Neurotmesis, kann dieses Mikromilieu auch nach chirurgischer Bindung durchtrennter Nervenenden nicht vollständig gerettet werden. Der Ansatz von Verbundbiomaterialien und kombinierten zellulären Therapien erhöht die Funktionalität und Anwendbarkeit von Materialien in Bezug auf verschiedene Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Verarbeitbarkeit. Dementsprechend zielt diese Studie darauf ab, die Herstellung und Verwendung von Graphen-basiertem biohybridem Hydrogel-Patterning zu demonstrieren und die Differenzierungseffizienz von Stammzellen zu Nervenzellen zu untersuchen, was eine effektive Lösung bei der Nervenregeneration sein kann.

Graphen-Toxizität und 2D-Bildgebung Die statistische Analyse der erhaltenen MTT-Ergebnisse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test in einer statistischen Analysesoftware durchgeführt, und die erhaltene Grafik ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graphenanteil im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte nur für die Graphenkonzentration von 0,001 % (**p &lt; 0,01) eine signifikante Abnahme. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gru...

In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

Peripheral neuropathies can occur as a result of axonal damage, and occasionally due to demyelinating diseases. Peripheral nerve damage is a global ...

Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner wichtigen Bestandteile. Die Erhaltung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne die Anwesenheit ihrer Mikroumgebung undenkbar. Diese Mikroumgebung, die als Stammzellnische bezeichnet wird, besteht aus Zellen und Gerüsten.Periphere Neuropathie kann sein, und gelegentlich können sie wie eine Verletzung des Brachii-Plexus, verschiedene Traumata, Tumore, autonome Anomalien, Immundefinition und Stoffwechselerkrankungen auftreten. Es wurden verschiedene 3D-Kulturmethoden entwickelt, um eine bessere und natürlichere Nische für die Stammzellen zu schaffen. Sphäroidbildung und 3D-Bioprinting sind relativ neue und vielversprechende Methoden für 3D-Kulturen.Der 3D-Biodruck kann auch in neurotechnischen Studien eingesetzt werden. Folglich wurden im Rahmen dieser Studie Graphen- und Alginat/Gelatine-basierte Biotinten entwickelt und auf ihre regenerativen Eigenschaften hin untersucht. Kultivieren Sie zunächst mesenchymale Stammzellen oder WJMSCs von Wharton's Jelly in DMEM F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum oder FBS, 1 % Pen/Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, unter einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur.Wenn die kult

preparation-characterization-graphene-based-3d-biohybrid-hydrogel

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Video zeigt den Prozess der Erstellung eines 3D-biogedruckten Konstrukts mit Astrozyten, die in einer Bioink-Lösung suspendiert sind. Das biogedruckte Konstrukt erleichtert nach der Vernetzung die Adhäsion und Ausbreitung der Astrozyten, wodurch neuralähnliches Gewebe gebildet wird.

Eine Methode zum 3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation von verkapselten Zellen zu verhindern.

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Dieser Artikel beschreibt Protokolle für die Herstellung von Gelatine-Methacryloyl-Mikrogelen mit hohem Durchsatz unter Verwendung mikrofluidischer Geräte, die Umwandlung von Mikrogelen in resuspendierbares Pulver (Mikroaerogele), die chemische Anordnung von Mikrogelen zu körnigen Hydrogelgerüsten und die Entwicklung von körnigen Hydrogel-Biotinten mit erhaltener Mikroporosität für den 3D-Biodruck.

Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.

Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Herstellung von 3D-biogedruckten Kokulturen von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten vor. Dieses Kokulturmodell, das in einem Hydrogel-Gerüst im 96- oder 384-Well-Format erzeugt wurde, zeigt eine hohe Post-Print-Viabilität und ein Neuritenwachstum innerhalb von 7 Tagen und zeigt die Expression von Reifemarkern für beide Zelltypen.

Dreidimensionales Bioprinting von humanen iPSC-abgeleiteten Neuron-Astrozyten-Kokulturen für Screening-Anwendungen

In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Erfahren Sie die Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering. Diese Methode ermöglicht die neuronale Differenzierung von Stammzellen für klinische Anwendungen.

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

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