Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner wichtigen Bestandteile. Die Erhaltung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne die Anwesenheit ihrer Mikroumgebung undenkbar. Diese Mikroumgebung, die als Stammzellnische bezeichnet wird, besteht aus Zellen und Gerüsten.

Periphere Neuropathie kann sein, und gelegentlich können sie wie eine Verletzung des Brachii-Plexus, verschiedene Traumata, Tumore, autonome Anomalien, Immundefinition und Stoffwechselerkrankungen auftreten. Es wurden verschiedene 3D-Kulturmethoden entwickelt, um eine bessere und natürlichere Nische für die Stammzellen zu schaffen. Sphäroidbildung und 3D-Bioprinting sind relativ neue und vielversprechende Methoden für 3D-Kulturen.

Der 3D-Biodruck kann auch in neurotechnischen Studien eingesetzt werden. Folglich wurden im Rahmen dieser Studie Graphen- und Alginat/Gelatine-basierte Biotinten entwickelt und auf ihre regenerativen Eigenschaften hin untersucht. Kultivieren Sie zunächst mesenchymale Stammzellen oder WJMSCs von Wharton's Jelly in DMEM F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum oder FBS, 1 % Pen/Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, unter einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur.

Wenn die kultivierten Zellen im Kolben zu 80 % konfluent sind, gießen Sie das Medium ein und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS. Dann fünf Milliliter 0,25%iges Trypsin und 2,21 millimolare Natrium-EDTA zugeben und bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie nach fünf Minuten 10 Milliliter DMEM F12 Medium mit 10 % FBS in die Zellen.

Suspendieren Sie die Zellen, sammeln Sie das Medium und füllen Sie es in ein Zentrifugenröhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen den Überstand, bevor Sie die Zellen in einem neuen Kolben mit einem frischen Nährmedium mit 10 % FBS neu aussäen. Um die Biotinte der Kontrollgruppe ohne Graphen herzustellen, wiegen Sie 4,5 Milligramm Alginat und 1,5 Milligramm Gelatine ab und überführen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie dann 50 Milliliter DMEM F12 Medium mit 10 % FBS in das Röhrchen. Wiegen Sie erneut 4,5 Milligramm Alginat und 1,5 Milligramm Gelatine ab und geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 50 Mikroliter 0,1%Graphen in das Röhrchen und machen Sie das Volumen auf 50 Milliliter mit DMEM F12 Medium mit 10%FBS.

Mischen Sie die Biotinten durch Pipettieren und Vortexen, bevor Sie sie bei 121 Grad Celsius unter 1,5 Grad autoklavieren. atmosphärischen Druck für 20 Minuten. Zentrifugieren Sie die Lösung nach dem Autoklavieren, um gebildete Blasen zu entfernen, und platzieren Sie die Biotinten bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen vorbereitet sind.

Erstellen Sie für die Interaktion mit der Zell-Biotinte die Biotintengruppen. Gruppe eins umfasst 3D-B und 3D-G, die mit Biotinte für das Bioprinting gedruckt wurden. Gruppe zwei umfasst 3D-BS- und 3D-GS-Biotinten, auf denen nach dem Bioprinting Sphäroide gebildet wurden.

Zählen Sie für Gruppe eins die Zellen auf eins mal 10 bis zur siebten Zelle in 0,5 Milliliter Medium. Fügen Sie dann 4,5 Milliliter Biotinte hinzu. Übertragen Sie die Mischung mit Spritzen in die Kartuschen im sterilen Schrank.

Setzen Sie die Kartuschen in den entsprechenden Extruderabschnitt des Bioprinters ein. Für die zweite Gruppe entnehmen Sie fünf Milliliter Biotinte aus jeder der Biotintengruppen und überführen sie mit Hilfe eines Injektors in sterile Kartuschen. Nutzen Sie den Bioprinter mit zwei koaxialen Druckköpfen und der pneumatisch angetriebenen Extrusionstechnologie.

Stellen Sie die XYZ-Auflösung pro Mikroschritt auf 1,25 Mikrometer, die Extrusionsbreite auf 400 Mikrometer und die Extrusionshöhe auf 200 Mikrometer ein. Verwenden Sie ein Raster von 20 x 20 x 5 Millimetern, um 3D-Modelle zu erstellen. Erstellen Sie 3D-Modelle mit webbasierten Open-Source-CAD-Programmen.

Stellen Sie für den 3D-Bioprinting-Prozess den durchschnittlichen Druck des Druckers auf 7,5 psi ein. Stellen Sie dann die Patronen- und Betttemperatur auf 37 Grad Celsius und die Geschwindigkeit auf 60 % einBringen Sie das System während der Schreibphase in die Ausgangsposition. Positionieren Sie die Achsen automatisch und wählen Sie den Extruder aus und stellen Sie ihn ein, bevor Sie den Bioprinting-Prozess starten.

Nehmen Sie die Probe nach dem Druck heraus und legen Sie sie unter eine Laminar-Flow-Kabine. Als nächstes sprühen Sie die Biotinten mit 0,1 normaler Calciumchloridlösung oder fügen Sie einen Milliliter Lösung mit einer Pipette bei Raumtemperatur hinzu und warten Sie 10 bis 20 Sekunden. Waschen Sie dann die gedruckten Muster zweimal mit PBS, das Kalzium und Magnesium enthält.

Auf jede Zelle, die die Biotintengruppe enthält, werden zwei Milliliter DMEM F12 Medium mit 10 % FBS gegeben und die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid 30 Minuten lang inkubiert. Als nächstes fügen Sie jeder Gruppe zwei Milliliter Suspensionsmedium hinzu, das eine bis 10 bis sechste Zellen enthält, und inkubieren Sie die Platten. Beobachten und fotografieren Sie nach 24 Stunden alle Chargen von Biotinte für die Sphäroidbildung unter einem inversen Mikroskop für die Differenzierung von WJMSCs zu neuronenähnlichen Zellen mit Ausnahme der Kontrollgruppe.

Fügen Sie zwei Milliliter neurogenes Differenzierungsmedium pro Vertiefung hinzu und erneuern Sie es alle zwei Tage. Sieben Tage lang beobachten, um die neuronale Differenzierung zu beobachten. Untersuchen Sie anschließend mithilfe von Zeitrafferaufnahmen die Auswirkungen von Graphen auf Stammzellen und überwachen Sie die Zellinteraktionen innerhalb der Biotinte.

Der Einfluss der Graphenkonzentration auf die Zellproliferation wird hier demonstriert. Im Vergleich zur Kontrolle wurde eine signifikante Abnahme der Graphenkonzentration von 0,001 % beobachtet. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gruppen und der Kontrolle.

Die Zell-Graphen-Interaktionen zeigten, dass Graphen im 2D-System toleriert wurde und von den Zellen durch Endozytose aufgenommen wurde. Zeitrafferaufnahmen zeigten, dass Zellen, die im 3D-Graphenmedium überlebten, ihre Vitalität durch GFP-Helligkeit bis zum Ende der Inkubation beibehielten. REM-Bilder und FIIR-Analysen der 3D-B- und 3D-G-Biotintengruppen werden hier gezeigt.

Interaktionen mit Biotintenzellen wurden sowohl an der Oberfläche als auch im Inneren demonstriert. Die Zellen waren morphologisch rund und mit dem Material verbunden. Bei der neuronalen 3D-Differenzierung wurde angenommen, dass die Grenzen der Sphäroidzellen in beiden Gruppen transparent und lebendig waren und die Sphäroide in der Graphengruppe relativ größer waren und das Graphen in der Zelle einfingen.

Die Immunfärbung von 2D- und 3D-Zellen wird hier gezeigt. Die grünen Bilder stellen neuronenähnliche Strukturen dar. Die 2D-Positivkontrollprobe exprimierte weniger neuronenähnliche Strukturmarker als die 3D-Proben.

Wir entdeckten, dass Graphen-basierte Biotinten erfolgreicher in Bezug auf die Differenzierung von Stammzellen in neuronenähnliche Zellen waren. Wir schlagen vor, dass Graphen-basierte Biotinten in weiteren Studien hervorragende Werkzeuge für die Behandlung peripherer Nervenerkrankungen sein würden. Heute kann das Stammzellsystem durch Tissue Engineering mit natürlichen und synthetischen Biomaterialien hergestellt werden. Die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann, das zur Regeneration dieser Gewebe, zur Beseitigung des Schadens und zur Bereitstellung von Funktion verwendet werden kann, wird durch Tissue Engineering bereitgestellt.