Formulierung und Charakterisierung eines Exosom-basierten Dopaminträgersystems

Exosomen können auf Vesikel reagieren, die von einer Zelle zwischen 14 und 200 Nanometern Größe abgesondert werden und sich in der intrazellulären Fracht und Kommunikation abspalten, die zur kleinsten Untergruppe der extrazellulären Vesikel führt. Exosomen, die durch die Differenzierung des Endosoms entstehen, stammen von der Zellmembran. Die Stammzellen können aus verschiedenen Quellen wie Knochenmark oder Fettgewebe isoliert werden.

Getrocknete Stammzellen aus adultem Gewebe haben jedoch ein höheres immunogenes Potenzial Durch die Größe von Exosomen wird gesagt, dass es eine wichtige Rolle bei Erkrankungen des Zentralnervensystems spielt, da es die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann. Waschen Sie zunächst die mesenchymalen Wharton-Jelly-Stammzellen mit fünf Millilitern PBS. Geben Sie dann fünf Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, bevor Sie den Kolben in einen Inkubator stellen.

Nach der Inkubation werden die Zellen gesammelt und fünf Minuten lang bei 1,500 g zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand und geben Sie einen Milliliter DMEM-F12 mit 10 % FBS in das Röhrchen. Waschen Sie kultivierte Zellen mit PBS.

Geben Sie nach dem Waschen serumfreies DMEM-F12-Medium zu den Zellen und legen Sie es in den Inkubator. Um die Exosomen zu isolieren, sammeln Sie das serumfreie Medium und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius. Überführen Sie den Überstand in ein anderes Röhrchen und verarbeiten Sie ihn durch serielle Zentrifugation mit höheren Geschwindigkeiten.

Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand langsam entfernt und das Pellet in einem Milliliter PBS aufgelöst. Durch Vortexen mischen und mit der Ultrazentrifugation bei 110.000 G für 70 Minuten bei vier Grad Celsius fortfahren. Fügen Sie drei Milliliter PBS zu der zuvor durch Ultrazentrifugation gesammelten Exosomensuspension hinzu und sterilisieren Sie die verdünnte Suspension durch Filtration mit einem 0,22-Mikron-Filter.

Anschließend werden 500 Mikroliter der sterilisierten Exosomensuspension in ein anderes Röhrchen überführt. Als nächstes werden nacheinander 500 Mikroliter 0,5 Milligramm pro Milliliter Dopaminlösung und Saponin in die sterilisierte Suspension gegeben. Nach der Inkubation wird die Suspension ultrazentrifugiert.

Die Probe kann entweder für die NTA- und DLS-Analyse zur Charakterisierung von Dopamin-beladenen Exosomen verwendet oder bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. In der NTA-Analyse wurde die durchschnittliche Größe der aus Wharton-Gelee gewonnenen Exosomen auf 98 Nanometer und die von Dopamin beladenen Exosomen auf 110 Nanometer bestimmt. Die Anzahl der Nanopartikel, die durch NTA- und DLS-Analysen ermittelt wurden, stimmte überein.

Das Zetapotential von Wharton-Jelly-abgeleiteten Exosomen wurde mit minus 15,7 und Dopamin-beladenen Exosomen mit minus 17,6 Millivolt gemessen. Die HPLC-Analyse der Dopamin-beladenen Exosomen detektierte den Peak für Dopamin nach 6,45 Minuten. Das kumulative Wirkstofffreisetzungsprofil zeigte, dass 74,8 % des eingekapselten Dopamins innerhalb der ersten acht Stunden aus den Exosomen freigesetzt wurden.

Die Zytotoxizität der Dopamin-beladenen und freien Exosomen auf Fibroblasten wurde untersucht. Obwohl die Dopamin-beladenen Exosomen keine zytotoxischen Wirkungen zeigten, verringerte Saponin die Lebensfähigkeit der Fibroblasten. Der MTT-Assay zeigte eine erhöhte Zelllebensfähigkeit, wenn die Fibroblasten mit den Dopamin-beladenen Exosomen behandelt wurden.

Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde durch die Durchführung einer unidirektionalen Nanova evaluiert. Zusätzlich wurden die zytotoxischen Effekte verschiedener Konzentrationen freier Exosomen auf die Fibroblasten untersucht. Die Viabilität der Fibroblasten war mit freien Exosomen in einer Konzentration von 25 Mikrolitern pro Milliliter höher.

Es ist wirklich wichtig für das zentrale Nervensystem, die Größe der Patienten, die Rolle bei den Prozessen wie Plastizität, Neuroreaktion, Kommunikation von Seite zu Seite und Neurogenese im Gehirn. Darüber hinaus wurde dank der Oberfläche der Exosomen beobachtet, dass sie mit dem Zielzellmedikament interagieren können, und die Aktivität, die während des Arzneimittels abgegeben wird. Zum ersten Mal in der Studie haben wir eine neue Wirkstoffformulierung entwickelt, indem wir Dopamin in aus Stammzellen gewonnene Exosomen eingekapselt haben.

Er schlug vor, dass diese Formulierung für die Behandlung der Parkinson-Krankheit vielversprechend sein wird.