Formulierung und Charakterisierung eines Exosom-basierten Dopaminträgersystems
4. April 2022
Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, eine Formulierung durch Dopaminbeladung der isolierten Exosomen von Stammzellen aus Whartons mesenchymalen Jelly-Stammzellen zu erhalten. Die Isolierung und Charakterisierung von Exosomen, die Wirkstoffbeladung der resultierenden Exosomen und die zytotoxische Aktivität der entwickelten Formulierung werden in diesem Protokoll beschrieben.
Exosomen können auf Vesikel reagieren, die von einer Zelle zwischen 14 und 200 Nanometern Größe abgesondert werden und sich in der intrazellulären Fracht und Kommunikation abspalten, die zur kleinsten Untergruppe der extrazellulären Vesikel führt. Exosomen, die durch die Differenzierung des Endosoms entstehen, stammen von der Zellmembran. Die Stammzellen können aus verschiedenen Quellen wie Knochenmark oder Fettgewebe isoliert werden.
Getrocknete Stammzellen aus adultem Gewebe haben jedoch ein höheres immunogenes Potenzial Durch die Größe von Exosomen wird gesagt, dass es eine wichtige Rolle bei Erkrankungen des Zentralnervensystems spielt, da es die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann. Waschen Sie zunächst die mesenchymalen Wharton-Jelly-Stammzellen mit fünf Millilitern PBS. Geben Sie dann fünf Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, bevor Sie den Kolben in einen Inkubator stellen.
Nach der Inkubation werden die Zellen gesammelt und fünf Minuten lang bei 1,500 g zentrifugiert. Entfernen Sie dann den Überstand und geben Sie einen Milliliter DMEM-F12 mit 10 % FBS in das Röhrchen. Waschen Sie kultivierte Zellen mit PBS.
Geben Sie nach dem Waschen serumfreies DMEM-F12-Medium zu den Zellen und legen Sie es in den Inkubator. Um die Exosomen zu isolieren, sammeln Sie das serumfreie Medium und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius. Überführen Sie den Überstand in ein anderes Röhrchen und verarbeiten Sie ihn durch serielle Zentrifugation mit höheren Geschwindigkeiten.
Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand langsam entfernt und das Pellet in einem Milliliter PBS aufgelöst. Durch Vortexen mischen und mit der Ultrazentrifugation bei 110.000 G für 70 Minuten bei vier Grad Celsius fortfahren. Fügen Sie drei Milliliter PBS zu der zuvor durch Ultrazentrifugation gesammelten Exosomensuspension hinzu und sterilisieren Sie die verdünnte Suspension durch Filtration mit einem 0,22-Mikron-Filter.
Anschließend werden 500 Mikroliter der sterilisierten Exosomensuspension in ein anderes Röhrchen überführt. Als nächstes werden nacheinander 500 Mikroliter 0,5 Milligramm pro Milliliter Dopaminlösung und Saponin in die sterilisierte Suspension gegeben. Nach der Inkubation wird die Suspension ultrazentrifugiert.
Die Probe kann entweder für die NTA- und DLS-Analyse zur Charakterisierung von Dopamin-beladenen Exosomen verwendet oder bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. In der NTA-Analyse wurde die durchschnittliche Größe der aus Wharton-Gelee gewonnenen Exosomen auf 98 Nanometer und die von Dopamin beladenen Exosomen auf 110 Nanometer bestimmt. Die Anzahl der Nanopartikel, die durch NTA- und DLS-Analysen ermittelt wurden, stimmte überein.
Das Zetapotential von Wharton-Jelly-abgeleiteten Exosomen wurde mit minus 15,7 und Dopamin-beladenen Exosomen mit minus 17,6 Millivolt gemessen. Die HPLC-Analyse der Dopamin-beladenen Exosomen detektierte den Peak für Dopamin nach 6,45 Minuten. Das kumulative Wirkstofffreisetzungsprofil zeigte, dass 74,8 % des eingekapselten Dopamins innerhalb der ersten acht Stunden aus den Exosomen freigesetzt wurden.
Die Zytotoxizität der Dopamin-beladenen und freien Exosomen auf Fibroblasten wurde untersucht. Obwohl die Dopamin-beladenen Exosomen keine zytotoxischen Wirkungen zeigten, verringerte Saponin die Lebensfähigkeit der Fibroblasten. Der MTT-Assay zeigte eine erhöhte Zelllebensfähigkeit, wenn die Fibroblasten mit den Dopamin-beladenen Exosomen behandelt wurden.
Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde durch die Durchführung einer unidirektionalen Nanova evaluiert. Zusätzlich wurden die zytotoxischen Effekte verschiedener Konzentrationen freier Exosomen auf die Fibroblasten untersucht. Die Viabilität der Fibroblasten war mit freien Exosomen in einer Konzentration von 25 Mikrolitern pro Milliliter höher.
Es ist wirklich wichtig für das zentrale Nervensystem, die Größe der Patienten, die Rolle bei den Prozessen wie Plastizität, Neuroreaktion, Kommunikation von Seite zu Seite und Neurogenese im Gehirn. Darüber hinaus wurde dank der Oberfläche der Exosomen beobachtet, dass sie mit dem Zielzellmedikament interagieren können, und die Aktivität, die während des Arzneimittels abgegeben wird. Zum ersten Mal in der Studie haben wir eine neue Wirkstoffformulierung entwickelt, indem wir Dopamin in aus Stammzellen gewonnene Exosomen eingekapselt haben.
Er schlug vor, dass diese Formulierung für die Behandlung der Parkinson-Krankheit vielversprechend sein wird.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Formulierung von Dopamin-beladenen Exosomen, die von Wharton's Jelly mesenchymalen Stammzellen abgeleitet sind. Das Protokoll beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von Exosomen, die Medikamentenbeladung und die Bewertung der zytotoxischen Aktivität.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Stammzellenforschung
- Arzneistoffabgabesysteme
Hintergrund
- Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel, die an der Zellkommunikation beteiligt sind.
- Sie spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen, einschließlich derjenigen im zentralen Nervensystem.
- Wharton's Jelly mesenchymale Stammzellen sind eine vielversprechende Quelle für die Exosomenisolation.
- Exosomen können die Blut-Hirn-Schranke überqueren, was sie für therapeutische Anwendungen wertvoll macht.
Zweck der Studie
- Eine Formulierung unter Verwendung von Dopamin-beladenen Exosomen zu entwickeln.
- Die zytotoxischen Effekte der entwickelten Formulierung zu untersuchen.
- Das Verständnis von exosombasierten Arzneimittelabgabesystemen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Wharton's Jelly mesenchymalen Stammzellen.
- Charakterisierung der isolierten Exosomen.
- Beladung von Dopamin in Exosomen.
- Bewertung der zytotoxischen Aktivität der Formulierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung und Charakterisierung von Exosomen.
- Effektive Beladung von Dopamin in Exosomen.
- Bewertung der zytotoxischen Effekte zeigte das Potenzial der Formulierung.
- Die Ergebnisse unterstützen den Einsatz von Exosomen in Arzneimittelabgabeanwendungen.
Schlussfolgerungen
- Dopamin-beladene Exosomen zeigen Potenzial für den therapeutischen Einsatz.
- Die Studie bietet ein Protokoll für die Forschung zu exosombasierten Arzneimittelabgabesystemen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um das volle Potenzial dieses Ansatzes zu erkunden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Exosome-based nanocarriers offer a promising platform for delivering small molecules across the blood-brain barrier, addressing a critical challenge in CNS drug development. The encapsulation and characterization of dopamine within stem cell-derived exosomes demonstrates a reproducible workflow for evaluating drug delivery vehicles in early discovery. This approach supports predictive confidence in translational neuroscience portfolios by enabling quantitative assessment of carrier efficacy and cytotoxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated delivery mechanisms for CNS-targeted therapeutics.
- Supports biological de-risking by quantifying encapsulation efficiency and release kinetics.
- Facilitates functional validation of carrier systems using cytotoxicity and viability assays.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for exosome isolation, drug loading, and nanoparticle characterization.
- Delivers quantitative outputs via NTA, DLS, zeta potential, and HPLC analyses.
- Enables reproducible assessment of drug release profiles and cytotoxicity in vitro.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by leveraging exosomes' ability to cross the blood-brain barrier.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation through quantitative release and viability data.
- Reduces mechanistic ambiguity in CNS drug delivery strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This exosome-based carrier system fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling iterative optimization before lead identification.
- Discovery Biology: Quantitative encapsulation and release data inform hypothesis testing for CNS delivery.
- Screening: Standardized nanoparticle and cytotoxicity assays support assay readiness and reproducibility.
- Analytics: HPLC and particle analysis provide robust comparative metrics for formulation assessment.
- Translational Research: Exosome-mediated delivery supports biomarker alignment and preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for other small molecule or biologic payloads in CNS research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS-targeted delivery systems.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation, loading, and characterization for scalable workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for novel carrier platforms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS delivery strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle isolation, characterization, and analytical chemistry.
- Needs access to ultracentrifugation, NTA, DLS, and HPLC instrumentation.
- Demands cross-team standardization of exosome preparation and assay protocols.
- Adaptable to various stem cell sources and small molecule payloads.
- Release kinetics and cytotoxicity must be validated for each new formulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Culturing and Cryopreservation of Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
1:30
Production of Exosomes from Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
2:20
Dopamine Loading into Exosomes and Characterization of Dopamine Loaded Exosomes
3:15
Results: Development of a Nanocarrier System by Encapsulation of Dopamine into Exosomes Isolated from WJ‐MSCs
5:07
Conclusion
