Biomolekulare Bildgebung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels multimodaler nichtlinearer optischer Mikroskopie

Unser Protokoll stellt eine multimodale, nichtlineare, optische Mikroskopie dar und wendet sie an, um chemisch spezifische Bildgebung von Goldnanopartikeln in Krebszellen durchzuführen. Der Hauptvorteil unseres Bildgebungssystems besteht darin, dass es verwendet werden kann, um den biomolekularen Kontrast von Zellstrukturen und Goldnanopartikeln multimodal zu überprüfen. Schalten Sie zunächst die Stecker aller Geräte mit Ausnahme der Fernbedienungsbox ein.

Schalten Sie dann die Rückseite der Box ein und drücken Sie Start Operation, nachdem die Fernbedienungsleuchte auf der Steuerbox blau leuchtet. Schalten Sie anschließend den PC des Laserscanning-Mikroskops ein und führen Sie die konfokale Mikroskopsoftware aus. Überprüfen Sie dann den Lichtweg des Mikroskops mit der Computersoftware und steuern Sie den Fokus über den Touchscreen oder die Fernbedienungsknöpfe oder die Computersoftware.

Wählen Sie die gewünschten Bildeinstellungen in der Software aus, einschließlich Zoom, Bildgröße in Pixel und Pixelverweilzeit, und stellen Sie sicher, dass die Pixelverweilzeit größer als die Integrationszeit ist. Legen Sie einen Tropfen destillierten Wassers auf das Wassertauchobjektiv, das die Laserstrahlen in die Probe und zwischen den Kondensator und die Probe für die Bildgebung fokussiert. Stellen Sie dann die Höhe des Kondensators auf etwa einen Millimeter über der Probe ein, um die maximale Lichtmenge zu sammeln, und bewegen Sie den auf einer beweglichen Halterung platzierten SRS-Detektor aus dem Strahlengang, um mit weißem Licht auf die Probe zu fokussieren.

Wählen Sie über die Softwareeinstellungen den Pumpstrahl aus und ändern Sie die Laserwellenlänge auf 802 Nanometer für CH-Vibrationen und 898 Nanometer für Amid-I-Peak, was große Änderungen in der Raman-Verschiebung berücksichtigt. Um kleine Anpassungen in der Raman-Schicht zu erreichen, scannen Sie die Verzögerungsstufe in der SFTRU-Einheit wie im Manuskript beschrieben. Wählen Sie für den Hyperspektraldatensatz die Registerkarte Trigger aus, klicken Sie auf Start by ttl trigger on und wählen Sie dann Trigger every frame aus.

Legen Sie anschließend auf der Registerkarte Serie die Zeitreihe ein und die Z-Serie aus. Stellen Sie außerdem die Anzahl der Frames in der Zeitreihe so ein, dass sie mit der Anzahl der Schritte in der ATM-Software übereinstimmt. Gehen Sie anschließend auf die Registerkarte Ausführen in der ATM-Software und legen Sie die Verzögerungsstufenpositionen für CH auf 90,25 und 92,25 fest, während Sie für den Amid-I-Bereich bei 89 und 91 in Millimetern liegen, was der Start- und Stoppposition des Hyperspektralscans entspricht, wobei Sie sicherstellen, dass die Anzahl der Schritte mit der Anzahl der Bilder in der Computersoftware übereinstimmt.

Nachdem Sie die korrekten Einstellungen überprüft haben, starten Sie den Hyperspektralstapel in der Computersoftware, indem Sie zuerst zu Acquire gehen und dann auf Scan starten klicken. Klicken Sie dann in der ATM-Software auf Start, wodurch die Erfassung einer Reihe von Bildern mit inkrementellen Erhöhungen der Verzögerungsstufenposition zwischen den ausgewählten Start- und Stopppositionen initiiert wird. Nehmen Sie dann eine Zeitreihe von Bildern an verschiedenen Positionen der Verzögerungsstufe auf, um einen hyperspektralen Scan zu erzeugen.

Senden und empfangen Sie mit der analogen Einheit TTL-Signale zum und vom SFTRU-System, um die Bildaufnahme und Bewegung der Verzögerungsstufe zu synchronisieren. Um zwischen der Bildgebung im CH-Schwingungsbereich in den Amid-I-Schwingungsbereich zu wechseln, ändern Sie die Pumpwellenlänge in der Lasersoftware von 802 Nanometern auf 898 Nanometer. Ändern Sie außerdem die Stokes-Dispersionseinstellung in der ATM-Software von 30 Millimeter auf 5 Millimeter.

Stellen Sie den unteren Knopf an der Spiegelhalterung ein, um eine kleine Anpassung des Spiegels im Pumpstrahl-Dispersionsweg in der SFTRU-Box vorzunehmen, indem Sie den Spiegelwinkel mit einem inkrementellen Betrag ändern. Um die chemische Selektivität der Polystyrol-Mikrosphären zu validieren, wurden hyperspektral stimulierte Raman-Streuung und spontane Raman-Spektren aufgezeichnet. Die Spektren waren bis auf den beobachteten Unterschied in der relativen Intensität identisch.

Die stimulierte Raman-Streubildgebung von 4T1-Krebszellen wurde bei 2, 852, 2, 930 und 2.968 Wellenzahlen durchgeführt, was dem Kohlenstoff-Wasserstoff-Dehnungsschwingband von Lipid-, Protein- und DNA-Biomolekülen entspricht. Multimodale Bildgebung von 4T1-Krebszellen, die mit Goldnanopartikeln dosiert waren, wurde durchgeführt, um die Nanopartikelverteilungen in Krebszellen zu untersuchen. Die aufgenommenen stimulierten Raman-Streubilder wurden für CH2- und CH3-Kanal, LysoTracker-Fluoreszenzsonden und resonanzfreie Raman-Streukanäle erhalten.

Das Wichtigste, woran Sie denken sollten, ist, den Schwingungsbereich, die Pumpenreferenz, in der Lasersoftware und auch die Stokes-Dispersionseinstellung während des Protokolls zu ändern. Dieses System kann einfach von Femtosekunden- auf Pikosekundenbereich umgeschaltet werden, ohne die optische Ausrichtung zu beeinträchtigen. Diese Fähigkeit ermöglicht es uns, Multiphotonen-kohärente Raman-Streu- und Pumpsondenspektroskopie und deren Anwendungen durchzuführen.

Diese multimodale Bildgebungsplattform liefert neue Einblicke in die Nanomedizin und ebnet den Weg für die molekulare Bildgebung von Zellen, Geweben und Goldnanopartikeln.