Name: Hochgeschwindigkeits-Ultraviolett-Photoakustikmikroskopie für die histologische Bildgebung mit virtueller Färbung mit Unterstützung von Deep Learning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Entdecken Sie hochgeschwindige UV-Photoakustikmikroskopie mit Deep Learning für intraoperative histologische Bildgebung. Diese Methode liefert virtuelle H&E-Färbungen in 18 Minuten zur präzisen chirurgischen Randanalyse.

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Die Autoren danken der Hong Kong Innovation and Technology Commission (ITS/036/19).

Alle Tierversuche, die in dieser Arbeit durchgeführt werden, werden von der Tierethikkommission der Hong Kong University of Science and Technology genehmigt.
1. Offenes UV-PAM-System (Abbildung 1)
<ol><li>Optische Beleuchtung<ol>
<li>Verwenden Sie einen Q-Switch-diodengepumpten Festkörperlaser (266 nm Wellenlänge) als Anregungsquelle.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei konvexe Linsen, um den Laserstrahl zu erweitern, und platzieren Sie ein Loch in der Nähe des Brennpunkts der ersten konvexen Linse, um eine räumliche Filterung durchzuführen.</li>
		<li>Reflektieren Sie den Laserstrahl mit einem 1D-Galvanometerspiegel (1D-GM) nach oben.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Objektivlinse, um den Laserstrahl zu fokussieren und durch die Mitte eines ringförmigen Ultraschallwandlers (UT) zu gehen, bevor Sie fest auf eine Probe fokussiert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultraschall-Detektion<ol>
<li>Verwenden Sie eine ringförmige, fokussierte UT, um Ultraschallwellen zu erkennen. Der Innen- und Außendurchmesser der aktiven UT-Fläche beträgt 3 mm bzw. 6 mm. Brennweite: 6,3 mm; Mittenfrequenz: 40 MHz; -6 dB Bandbreite: 84%.</li>
		<li>Befestigen Sie den UT in einem im Labor hergestellten Wassertank mit einem optisch transparenten Fenster an der Unterseite, das von einem dünnen Quarz-Deckglas bedeckt ist, damit UV-Licht durchgelassen werden kann. Stellen Sie sicher, dass der aktive Bereich der UT nach oben zeigt. Befestigen Sie den Wassertank an einer zweiachsigen manuellen Stufe zur Steuerung der seitlichen Position des UT.</li>
		<li>Schalten Sie den UV-Laser ein und passen Sie die Position des UT so an, dass der Laserstrahl von der Mitte des UT hindurchgehen kann. Schalten Sie den UV-Laser aus. Füllen Sie dann den Wassertank mit deionisiertem Wasser, um die UT vollständig einzutauchen.</li>
		<li>Schließen Sie den Ausgang des UT an zwei Verstärker an (Gesamtverstärkung = 56 dB) und schließen Sie den Ausgang des zweiten Verstärkers an eine Datenerfassungskarte (DAQ) an.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Befestigen Sie einen Probenhalter an einem manuellen Z-Achsentisch, der mit xy-motorisierten Tischen verbunden ist. Der Probenhalter hat ein leeres Loch, durch das UV-Licht hindurchgelassen werden kann. Befestigen Sie vier Stücke doppelseitiges Klebeband, das das Loch umgibt.</li>
	<li>Systemausrichtung<ol>
<li>Befestigen Sie schwarzes Klebeband an einem Glasobjektträger und legen Sie den Glasträger so auf, dass er das Loch des Probenhalters bedeckt, wobei das schwarze Klebeband nach unten zeigt. Drücken Sie den Glasschieber, um sicherzustellen, dass er am Probenhalter befestigt ist. Senken Sie dann den Probenhalter ab, um den Glasschieber in das Wasser zu tauchen.</li>
		<li>Trennen Sie den ringförmigen UT und die Verstärker, schließen Sie den UT an den Pulser/Empfänger an und schließen Sie den Ausgang des Pulsers/Empfängers an ein Oszilloskop an. Betätigen Sie den Pulser/Empfänger im Pulse-Echo-Modus. Stellen Sie die Pulsamplitude und die Verstärkung des Pulsers/Empfängers auf 6 bzw. 20 dB ein.<ol>
<li>Aktivieren Sie den Pulser/Empfänger und passen Sie die Z-Position des Probenhalters an, um die Position der akustischen Brennebene zu finden, an der die Ultraschallsignale maximal sind.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wechseln Sie den Pulser/Empfänger in den Sendemodus und stellen Sie die Verstärkung auf 60 dB. Aktivieren Sie die Laserausgabe. Stellen Sie die Z-Position des Objektivs ein, um die vom Oszilloskop gemessenen PA-Signale zu maximieren.</li>
		<li>Passen Sie die laterale Position des ringförmigen UT an, um das erzeugte PA-Signal symmetrisch und maximal zu machen, was bedeutet, dass die optischen und akustischen Brennpunkte in der lateralen Ebene ausgerichtet sind. Stellen Sie dann die Z-Position des Probenhalters ein, um die PA-Signale zu maximieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3 und 1.4.4, um sowohl die Symmetrie als auch die Amplitude der PA-Signale zu optimieren. Notieren Sie die Zeitverzögerung (d. h. die Zeit, die die PA-Wellen benötigen, um die UT zu erreichen) auf dem Oszilloskop, wenn die PA-Signale optimiert sind.</li>
		<li>Bewegen Sie den Probenhalter, um verschiedene Positionen des schwarzen Bandes abzubilden. Stellen Sie die Ebenheit des Probenhalters so ein, dass die von jeder Position des schwarzen Bandes erzeugten PA-Signale die gleiche Zeitverzögerung aufweisen wie die in Schritt 1.4.5 gemessene.</li>
		<li>Schalten Sie den Laser aus und schließen Sie den UT an die beiden Verstärker an.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
<ol><li>FFPE-Maus-Gehirnschnitt<ol>
<li>Opfere eine Maus mit einer Überdosis Anästhesie. Ernten Sie dann das Mäusegehirn nach dem in Referenz18 beschriebenen Protokoll.</li>
		<li>Fixieren Sie das geerntete Gehirn in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 24 h.</li>
		<li>Verarbeiten Sie das fixierte Gehirn durch Austrocknung mit abgestuftem Alkohol, Clearing mit Xylol und Einbettung mit Paraffin, wie in Referenz19 beschrieben. HINWEIS: Verarbeiten Sie die Probe in einem Abzug.</li>
		<li>Schneiden Sie das eingebettete Gehirn mit einem Mikrotom in dünne Scheiben (5 μm Dicke). Legen Sie die Probenscheiben auf Quarzobjektträger. Trocknen Sie die Objektträger im Ofen bei 60 °C für 1 h.</li>
		<li>Entparaffinisieren Sie die Abschnitte mit einem Clearingmittel (siehe Materialtabelle), das das Paraffin entfernt, um hohe Hintergrundsignale zu vermeiden, da Paraffin bei UV-Anregung sehr absorbierend ist. HINWEIS: Verarbeiten Sie die Probe in einem Abzug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frische Maus-Gehirnscheibe<ol>
<li>Opfere eine Maus mit einer Überdosis Anästhesie. Ernten Sie dann das Mäusegehirn nach dem in Referenz18 angegebenen Protokoll.</li>
		<li>Waschen Sie das Gehirn der Maus mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um das Blut zu entfernen.</li>
		<li>Schneiden Sie eine Scheibe der Gehirnprobe (~ 5 mm dick) von Hand und waschen Sie die Probe dann mit PBS, um das Blut auf dem Querschnitt zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Experimentelle Verfahren
<ol><li>Platzierung der Proben<ol>
<li>Bereiten Sie einen im Labor hergestellten Probentank mit einer transparenten UV-Membran (Polyethylen, ∼10 μm Dicke) vor. Fügen Sie einen Tropfen Wasser zur Membran hinzu und legen Sie dann die biologische Probe auf den Probentank, um das Wasser abzudecken. Verwenden Sie im Falle der FFPE-Slice-Probe Klebeband, um den Glasobjektträger auf der Membran zu befestigen.</li>
		<li>Stellen Sie den probenhaltigen Probenbehälter auf den Probenhalter und stellen Sie sicher, dass das leere Loch des Probenhalters abgedeckt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie den UV-Laser in den externen Triggermodus ein. Mit unserem im Labor entwickelten Programm LabVIEW (siehe Materialverzeichnis) können Sie die Scanparameter wie folgt einstellen.<ol>
<li>Stellen Sie die Laserwiederholrate auf 55 kHz ein; Stellen Sie den Signaltype des GM-Treibers auf dreieckig und den Fahrspannungsbereich auf 0,018 V (entspricht ±0,018 V; Skalierungsfaktor: 1 V/°). Stellen Sie GMnum auf 22 und dy auf 2 so ein, dass der GM nach jeweils 22 Lasertriggern ein Viertel der Scanzeit beendet und der y-Achsenmotor eine Schrittweite von 0,3125 μm bewegt. Stellen Sie dx auf 192 ein, so dass, wenn der y-Achsenmotor die voreingestellte Position erreicht (z. B. 5 mm), der x-Achsenmotor eine Schrittweite von 30 μm bewegt. HINWEIS: Die kleinste inkrementelle Schrittgröße ist auf 0,15625 μm für die x- und y-Achsenmotoren eingestellt. Wenn dy = 2 ist, entspricht die Schrittgröße daher 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, und wenn dx = 192, entspricht die Schrittgröße 0,15625 x 192 = 30 μm. Um die gesamte Fläche von 5 x 5 mm2 zu scannen, bewegt sich der x-Achsenmotor 5000 μm / 30 μm = 167 mal, was bedeutet, dass 167 Unterbilder zusammengefügt werden, um ein ganzes Bild zu erhalten. Siehe Abbildung 2 für die Scan-Trajektorie des UV-PAM-Systems.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starten Sie das Testscannen in einem kleinen Bereich, indem Sie die Anzahl der beweglichen Schritte der x- und y-Achsenmotoren einstellen (xn = 10 und yn = 1000). Stellen Sie den manuellen Z-Achsentisch so ein, dass die Probe auf der Brennebene platziert wird, um maximale PA-Signale zu erhalten.</li>
	<li>Bewegen Sie sowohl x- als auch y-Achsenmotoren zum gewünschten Ausgangspunkt, legen Sie den Scanbereich durch Festlegen der xn - und yn-Werte fest und starten Sie dann das Bilderfassungsprogramm (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Schalten Sie nach der Bildaufnahme den Laser aus, entfernen Sie den Probenhalter und lagern Sie die biologischen Proben.</li>
	<li>Für frisches biologisches Gewebe lagern Sie die Proben in 10% neutralem gepuffertem Formalin.</li>
	<li>Für die FFPE-Maus-Gehirnschnitte mit H & E gemäß dem in Referenz20 angegebenen Protokoll färben, um die entsprechenden H & E-gefärbten Bilder zu erhalten.</li>
	<li>Verwenden Sie die gesammelten PA-Signale, um das Projektionsbild mit maximaler Amplitude mit einem im Labor entwickelten Bildverarbeitungsalgorithmus zu rekonstruieren (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

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</ol>

T. T. W. W. und V. T. C. T. haben ein finanzielles Interesse an PhoMedics Limited, das diese Arbeit jedoch nicht unterstützte. Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Hochgeschwindigkeits- und offenes UV-PAM-System für die histologische Bildgebung demonstriert wurde. Die detaillierten Anweisungen zur Systemkonfiguration, optischen Ausrichtung, Probenvorbereitung und experimentellen Verfahren werden vorgestellt. Das Bilderfassungsprogramm kann von Github aus über den Link in der Tabelle der Materialien aufgerufen werden. Die laterale Auflösung des vorliegenden Systems beträgt ~1,2 μm, was in einer kürzlich erschienenen Publikation21 experimentell gemessen wurde. Ein Gehirnschnitt der Maus wurde abgebildet, um zu zeigen, dass das vorliegende System innerhalb von 18 Minuten ein histologisches Bild für eine Fläche von 5 x 5 mm2 erhalten kann, was einer typischen Größe der Hirnbiopsie22 entspricht. Obwohl das Originalbild in Graustufen ist, kann das vorliegende System mit Hilfe eines digitalen virtuellen Färbewerkzeugs, das durch einen Deep-Learning-Algorithmus ermöglicht wird, virtuell gefärbte Bilder nahezu in Echtzeit liefern, was eine einfache Anpassung der Pathologen an die Interpretation der Bilder gewährleistet. Als markierungsfreie Bildtechnik kann das vorliegende UV-PAM-System auch histologische Bilder für unverarbeitete Frischgewebeproben liefern. Weitere Beispiele (einschließlich gefrorener und frischer Gewebeproben) wurden in einer früheren Veröffentlichung17 gezeigt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen das hohe Potenzial des vorliegenden Deep-Learning-gestützten UV-PAM-Systems in SMA-Anwendungen.
Einer der Vorteile des UV-PAM-Systems besteht darin, dass das System im Reflexionsmodus implementiert ist und die Bildgebung von dickem Gewebe ermöglicht. Außerdem ermöglicht das offene UV-PAM-System die Platzierung der Probe auf dem Rasterfenster (der Membran des Probentanks), das eine ähnliche Funktion wie herkömmliche optische Mikroskopien hat. Daher ist dieses System benutzerfreundlicher als andere Systeme, bei denen Proben von zwei Membranen11,14 umgeben werden müssen. Darüber hinaus kann das derzeitige UV-PAM-System durch die Verwendung eines 1D-GM mit einem UV-Laser mit hoher Wiederholungsrate eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit bei höherer Kosteneffizienz im Vergleich zum System mit multifokaler Anregungerreichen 23.
Derzeit ist die Bildgebungsgeschwindigkeit hauptsächlich durch die Wiederholungsrate des Laser- und Photonenbudgets begrenzt. Mit einem Laser, der eine hohe Wiederholrate und eine hohe Pulsenergie aufweist, kann die Abbildungszeit weiter verkürzt werden. Eine weitere Einschränkung des Systems besteht darin, dass die Probe nur grob an die Brennebene der Objektivlinse angepasst werden kann, indem die maximalen PA-Signale gefunden werden, anstatt ein Echtzeitbild anzuzeigen, damit Benutzer visualisieren können, ob die Probe fokussiert ist. Um ein Bild nahezu in Echtzeit anzuzeigen, kann 2D GM angewendet werden.
Es gibt zwei kritische Schritte im Protokoll: (a) Die konfokalen Anforderungen der optischen und akustischen Brennpunkte sollten optimiert werden, um eine hohe Detektionsempfindlichkeit zu erreichen; (b) Der Scanbereich des GM auf der x-Achse sollte kleiner sein als der akustische Brennfleck des ringförmigen UT, um eine ähnlich hohe Erkennungsempfindlichkeit aufrechtzuerhalten (im aktuellen Setup beträgt der Scanbereich ~ 30 μm ±15 μm). Andernfalls würden offensichtliche Vignettierungseffekte an den Rändern auftreten, wenn mehrere Unterbilder zusammengefügt werden, um ein ganzes Bild zu erhalten.

Die chirurgische Randanalyse (SMA), die eine Untersuchung von Gewebeproben unter dem Mikroskop erfordert, ist ein wesentliches Verfahren, um festzustellen, ob alle Krebszellen in einer Resektionsoperation aus dem Körper eines Patienten entfernt werden1. Daher ist ein Mikroskop, das schnell histologische Bilder liefern kann, für SMA von entscheidender Bedeutung, um wiederholte Operationen zu vermeiden, die durch eine unvollständige Entfernung von Krebszellen verursacht werden. Nach der aktuellen Goldstandardmethode, die auf der hellfeldoptischen Mikroskopie basiert, muss das ausgeschnittene Gewebe jedoch in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, in dünne Scheiben (4-7 μm) geschnitten und dann vor der Bildgebung mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt werden, was zeitaufwendig (3-7 Tage) und mühsam ist 2,3 . Ein gefrorener Abschnitt ist eine schnelle Alternative für SMA, indem das Gewebe schnell eingefroren, geschnitten und gefärbt wird, was histologische Bilder in 20-30 min4 liefern kann. Die histologischen Merkmale sind jedoch oft verzerrt und erfordern ein geschicktes Training, was die Anwendbarkeit der Technik auf mehrere Arten von Organen behindert5.
Für SMA wurden optische Mikroskopietechniken entwickelt, die zelluläre Bilder ohne oder mit wenigen Schritten der Gewebeverarbeitung liefern können. Jeder von ihnen leidet jedoch unter unterschiedlichen Problemen. Zum Beispiel leiden die optische Kohärenztomographie6 und die konfokale Reflexionsmikroskopie 7 aufgrund ihres geringen intrinsischen Streukontrasts unter einer geringen Spezifität. Obwohl die Mikroskopie mit ultravioletter Oberflächenanregung8 und die Lichtblattmikroskopie9 hochauflösende und kontrastreiche Bilder für SMA liefern können, kann das toxische und flüchtige Färbeverfahren normalerweise nicht in einem Operationssaal durchgeführt werden, was die Durchlaufzeit verlängert. Multiphotonenmikroskopie10 und stimulierte Raman-Mikroskopie11 können reichhaltige Informationen für SMA liefern. Die hohen Kosten der erforderlichen ultraschnellen Laser, die zur Erzeugung nichtlinearer Effekte verwendet werden, verhindern jedoch ihre breite Anwendbarkeit.
Vor kurzem wurde durch die Nutzung der intrinsischen optischen Absorption eine markierungsfreie ultraviolette photoakustische Mikroskopie (UV-PAM) entwickelt, um hochauflösende histologische Bilder zu liefern12. Bei UV-PAM wird die Photonenenergie des Anregungs-UV-Lichts (z.B.266 nm) zunächst von der DNA/RNA in Zellkernen 13 absorbiert und dann in Wärme umgewandelt, wodurch durch thermisch-elastische Ausdehnung14 akustische Wellenemission induziert wird. Durch die Detektion der erzeugten akustischen Wellen können zweidimensionale (2D) UV-PAM-Bilder von Zellkernen über maximale Amplitudenprojektion der akustischen Signale erhalten werden, die histologische Informationen für SMA liefern. Um die klinischen Anwendungen von UV-PAM zu ermöglichen, wurde ein Hochgeschwindigkeits-UV-PAM entwickelt, das auf Galvanometer-Spiegelscanning basiert, um histologische Bilder für eine Hirnbiopsieprobe (5 mm x 5 mm) innerhalb von 18 Minuten zu liefern, was ein großes Potenzial in zeitkritischen Anwendungen zeigt15. Um die Möglichkeit von UV-PAM für die Bildgebung von Dickgewebe weiter zu validieren, wurde ein Reflexionsmodus-UV-PAM-System mit einem wasserdichten einachsigen mikroelektromechanischen Systemscanner vorgeschlagen, das die intraoperative histopathologische Untersuchung von menschlichem Dickdarm- und Lebergewebe erfolgreich demonstriert16. Da das ursprüngliche UV-PAM-Bild in Graustufen ist, während das Goldstandard-H & E-gefärbte Bild in rosa und violetten Farben ist, ist es für Pathologen schwierig, UV-PAM-Bilder direkt zu interpretieren. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein Deep-Learning-Algorithmus vorgeschlagen, um Graustufen-UV-PAM-Bilder nahezu in Echtzeit in virtuelle H & E-gefärbte Bilder zu übertragen, so dass Pathologen die Bilder ohne zusätzliche Schulung verstehen können17.
Diese Arbeit berichtet von einem Hochgeschwindigkeits- und offenen UV-PAM-System, das ähnlich wie herkömmliche optische Mikroskopien betrieben werden kann und sowohl originale histologische Graustufenbilder als auch virtuell gefärbte Bilder liefert, die von einem Deep-Learning-Algorithmus unterstützt werden. Eine formalinfixierte und paraffineingebettete (FFPE) Maus-Hirnscheibe wird vom UV-PAM-System abgebildet, um die Ähnlichkeit zwischen unseren virtuell gefärbten UV-PAM- und Standard-H&E-gefärbten Bildern zu demonstrieren und ihr Potenzial für SMA-Anwendungen zu zeigen.

<table><tbody><tr><td>Alkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1373</td><td>Verstärker für die Probendehydrierung</td></tr><tr><td></td><td>Mini Circuit</td><td>ZFL-500LN-BNC+</td><td>Ultraschall-Signalverstärkung</td></tr><tr><td>Controller</td><td>National Instruments</td><td>NI myRIO</td><td>System-Controller</td></tr><tr><td>Datenerfassungskarte</td><td>Alazar Technologies</td><td>ATS9350</td><td>Ultraschall-Signalerfassung</td></tr><tr><td>Deep-Learning </td><td></td><td></td> Algorithmus <td>Zur Übertragung des Graustufen-UV-PAM-Bildes auf ein virtuelles H& E-gefärbtes Bild; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R04586</td><td>Probenfixierung</td></tr><tr><td>H& E Färbekit</td><td>Abcam</td><td>ab245880</td><td>Probenfärbung</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-202</td><td>Probenentparaffinierung</td></tr><tr><td>Bildaufnahmeprogramm</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td>Im Labor entwickeltes Programm mit LabVIEW https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM</td></tr><tr><td>Bildverarbeitungsalgorithmus</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB</td><td>Im Labor erstellter Algorithmus mit MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM</td></tr><tr><td>Kinematische Plattformhalterungen</td><td>Thorlabs</td><td>KM200B</td><td>Passen Sie die Probe flach an</td></tr><tr><td>Membran</td><td>Glad</td><td>Frischhaltefolie</td><td>Sandwichiert im Probentank</td></tr><tr><td>Mikroskop-Objektiv</td><td>Thorlabs</td><td>LMU- 5X-NUV</td><td>Objektiv</td></tr><tr><td>Motorisierte Tische</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-509.10SD00</td><td>Scanning-Tische</td></tr><tr><td>Eindimensionaler Galvanometerspiegel</td><td>Thorlabs</td><td>GVS411</td><td>Schneller Scanning-Spiegel</td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>RIGOL Technologies</td><td>DS1102E</td><td>Ultraschallsignalauslesung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td>Probenwäsche</td></tr><tr><td>Lochblende</td><td>Edmund Optics</td><td>#59&ndash; 257</td><td>Räumliche Filterung</td></tr><tr><td>Plankonvexlinse</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4600-UV</td><td>Fokussierlinse</td></tr><tr><td>Plankonvexe Linse</td><td>Thorlabs</td><td>LA-4663-UV</td><td>Kollimationslinse</td></tr><tr><td>Impulsgeber/Empfänger</td><td>Imaginant</td><td>DPR300</td><td>Pulsechoverstärker</td></tr><tr><td>Q-Schalter diodengepumpter Festkörperlaser</td><td>Bright Solutions</td><td>WEDGE HF 266 nm</td><td>266-nm Laser</td></tr><tr><td>Ringförmiger Ultraschallwandler</td><td>University of Southern California</td><td></td><td>Ultraschallsignaldetektion</td></tr><tr><td>Probenhalter</td> im <td>Labor Halten</td><td></td><td>des Probentanks</td></tr><tr><td>Probenbehälter</td><td>im Labor Halten</td><td></td><td>biologischer Proben</td></tr><tr><td>Einachsiger Z-Translationstisch</td><td>Thorlabs</td><td>PT1</td><td>Manueller Tisch</td></tr><tr><td>Zweiachsiger manueller Tisch</td><td>Thorlabs</td><td>LX20</td><td>Manuelle Bühne</td></tr><tr><td>Wassertank</td><td>Laborhergestellt</td><td></td><td>Ultraschallsignalübertragung</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>XX0060</td><td>Probenreinigung</td></tr></tbody></table>

hochgeschwindigkeits-ultraviolett-photoakustikmikroskopie für die histologische bildgebung mit virtueller färbung mit unterstützung von deep learning

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Die chirurgische Randanalyse (SMA), ein wesentliches Verfahren zur Bestätigung der vollständigen Exzision von Krebsgewebe in der Tumorresektionschirurgie, erfordert intraoperative diagnostische Werkzeuge, um wiederholte Operationen aufgrund eines positiven chirurgischen Randes zu vermeiden. In jüngster Zeit wurde durch die Nutzung der hohen intrinsischen optischen Absorption von DNA/RNA bei einer Wellenlänge von 266 nm die ultraviolette photoakustische Mikroskopie (UV-PAM) entwickelt, um hochauflösende histologische Bilder ohne Markierung zu liefern, was als intraoperatives Werkzeug für SMA vielversprechend ist. Um die Entwicklung von UV-PAM für SMA zu ermöglichen, wird hier ein schnelles und offenes UV-PAM-System vorgestellt, das ähnlich wie herkömmliche optische Mikroskopien betrieben werden kann. Das UV-PAM-System bietet eine hohe laterale Auflösung von 1,2 μm und eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit von 55 kHz A-line Rate mit einachsiger Galvanometer-Spiegelabtastung. Um sicherzustellen, dass UV-PAM-Bilder von Pathologen ohne zusätzliche Schulung leicht interpretiert werden können, werden die ursprünglichen Graustufen-UV-PAM-Bilder durch einen Deep-Learning-Algorithmus virtuell gefärbt, um die Standard-Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Bilder nachzuahmen, was eine trainingsfreie histologische Analyse ermöglicht. Mouse Brain Slice Imaging wird durchgeführt, um die hohe Leistung des offenen UV-PAM-Systems zu demonstrieren und sein großes Potenzial für SMA-Anwendungen zu veranschaulichen.

Abbildung 1 zeigt den Schaltplan des Hochgeschwindigkeits-UV-PAM-Systems. In diesem Setup befinden sich die optischen Anregungs- und Ultraschalldetektionspfade auf der gleichen Seite und unter der Probe, wodurch ein Reflexionsmodus und ein offenes System gebildet werden. Somit ist es benutzerfreundlich und eignet sich für die Abbildung dicker Proben.
Abbildung 2 zeigt die Scan-Trajektorie des UV-PAM-Systems während der Bildgebung. Das Unterbild jedes Abschnitts (z. B. eine Fläche von 5 mm x 30 μm) wird zuerst mit einem Streuinterpolationsalgorithmus erzeugt, und dann wird ein ganzes Bild (z. B. eine Fläche von 5 mm x 5 mm) erhalten, indem alle Unterbilder mit einem benutzerdefinierten Bildverarbeitungsalgorithmus zusammengefügt werden (siehe Materialtabelle).
Abbildung 3A und Abbildung 3B zeigen die UV-PAM- bzw. H&amp;E-Bilder einer FFPE-Maus-Hirnscheibe, die beide ein Sichtfeld von 5 x 5 mm2 haben. Der Bildverarbeitungsalgorithmus kann von Github aus über den Link in der Tabelle der Materialien aufgerufen werden. Die Bildaufnahmezeit betrug weniger als 18 min. Abbildung 3C-F zeigt die vergrößerten Bilder der markierten Bereiche in Abbildung 3A, in denen die einzelnen Zellkerne eindeutig aufgelöst werden können. Noch wichtiger ist, dass die entsprechenden Zellkerne in den Standard-H&amp;E-gefärbten Bildern zu finden sind (Abbildung 3G-J), was die hohe Genauigkeit des aktuellen Systems für die zelluläre Bildgebung zeigt. Um das Graustufen-UV-PAM-Bild auf ein virtuelles H&amp;E-gefärbtes Bild zu übertragen, wurde ein Deep-Learning-Algorithmus17 (siehe Table of Materials) angewendet, der für ein Bild mit 8000 x 8000 Pixeln weniger als 30 s benötigen würde. Die entsprechenden vergrößerten Bilder sind in Abbildung 3K-N dargestellt. Die virtuell gefärbten UV-PAM-Bilder liefern fast die gleichen strukturellen Informationen wie die H&amp;E-gefärbten Bilder und sind vielversprechend für die klinische Translation des aktuellen UV-PAM-Systems.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig01.jpg"> Abbildung 1: Das Schema des Hochgeschwindigkeits- und offenen UV-PAM-Systems. (A) Die Systemeinrichtung. (B) Foto des Probenhalters und eines Wassertanks, der an einem zweiachsigen manuellen Tisch befestigt ist. (C) Foto des ringförmigen Ultraschallwandlers, der im Wassertank befestigt ist, und des Probenbehälters, der das Loch des Probenhalters abdeckt. (D) Foto des Probenbehälters mit der Membran und der Probe, die auf den Probenhalter gelegt werden sollen. UV: Ultraviolett; Datenerfassung: Datenerfassungskarte; GM: Galvanometerspiegel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig02.jpg"> Abbildung 2: Die Scankurve des UV-PAM-Systems während der Bildgebung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63649/63649fig03.jpg"> Abbildung 3: Experimentelle Ergebnisse der UV-PAM-Bildgebung mit Deep Learning-basierter virtueller Färbung. (A) UV-PAM-Bild eines FFPE-Maus-Gehirnschnitts. (B) Standard-H&amp;E-gebeiztes Bild derselben Scheibe. Maßstabsleisten: 1 mm. (C-F) Vergrößerte Bilder der markierten Bereiche in A. (G-J) Entsprechende H&amp;E-gefärbte Bilder der markierten Regionen in B. (K-N) Entsprechende virtuell gefärbte Bilder mittels eines Deep-Learning-Algorithmus. Maßstabsstäbe: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63649/63649fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Ein hochschnelles und offenes ultraviolettes photoakustisches Mikroskop, das histologische Bilder intraoperativ für die chirurgische Randanalyse liefern kann, wird demonstriert, einschließlich der Systemkonfiguration, der optischen Ausrichtung, der Probenvorbereitung und der experimentellen Verfahren.

Hochgeschwindigkeits-Ultraviolett-Photoakustikmikroskopie für die histologische Bildgebung mit virtueller Färbung mit Unterstützung von Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires ...

Die intraoperative chirurgische Monitoranalyse ist immer noch eine große Herausforderung bei Tumorresektionsoperationen, da sie ein diagnostisches Werkzeug erfordert, um die komplexe Exzision von Krebsgewebe genau und schnell zu bestätigen. Es ist dann möglich, wiederholte Operationen aufgrund eines positiven chirurgischen Randes zu vermeiden. Unsere Hochgeschwindigkeits-Ultraviolett-Photoakustikmikroskopie mit offenem Deck kann innerhalb von 18 Minuten markierte histologische Bilder von Gewebeproben mit einer Bildfläche von fünf mal fünf Millimeterquadraten liefern, was ein großes Potenzial für die intraoperative chirurgische Randanalyse zeigt.Das Verfahren wird Xiufeng Li demonstrieren, ein Doktorand im letzten Jahr aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Einstellung der optischen Beleuchtung für das mikroskopische System, indem Sie einen Q-Switch-diodengepumpten Festkörperlaser mit einer Wellenlänge von 266 Nanometern als Anregungsquelle verwenden. Installieren Sie zwei konvexe Linsen, um den Laserstrahl zu erweitern, und platzieren Sie ein Loch in der Nähe des Brennpunkts der ersten konvexen Linse für die räumliche Filterung.Verwenden Sie einen 1D-Galvanometerspiegel, um den Laserstrahl nach oben zu reflektieren. Fokussieren Sie mit Hilfe der Objektivlinse den Laserstrahl auf eine Probe. Befestigen Sie den ringförmigen, fokussierten UT mit dem aktiven Bereich nach oben in einen im Labor hergestellten Wassertank mit einem optisch transparenten Fenster an der Unterseite, das von einem dünnen Quarz-Deckglas bedeckt ist, und befestigen Sie den Wassertank dann an einem zweiachsigen manuellen Tisch des Mikroskops, um die seitliche Position des UT zu steuern. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den UV-Laser ein und passen Sie die Position des UT an, damit der Laserstrahl durch die Mitte des UT gehen kann, schalten Sie dann den UV-Laser aus und füllen Sie den Wassertank mit deionisiertem Wasser, um die UT vollständig einzutauchen. Schließen Sie den Ausgang des UT an zwei Verstärker an, um eine Gesamtverstärkung von 56 Dezibel zu erhalten, und schließen Sie dann den Ausgang des zweiten Verstärkers an eine im Computer installierte Datenerfassungskarte (DAQ) an.Als nächstes befestigen Sie einen Probenhalter an einem manuellen Z-Achsentisch, der mit xy-motorisierten Tischen verbunden ist, gefolgt von vier Stück doppelseitigem Klebeband, das das leere Loch des Probenhalters umgibt. Fahren Sie später fort, das System auszurichten, indem Sie schwarzes Klebeband an einem Glasobjektträger befestigen und dann den Glasträger platzieren, um das Loch des Probenhalters mit dem schwarzen Klebeband nach unten zu bedecken. Nachdem Sie den Glasträger auf den Probenhalter gedrückt haben, senken Sie den Probenhalter ab, um den Glasträger in das Wasser zu tauchen.Trennen Sie den ringförmigen UT und die Verstärker, schließen Sie dann den UT an den Pulser / Empfänger und den Ausgang des Pulsers / Empfängers an ein Oszilloskop an. Betreiben Sie den Pulser/Empfänger im Impulsechomodus mit der Pulsamplitude von sechs und der Verstärkung bei 20 Dezibel. Sobald die Parameter eingestellt sind, passen Sie die Z-Position des Probenhalters an und definieren Sie die Position der akustischen Brennebene, in der die Ultraschallsignale maximal sind.Wechseln Sie den Puls / Empfänger in den Übertragungsmodus, bevor Sie die Verstärkung auf 60 Dezibel einstellen, aktivieren Sie dann den Laserausgang und passen Sie die Z-Position der Objektivlinse an, um die vom Oszilloskop gemessenen photoakustischen oder PA-Signale zu maximieren. Um das erzeugte PA-Signal symmetrisch und maximal zu machen, passen Sie die laterale Position des ringförmigen UT an und passen Sie dann die z-Position des Probenhalters an, um die PA-Signale zu maximieren. Wiederholen Sie die Anpassungen für die Z-Position der Objektivlinse und des Probenhalters, um die Symmetrie und Amplitude der PA-Signale zu optimieren.Wenn die PA-Signale optimiert sind, zeichnen Sie die Zeitverzögerung oder die Zeit auf, die die PA-Wellen benötigen, um das UT auf dem Oszilloskop zu erreichen. Bewegen Sie den Probenhalter, um verschiedene Positionen des schwarzen Bandes abzubilden. Stellen Sie die Ebenheit der Probenhalter so ein, dass die von jeder Position des schwarzen Bandes erzeugten PA-Signale die gleiche Zeitverzögerung aufweisen wie die zuvor gemessene.Nachdem die Systemausrichtung abgeschlossen ist, schalten Sie den Laser aus und schließen Sie den UT an die beiden Verstärker an. Um eine formalinfixierte und paraffineingebettete Maus-Gehirnscheibe vorzubereiten, fixierte das geerntete Gehirn in 10% neutrales gepuffertes Formalin. Nach 24 Stunden das fixierte Gehirn durch Dehydrierung mit abgestuftem Alkohol, Clearing mit Xylol und Einbettung mit Paraffin verarbeiten.Verwenden Sie ein Mikrotom, um fünf Mikrometer dicke Scheiben des eingebetteten Gehirns zu erhalten. Legen Sie die Probenscheiben auf die Quarzobjektträger, um sie eine Stunde lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius zu trocknen. Später deparaffinisieren Sie die Gehirnabschnitte mit einem Clearing-Mittel, um hohe Hintergrundsignale von Paraffin zu vermeiden.Um eine frische Mäusegehirnscheibe vorzubereiten, waschen Sie das geerntete Mäusegehirn mit PBS und schneiden Sie dann eine fünf Millimeter dicke Scheibe der Gehirnprobe von Hand, gefolgt von einem Waschen der Gehirnscheibe mit PBS, um das Blut am Querschnitt zu entfernen. Bereiten Sie für die Probenplatzierung einen im Labor hergestellten Probentank mit einer UV-transparenten Polyethylenmembran mit einer Dicke von 10 Mikrometern vor, fügen Sie dann einen Tropfen Wasser zur Membran hinzu und legen Sie die biologische Probe auf den Probentank, um das Wasser abzudecken. Als nächstes legen Sie den probenhaltigen Tank auf den Probenhalter und stellen Sie sicher, dass das leere Loch des Probenhalters abgedeckt ist.Stellen Sie den UV-Laser in den externen Triggermodus und verwenden Sie das im Labor entwickelte Laboransichtsprogramm, um die Scanparameter wie im Manuskript beschrieben einzustellen. Starten Sie den Testscan in einem kleinen Bereich, indem Sie die Anzahl der beweglichen Schritte der x- und y-Achsenmotoren einstellen und dann den manuellen Z-Achsentisch so einstellen, dass die Probe auf der Brennebene platziert wird, um maximale PA-Signale zu erhalten. Nachdem Sie sowohl x- als auch y-Achsenmotoren zum gewünschten Startpunkt bewegt und den Scanbereich durch Einstellen der xn- und yn-Werte eingestellt haben, starten Sie das Bildaufnahmeprogramm.Wenn die Bilder benötigt werden, schalten Sie den Laser aus und entfernen Sie den Probenhalter. Lagern Sie frisches biologisches Gewebe in 10% neutralem gepuffertem Formalin. Verwenden Sie die gesammelten PA-Signale, um das Projektionsbild mit maximaler Amplitude mit Hilfe eines im Labor entwickelten Bildverarbeitungsalgorithmus zu rekonstruieren.Die repräsentative Analyse zeigt die UV-PAM- und H&E-Bilder eines FFPE-Maus-Gehirnschnitts. Im vergrößerten UV-PAM-Bild konnten die einzelnen Zellkerne aufgelöst werden. Die entsprechenden Zellkerne wurden in den standardmäßigen H&E-gefärbten Bildern gefunden, was die hohe Genauigkeit des aktuellen Systems für die zelluläre Bildgebung zeigt.Ein Deep-Learning-Algorithmus wurde angewendet, um das Graustufen-UV-PAM-Bild in ein virtuelles H&E-gefärbtes Bild zu übertragen. Es ist wichtig, die Position des ringförmigen Ultraschallwandlers so einzustellen, dass das UV-Licht während der Systemausrichtung durch ein Zentrum strömen kann. Dadurch wird sichergestellt, dass ein detektierbares photoakustisches Signal erhalten und weiter optimiert werden kann, wenn der Laser eingeschaltet ist.Unser Klassifikationsalgorithmus kann weiter integriert werden, um Tumor- und Normalregionen in den Bildern zu klassifizieren und dient als assistive Bildgebung und diagnostische Plattform für medizinisches Fachpersonal.

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Hochgeschwindigkeits-Ultraviolett-Photoakustikmikroskopie für die histologische Bildgebung mit virtueller Färbung mit Unterstützung von Deep Learning (Video) | JoVE Journal

Hochgeschwindigkeits-Ultraviolett-Photoakustikmikroskopie für die histologische Bildgebung mit virtueller Färbung mit Unterstützung von Deep Learning

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