Name: Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie der optimierte SiMPull-Assay die Proteinphosphorylierung auf Einzelmolekülebene quantifiziert. Diese Methode reduziert Autofluoreszenz und liefert robuste Analysealgorithmen für die Biochemie.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 und R01CA248166 zu DSL unterstützt. EMB wurde durch das ASERT-IRACDA-Programm (NIH K12GM088021) und JAR durch das UNM MARC-Programm (NIH 2T34GM008751-20) unterstützt. Wir danken der Verwendung der gemeinsamen Ressource der Fluoreszenzmikroskopie der University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, die von NIH P30CA118100 unterstützt wird. Wir möchten Dr. Ankur Jain und Dr. Taekijip Ha würdigen, deren ursprüngliche Entwicklung von SiMPull diese Arbeit inspiriert hat. ES-C anwesende Adresse: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um quantitative Messungen der Rezeptorphosphorylierung auf Einzelproteinebene zu ermöglichen. Es wurden mehrere einfache, aber wichtige Modifikationen am SiMPull-Protokoll entwickelt, die die Zuverlässigkeit der Messung für den Phospho-Tyrosin-Nachweis verbesserten, einschließlich der Verringerung der Autofluoreszenz mit NaBH4-Behandlung und Nachfixierung der Probe, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern. Die Verwendung der grünen Kanalmaske zur Identifizi...

Die membranassoziierte Signalgebung wird durch eine Kombination aus Ligand-induzierter Membranrezeptoraktivierung und Rekrutierung von nachgeschalteten akzessorischen Proteinen, die das Signal verbreiten, abgestimmt. Die Phosphorylierung von Schlüsseltyrosinen in rezeptorzytoplasmatischen Schwänzen ist entscheidend für die Einleitung der Bildung von Signalkomplexen oder Signalosomen 1,2. Daher ist eine wichtige Frage in der Biologie, wie Phosphorylierungsmuster erzeugt und aufrechterhalten werden, um Signalpartner zu rekrutieren und zelluläre Ergebnisse zu diktieren. Dazu gehört das Verständnis der Heterogenität der Rezeptorphosphorylierung, sowohl im Überfluss als auch in den spezifischen Phosphotyrosinmustern, die ein Mittel zur Manipulation der Signalausgänge bieten können, indem sie die Zusammensetzung des Signalosoms 3,4,5,6,7 diktieren. Es gibt jedoch Einschränkungen in den derzeitigen Methoden zur Abfrage der Proteinphosphorylierung. Die Western-Blot-Analyse eignet sich hervorragend zur Beschreibung von Trends der Proteinphosphorylierung, ist jedoch semi-quantitativ8 und liefert keine Informationen über die Heterogenität des Systems, da Tausende bis Millionen von Rezeptoren zusammen gemittelt werden. Während westliche Blots die Untersuchung einer Probe mit Phospho-spezifischen Antikörpern gegen bestimmte Tyrosine ermöglichen, können sie keine Informationen über Multisite-Phosphorylierungsmuster innerhalb desselben Proteins liefern. Quantitative Phosphoproteomiken berichten über die Phosphotyrosin-Häufigkeit, aber es gibt Einschränkungen beim Nachweis der Multisite-Phosphorylierung, da sich die interessierenden Reste innerhalb desselben Peptids (typischerweise 7-35 Aminosäuren) befinden müssen, das durch enzymatische Verdauung erzeugt wird 9,10,11.
Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, wurde der Einzelmolekül-Pull-Down-Assay (SiMPull) angepasst, um die Phosphorylierungszustände intakter Rezeptoren auf Einzelmolekülebene zu quantifizieren. SiMPull wurde erstmals von Jain et al.12,13 als leistungsfähiges Werkzeug zur Befragung makromolekularer Komplexe demonstriert. In SiMPull wurden makromolekulare Komplexe immunpräzipitiert (IP) auf Antikörper-funktionalisierten Glasdeckgläsern und dann durch Einzelmolekülmikroskopie auf Proteinuntereinheitennummer und Co-IP mit komplexen Komponentenanalysiert 12. Eine Modifikation von Kim et al.14, genannt SiMBlot, war die erste, die eine Variation von SiMPull verwendete, um die Phosphorylierung von denaturierten Proteinen zu analysieren. Das SiMBlot-Protokoll beruht auf der Erfassung biotinylierter Zelloberflächenproteine unter Verwendung von NeutrAvidin-beschichteten Deckgläsern, die dann zur Phosphorylierung mit Phospho-spezifischer Antikörpermarkierunguntersucht werden 14. Trotz dieser Fortschritte waren Verbesserungen erforderlich, um die Quantifizierung der posttranslationalen Modifikation robuster und auf ein breiteres Spektrum von Proteinen anwendbarer zu machen.
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen optimierten SiMPull-Ansatz, der verwendet wurde, um Phosphorylierungsmuster des intakten epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) als Reaktion auf eine Reihe von Ligandenbedingungen und onkogenen Mutationen zu quantifizieren15. Während sich diese Arbeit auf EGFR konzentriert, kann dieser Ansatz auf jeden Membranrezeptor und zytosolische Proteine von Interesse (POI) angewendet werden, für die hochwertige Antikörper verfügbar sind. Das Protokoll umfasst Schritte zur Reduzierung der Probenautofluoreszenz, ein Probenarray-Design, das ein minimales Probenvolumen bei gleichzeitiger Vorbereitung von bis zu 20 Proben erfordert, und die Optimierung der Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen. Datenanalysealgorithmen wurden für den Einzelmolekülnachweis und die Quantifizierung phosphorylierter Proteine entwickelt.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Puffer</td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschale</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Lagerung von Piranhas geätztem Glas/Arrays</td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd wässrig Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td></td><td></td><td>Funktionalisierte Glaslagerung / KOH-Wiederverwendung</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>Lyse Pufferkomponente</td></tr><tr><td>60 mm Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% Glutaraldehyd wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16020</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Aceton (C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>Tierversuchsfreies rekombinantes humanes EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-EGFR (externe Domäne) &ndash; Biotin</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p-Tyr Antikörper (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bad-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Buchner Trichter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Konischer Filterkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 x 60 #1,5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>emCCD-Kamera</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>Hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Fusion 360 Software</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfat</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Gefährlich</td></tr><tr><td>Serologische Glaspipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasrührstab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukose (D-(+)-Glukose)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode-Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Halt Phosphotase und Proteasehemmer Cocktail (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Lysepufferkomponente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Tyrode's Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Lysepufferkomponente</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophober Barrierestift</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F Immersionsöl</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>hauseigene Vakuumleitung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Magnessiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox und Statistics and Machine Learning</td></tr><tr><td>Toolbox Methanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Milli-Q-Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF Farbstoff-Antikörpermarkierungskits</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Empfohlenes Konjugationskit</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-Succinimidylvalerat, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Nanogrid</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotin Binding Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoff (Druckgas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA GPU mit CUDA</td><td></td><td></td><td>Kompatibilität bei https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Olympus iX71 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Siegelfolie</td><td>Das Labor Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Analoge Heizplatte</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-EGF-Rezeptor (Tyr1068) (1H12) Maus mAb</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Premium PLA Filament, 1,75 mm Durchmesser</td><td>Raise 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>Drucktemperaturbereich: 205-235 &deg; C</td></tr><tr><td>Pro2 3D-Drucker</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L Becherglas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 mL Vorratsflaschen</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>CH3OH/C3H6O Wiederverwendung</td></tr><tr><td>Pyrex 250 mL Becher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 4 L Becher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quad-view Bild Splitter</td><td>Photometrie</td><td>Modell QV2</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount Zellzähler, EVE Zellzählobjektträger</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Semrock Emissionsfilter: blau (445/45 nm), grün (525/45 nm), rot (600/37 nm), dunkelrot (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipettiersteuerung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>zerschlagen Einzelmolekül-Analysepaket</td><td></td><td></td><td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Natriumborhydrid (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Durch sukzessive Wärme- und pH-Zyklen aktivieren</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat (Na3VO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td>Gefährliche</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>Gefährliche</td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikrosphären</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>Multifluoreszenzkügelchen</td></tr><tr><td>Tris (Trizma) Base</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau Färbung, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

ein optimierter einzelmolekül-pulldown-assay zur quantifizierung der proteinphosphorylierung

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Die Phosphorylierung ist eine notwendige posttranslationale Modifikation, die die Proteinfunktion reguliert und die Ergebnisse der Zellsignalisierung steuert. Aktuelle Methoden zur Messung der Proteinphosphorylierung können die Heterogenität der Phosphorylierung über einzelne Proteine hinweg nicht erhalten. Der Einzelmolekül-Pulldown-Assay (SiMPull) wurde entwickelt, um die Zusammensetzung makromolekularer Komplexe durch Immunpräzipitation von Proteinen auf einem Glasdeckglas zu untersuchen, gefolgt von Einzelmolekül-Bildgebung. Die aktuelle Technik ist eine Adaption von SiMPull, die eine robuste Quantifizierung des Phosphorylierungszustands von Membranrezeptoren in voller Länge auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die Abbildung von Tausenden von einzelnen Rezeptoren auf diese Weise ermöglicht die Quantifizierung von Proteinphosphorylierungsmustern. Das vorliegende Protokoll beschreibt das optimierte SiMPull-Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Bildgebung. Die Optimierung von Glaspräparations- und Antikörperfixierungsprotokollen verbessert die Datenqualität weiter. Das aktuelle Protokoll liefert Code für die Einzelmolekül-Datenanalyse, die den Anteil der in einer Probe phosphorylierten Rezeptoren berechnet. Während sich diese Arbeit auf die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) konzentriert, kann das Protokoll auf andere Membranrezeptoren und zytosolische Signalmoleküle verallgemeinert werden.

Ein Cartoon, der den SiMPull-Prozess darstellt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Deckgläser werden mit NeutrAvidin als Anker für biotinylierte Anti-EGFR-Antikörper funktionalisiert, um EGFR-GFP aus dem Gesamtprotein Lysate zu gewinnen. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Protein werden die phosphorylierten Rezeptoren mit einem Anti-Phosphotyrosin (Anti-PY)-Antikörper 15 markiert. Abbildung 1B zeigt ein Bild des hydrophoben Arrays, in dem ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Dieses SiMPull-Protokoll ermöglicht eine Quantifizierung der Proteinphosphorylierung, indem es die Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen verbessert, die Autofluoreszenz im grünen Kanal reduziert und robuste Einzelmolekülanalysealgorithmen bereitstellt. Der Hauptvorteil von SiMPull besteht darin, dass wir den Phosphorylierungsstatus einzelner intakter Proteine abfragen können. Mit dieser Methode können wir neue Informationen gewinnen, die durch traditionelle Techniken wie Western Blotting und Mass Spec Analysis nicht zugänglich sind.Wir haben ein Team von Forschern, die helfen, das Protokoll zu demonstrieren. Zunächst wird Julian Rojo zeigen, wie man das Deckglas piranha ätzt. Rachel Grattan zeigt dann die Schritte zur Beschichtung des Deckglases.Und Elizabeth Bailey wird zeigen, wie man das Array und die Bildproben zeichnet. Zu Beginn ätzen Piranha die Deckblätter, indem Sie das Reaktionsbecherglas alle fünf Minuten für 30 Minuten vorsichtig rühren. Neutralisierte die Piranha-Lösung, indem allmählich eine schwache Basis hinzugefügt wurde.Mit einem Glasstab die geätzten Abdeckschlüsse in einen Buchner-Trichter geben und fünf Minuten in doppelt destilliertem Wasser abspülen. Legen Sie dann die Abdeckscheine in ein Coplin-Glas aus Glas und bedecken Sie sie mit Methanol. Verschließen Sie den Deckel 10 Minuten lang mit einer Dichtungsfolie und einem Badbeschallungsgetränk.Nach der Beschallung das Methanol in eine Glasvorratsflasche entleeren. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Aceton. Spülen Sie die Deckblätter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser im Coplin-Glas ab.Lassen Sie das Wasser aus den Deckblättern ab und trocknen Sie es, indem Sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners winken. Legen Sie die Deckblätter in ein trockenes Coplin-Glas. Fügen Sie dann Aminosilanlösung in das Coplin-Glas hinzu, um eine Aminosilanisierung des Deckschlupfs durchzuführen.Decken Sie eine Dichtungsfolie ab und tragen Sie sie zum Schutz vor Licht auf. Spülen Sie die Deckgläser mit Methanol aus und entsorgen Sie die gebrauchte Lösung. Spülen Sie die Deckblätter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser für jeweils zwei Minuten ab.Überschüssige Feuchtigkeit abtupfen und 10 Minuten lang vollständig an der Luft trocknen. Als nächstes zeichnen Sie das Gitterarray mit einem hydrophoben Barrierestift. Markieren Sie eine Kennung auf dem Deckblatt, um die richtige Ausrichtung zu identifizieren.Nachdem die Tinte getrocknet ist, legen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer. Resuspendiert 153 Milligramm mPEG und 3,9 Milligramm Biotin-PEG in 609 Mikrolitern 10 Millimolar Natriumbicarbonat und Vortex. Zentrifen Sie bei 10.000 x g ab einer Minute bei Raumtemperatur, um Blasen zu entfernen.Tragen Sie 10 bis 15 Mikroliter dieser Lösung pro Quadrat auf, um das Array vollständig abzudecken, ohne zu überlaufen. Lagern Sie die Deckelgleiten im Dunkeln drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur in die Feuchtigkeitskammer. Waschen Sie dann die Deckgläser, indem Sie sie 10 Sekunden lang nacheinander in drei Bechergläser tauchen, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt sind.Entfernen Sie die gesamte Feuchtigkeit aus den Deckgläsern mit Stickstoffgas. Lagern Sie die Deckelschlitten Rücken an Rücken in einem 50 Milliliter konischen Röhrchen, das mit Stickstoff gefüllt ist, und verschließen Sie es mit einer Dichtfolie. Umwickeln Sie das Rohr mit Siegelfolie und legen Sie es auf minus 20 Grad Celsius.Entfernen Sie die funktionalisierten Biotin-PEG-Arrays aus dem Gefrierschrank und gleichen Sie sie auf Raumtemperatur aus. Legen Sie den Deckbeleg mit dem Array nach oben über eine 100 Millimeter große Gewebekulturschale, die mit Siegelfolie ausgekleidet ist. Inkubieren Sie jedes Quadrat des Arrays mit 10 Milligramm pro Milliliter Natriumborhydrid in PBS für vier Minuten bei Raumtemperatur.Dreimal mit PBS waschen. Als nächstes mit 0,2 Milligramm pro Milliliter NeutrAvidin in T50 für fünf Minuten inkubieren, gefolgt von dreimal Waschen mit T50 BSA. Wiederholen Sie die Inkubation mit zwei Mikrogramm pro Milliliter biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50 BSA für 10 Minuten, gefolgt von Waschen.Zuerst das Lysat durch Pipettieren auftauen. Verdünnen Sie einen Mikroliter des Lysats in 100 Mikroliter eiskaltes T50 BSA PPI. Inkubieren Sie das Lysat auf dem Array für 10 Minuten, gefolgt von Waschen.Bereiten Sie AF647 konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper in eiskaltem T50 BSA PPI vor und inkubieren Sie eine Stunde lang auf dem Array. Deponieren Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel. Platzieren Sie das Nanogitter zur Bildgebung auf der Bühne.Konzentrieren Sie sich mit durchgelassenem weißem Licht auf das Gittermuster. Erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern des Rasters, stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind, und speichern Sie die Bildserie als treuhänderisch. Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein luftiges Muster zu erzeugen, erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern für Verstärkungskalibrierungen und speichern Sie das Bild als Verstärkung.Erfassen Sie dann eine Reihe von 20 Bildern für den Kamera-Offset, indem Sie das gesamte Licht der Kamera blockieren und den Hintergrund der Bilder speichern. Um einfache Bilder zu erhalten, reinigen Sie zuerst das Ölobjektiv und lagern Sie zusätzliches Öl auf das Objektiv auf. Befestigen Sie das Deckglasarray auf der Mikroskopstufe.Erfassen Sie Bilder für jede Probe, zuerst im fernroten Kanal, gefolgt von Fluorophoren mit niedrigerer Wellenlänge. Überprüfen Sie den Pufferstand alle 30 bis 45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf. Mit dieser Technik wurde EGFR-GFP aus Gesamtproteinlysaten gewonnen.Die Autofluoreszenz der hydrophoben Tinte wurde als Leitfaden verwendet, um die Brennebene der Probe zu finden. Rohdatenbilder wurden mit Spektralkanälen aufgenommen, die auf dem Kamerachip getrennt waren. Eine Überlagerung der grünen und fernroten Kanäle wurde für die Datenerfassung weiter untersucht.Die Kanalregistrierung wurde auf Bildern durchgeführt, die aus dem Nanogitter aufgenommen wurden. Eine Überlagerung von Treuhandbildern zeigte eine unvollständige Registrierung. Die Ausrichtung erfolgte durch Anwendung einer lokalen gewichteten Mittelwerttransformation auf die fernroten und grünen Kanalkoordinaten, die zur Registrierung der nachfolgenden SiMPull-Daten verwendet wurde.Einzelne Emitter über der Hintergrundphotonenzahl der GFP- und AF647-Kanäle wurden geboxt und eine Gaußsche Lokalisierung durchgeführt, um die Standorte zu identifizieren. Die Kolokalisation von EGFR-GFP in einem F647 wurde durchgeführt, um phosphorylierte Rezeptoren zu identifizieren. Und der Prozentsatz der Kolokalisation wurde verwendet, um den Anteil der phosphorylierten Rezeptoren zu bestimmen.Hintergrunddetektionen wurden reduziert, wenn Piranha-geätztes Glas mit Natriumborhydrid behandelt wurde. Eine robuste Bindung von EGFR-GFP im Lysat wurde mit minimaler unspezifischer PY99-AF647-Bindung beobachtet, die eine Beibehaltung der Oberflächenfunktionalisierung mit dieser Technik zeigt. SiMPull liefert Informationen über die Proteinphosphorylierung und kann eine breite Palette von Selbstsignalfragen beantworten.Dies kann unser Verständnis der Signalgebung sowohl im Normal- als auch im Krankheitszustand verbessern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Video demonstriert eine empfindliche Quantifizierungstechnik der Proteinphosphorylierung mit einem Einzelmolekül-Pull-Down-Assay. Die Funktionalisierung von Polyethylenglykol-Biotin und die Verwendung von markierten Antikörpern erhöht den Nachweis von phosphoryliertem Tyrosin mit Spezifität.

Einzelmolekül-Pull-Down-Assay für die Proteinphosphorylierungsanalyse: Eine Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung in Zelllysat

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Wir berichten und demonstrieren einen optimierten Nitrocellulose-Bindungsassay, der zur Quantifizierung der Autophosphorylierung von gereinigten bakteriellen Histidinkinasen verwendet werden kann. Unsere Methode hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen SDS-PAGE-basierten Techniken und stellt eine wertvolle Alternative zur Charakterisierung dieser wichtigen Proteine dar.

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

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Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

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Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung von endogenen Phosphoproteinphosphatasen und ihren interagierenden Proteinen aus Zellen und Geweben und deren Identifizierung und Quantifizierung durch massenspektrometriebasierte Proteomik vor.

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Erfahren Sie, wie der optimierte SiMPull-Assay die Proteinphosphorylierung auf Einzelmolekülebene quantifiziert. Diese Methode reduziert Autofluoreszenz und liefert robuste Analysealgorithmen für die Biochemie.

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

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