Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung
6. Juni 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).
Dieses SiMPull-Protokoll ermöglicht eine Quantifizierung der Proteinphosphorylierung, indem es die Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen verbessert, die Autofluoreszenz im grünen Kanal reduziert und robuste Einzelmolekülanalysealgorithmen bereitstellt. Der Hauptvorteil von SiMPull besteht darin, dass wir den Phosphorylierungsstatus einzelner intakter Proteine abfragen können. Mit dieser Methode können wir neue Informationen gewinnen, die durch traditionelle Techniken wie Western Blotting und Mass Spec Analysis nicht zugänglich sind.
Wir haben ein Team von Forschern, die helfen, das Protokoll zu demonstrieren. Zunächst wird Julian Rojo zeigen, wie man das Deckglas piranha ätzt. Rachel Grattan zeigt dann die Schritte zur Beschichtung des Deckglases.
Und Elizabeth Bailey wird zeigen, wie man das Array und die Bildproben zeichnet. Zu Beginn ätzen Piranha die Deckblätter, indem Sie das Reaktionsbecherglas alle fünf Minuten für 30 Minuten vorsichtig rühren. Neutralisierte die Piranha-Lösung, indem allmählich eine schwache Basis hinzugefügt wurde.
Mit einem Glasstab die geätzten Abdeckschlüsse in einen Buchner-Trichter geben und fünf Minuten in doppelt destilliertem Wasser abspülen. Legen Sie dann die Abdeckscheine in ein Coplin-Glas aus Glas und bedecken Sie sie mit Methanol. Verschließen Sie den Deckel 10 Minuten lang mit einer Dichtungsfolie und einem Badbeschallungsgetränk.
Nach der Beschallung das Methanol in eine Glasvorratsflasche entleeren. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Aceton. Spülen Sie die Deckblätter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser im Coplin-Glas ab.
Lassen Sie das Wasser aus den Deckblättern ab und trocknen Sie es, indem Sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners winken. Legen Sie die Deckblätter in ein trockenes Coplin-Glas. Fügen Sie dann Aminosilanlösung in das Coplin-Glas hinzu, um eine Aminosilanisierung des Deckschlupfs durchzuführen.
Decken Sie eine Dichtungsfolie ab und tragen Sie sie zum Schutz vor Licht auf. Spülen Sie die Deckgläser mit Methanol aus und entsorgen Sie die gebrauchte Lösung. Spülen Sie die Deckblätter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser für jeweils zwei Minuten ab.
Überschüssige Feuchtigkeit abtupfen und 10 Minuten lang vollständig an der Luft trocknen. Als nächstes zeichnen Sie das Gitterarray mit einem hydrophoben Barrierestift. Markieren Sie eine Kennung auf dem Deckblatt, um die richtige Ausrichtung zu identifizieren.
Nachdem die Tinte getrocknet ist, legen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer. Resuspendiert 153 Milligramm mPEG und 3,9 Milligramm Biotin-PEG in 609 Mikrolitern 10 Millimolar Natriumbicarbonat und Vortex. Zentrifen Sie bei 10.000 x g ab einer Minute bei Raumtemperatur, um Blasen zu entfernen.
Tragen Sie 10 bis 15 Mikroliter dieser Lösung pro Quadrat auf, um das Array vollständig abzudecken, ohne zu überlaufen. Lagern Sie die Deckelgleiten im Dunkeln drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur in die Feuchtigkeitskammer. Waschen Sie dann die Deckgläser, indem Sie sie 10 Sekunden lang nacheinander in drei Bechergläser tauchen, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt sind.
Entfernen Sie die gesamte Feuchtigkeit aus den Deckgläsern mit Stickstoffgas. Lagern Sie die Deckelschlitten Rücken an Rücken in einem 50 Milliliter konischen Röhrchen, das mit Stickstoff gefüllt ist, und verschließen Sie es mit einer Dichtfolie. Umwickeln Sie das Rohr mit Siegelfolie und legen Sie es auf minus 20 Grad Celsius.
Entfernen Sie die funktionalisierten Biotin-PEG-Arrays aus dem Gefrierschrank und gleichen Sie sie auf Raumtemperatur aus. Legen Sie den Deckbeleg mit dem Array nach oben über eine 100 Millimeter große Gewebekulturschale, die mit Siegelfolie ausgekleidet ist. Inkubieren Sie jedes Quadrat des Arrays mit 10 Milligramm pro Milliliter Natriumborhydrid in PBS für vier Minuten bei Raumtemperatur.
Dreimal mit PBS waschen. Als nächstes mit 0,2 Milligramm pro Milliliter NeutrAvidin in T50 für fünf Minuten inkubieren, gefolgt von dreimal Waschen mit T50 BSA. Wiederholen Sie die Inkubation mit zwei Mikrogramm pro Milliliter biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50 BSA für 10 Minuten, gefolgt von Waschen.
Zuerst das Lysat durch Pipettieren auftauen. Verdünnen Sie einen Mikroliter des Lysats in 100 Mikroliter eiskaltes T50 BSA PPI. Inkubieren Sie das Lysat auf dem Array für 10 Minuten, gefolgt von Waschen.
Bereiten Sie AF647 konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper in eiskaltem T50 BSA PPI vor und inkubieren Sie eine Stunde lang auf dem Array. Deponieren Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel. Platzieren Sie das Nanogitter zur Bildgebung auf der Bühne.
Konzentrieren Sie sich mit durchgelassenem weißem Licht auf das Gittermuster. Erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern des Rasters, stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind, und speichern Sie die Bildserie als treuhänderisch. Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein luftiges Muster zu erzeugen, erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern für Verstärkungskalibrierungen und speichern Sie das Bild als Verstärkung.
Erfassen Sie dann eine Reihe von 20 Bildern für den Kamera-Offset, indem Sie das gesamte Licht der Kamera blockieren und den Hintergrund der Bilder speichern. Um einfache Bilder zu erhalten, reinigen Sie zuerst das Ölobjektiv und lagern Sie zusätzliches Öl auf das Objektiv auf. Befestigen Sie das Deckglasarray auf der Mikroskopstufe.
Erfassen Sie Bilder für jede Probe, zuerst im fernroten Kanal, gefolgt von Fluorophoren mit niedrigerer Wellenlänge. Überprüfen Sie den Pufferstand alle 30 bis 45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf. Mit dieser Technik wurde EGFR-GFP aus Gesamtproteinlysaten gewonnen.
Die Autofluoreszenz der hydrophoben Tinte wurde als Leitfaden verwendet, um die Brennebene der Probe zu finden. Rohdatenbilder wurden mit Spektralkanälen aufgenommen, die auf dem Kamerachip getrennt waren. Eine Überlagerung der grünen und fernroten Kanäle wurde für die Datenerfassung weiter untersucht.
Die Kanalregistrierung wurde auf Bildern durchgeführt, die aus dem Nanogitter aufgenommen wurden. Eine Überlagerung von Treuhandbildern zeigte eine unvollständige Registrierung. Die Ausrichtung erfolgte durch Anwendung einer lokalen gewichteten Mittelwerttransformation auf die fernroten und grünen Kanalkoordinaten, die zur Registrierung der nachfolgenden SiMPull-Daten verwendet wurde.
Einzelne Emitter über der Hintergrundphotonenzahl der GFP- und AF647-Kanäle wurden geboxt und eine Gaußsche Lokalisierung durchgeführt, um die Standorte zu identifizieren. Die Kolokalisation von EGFR-GFP in einem F647 wurde durchgeführt, um phosphorylierte Rezeptoren zu identifizieren. Und der Prozentsatz der Kolokalisation wurde verwendet, um den Anteil der phosphorylierten Rezeptoren zu bestimmen.
Hintergrunddetektionen wurden reduziert, wenn Piranha-geätztes Glas mit Natriumborhydrid behandelt wurde. Eine robuste Bindung von EGFR-GFP im Lysat wurde mit minimaler unspezifischer PY99-AF647-Bindung beobachtet, die eine Beibehaltung der Oberflächenfunktionalisierung mit dieser Technik zeigt. SiMPull liefert Informationen über die Proteinphosphorylierung und kann eine breite Palette von Selbstsignalfragen beantworten.
Dies kann unser Verständnis der Signalgebung sowohl im Normal- als auch im Krankheitszustand verbessern.
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Übersicht
Dieses SiMPull-Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Proteinphosphorylierung durch Verbesserung der Antikörpermarkierung und der Fixierungsbedingungen. Es reduziert die Autofluoreszenz im grünen Kanal und bietet robuste Einzelmolekülanalyse-Algorithmen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Proteinanalyse
Hintergrund
- Proteinphosphorylierung ist eine kritische post-translationale Modifikation.
- Traditionelle Techniken wie Western Blotting und Massenspektrometrie haben Einschränkungen.
- Einzelmolekülanalyse bietet neuartige Einblicke in das Proteinverhalten.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Genauigkeit der Phosphorylierungsquantifizierung zu verbessern.
Zweck der Studie
- Quantifizierung der Proteinphosphorylierung auf Einzelmolekülebene.
- Verbesserung der Zuverlässigkeit von Antikörpermarkierung und Fixierung.
- Bereitstellung einer Methode, die traditionelle Analysetechniken übertrifft.
Verwendete Methoden
- Einzelmolekül-Pull-down (SiMPull) Assay.
- Verbesserte Antikörpermarkierungstechniken.
- Optimierte Fixierungsbedingungen zur Reduzierung der Autofluoreszenz.
- Robuste Einzelmolekülanalyse-Algorithmen.
Hauptergebnisse
- Verbesserte Quantifizierung der Proteinphosphorylierung.
- Erfolgreiche Reduzierung der Autofluoreszenz im grünen Kanal.
- Demonstration des Protokolls durch ein Forscherteam.
- Fähigkeit, den Phosphorylierungsstatus einzelner Proteine zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Das SiMPull-Protokoll bietet einen bedeutenden Fortschritt in der Proteinanalyse.
- Es ermöglicht detaillierte Einblicke in die Phosphorylierung, die zuvor nicht zugänglich waren.
- Diese Methode könnte traditionelle Techniken in spezifischen Anwendungen ersetzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantifying protein phosphorylation at the single-molecule level addresses a critical gap in understanding signaling heterogeneity and mechanistic pathway activation in drug discovery. The optimized SiMPull assay enables robust, quantitative assessment of receptor phosphorylation, supporting predictive confidence in target validation and early discovery decisions. This capability enhances portfolio triage by providing high-resolution data on posttranslational modifications relevant to disease biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of phosphorylation status for individual membrane receptors, clarifying pathway activation.
- Supports biological de-risking by revealing heterogeneity in posttranslational modification across protein populations.
- Improves predictive confidence for target engagement and functional validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative single-molecule readouts for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions through optimized antibody labeling and fixation protocols.
- Facilitates reproducible, scalable quantification of phosphorylation for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phosphorylation measurements with disease-relevant signaling pathways for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative modification data.
Pipeline & Workflow Integration
The SiMPull assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for quantitative posttranslational analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying phosphorylation at the single-molecule level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides robust statistical measurements of phosphorylation fractions across thousands of receptors.
- Translational Research: Enables alignment of signaling data with disease models for biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable protocol adaptable to diverse membrane receptors and signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of phosphorylation assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-resolution modification data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule imaging and quantitative data analysis.
- Demands specialized instrumentation for fluorescence imaging and robust computational infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of antibody labeling and fixation protocols.
- Adaptable to various model systems with protocol optimization for different protein targets.
- Practical limitations include the need for high-quality reagents and careful control of autofluorescence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Coverslip Preparation
3:18
Functionalization of Array with Biotinylated Antibody
4:09
SiMPull of Proteins of Interest from Whole-Cell Lysates
4:40
Image Acquisition
5:45
Results: Capture of EGFR-GFP from Protein Lysates Using SiMPull
7:19
Conclusion
