Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Dieses SiMPull-Protokoll ermöglicht eine Quantifizierung der Proteinphosphorylierung, indem es die Antikörpermarkierungs- und Fixierungsbedingungen verbessert, die Autofluoreszenz im grünen Kanal reduziert und robuste Einzelmolekülanalysealgorithmen bereitstellt. Der Hauptvorteil von SiMPull besteht darin, dass wir den Phosphorylierungsstatus einzelner intakter Proteine abfragen können. Mit dieser Methode können wir neue Informationen gewinnen, die durch traditionelle Techniken wie Western Blotting und Mass Spec Analysis nicht zugänglich sind.

Wir haben ein Team von Forschern, die helfen, das Protokoll zu demonstrieren. Zunächst wird Julian Rojo zeigen, wie man das Deckglas piranha ätzt. Rachel Grattan zeigt dann die Schritte zur Beschichtung des Deckglases.

Und Elizabeth Bailey wird zeigen, wie man das Array und die Bildproben zeichnet. Zu Beginn ätzen Piranha die Deckblätter, indem Sie das Reaktionsbecherglas alle fünf Minuten für 30 Minuten vorsichtig rühren. Neutralisierte die Piranha-Lösung, indem allmählich eine schwache Basis hinzugefügt wurde.

Mit einem Glasstab die geätzten Abdeckschlüsse in einen Buchner-Trichter geben und fünf Minuten in doppelt destilliertem Wasser abspülen. Legen Sie dann die Abdeckscheine in ein Coplin-Glas aus Glas und bedecken Sie sie mit Methanol. Verschließen Sie den Deckel 10 Minuten lang mit einer Dichtungsfolie und einem Badbeschallungsgetränk.

Nach der Beschallung das Methanol in eine Glasvorratsflasche entleeren. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Aceton. Spülen Sie die Deckblätter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser im Coplin-Glas ab.

Lassen Sie das Wasser aus den Deckblättern ab und trocknen Sie es, indem Sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners winken. Legen Sie die Deckblätter in ein trockenes Coplin-Glas. Fügen Sie dann Aminosilanlösung in das Coplin-Glas hinzu, um eine Aminosilanisierung des Deckschlupfs durchzuführen.

Decken Sie eine Dichtungsfolie ab und tragen Sie sie zum Schutz vor Licht auf. Spülen Sie die Deckgläser mit Methanol aus und entsorgen Sie die gebrauchte Lösung. Spülen Sie die Deckblätter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser für jeweils zwei Minuten ab.

Überschüssige Feuchtigkeit abtupfen und 10 Minuten lang vollständig an der Luft trocknen. Als nächstes zeichnen Sie das Gitterarray mit einem hydrophoben Barrierestift. Markieren Sie eine Kennung auf dem Deckblatt, um die richtige Ausrichtung zu identifizieren.

Nachdem die Tinte getrocknet ist, legen Sie die Deckgläser in eine befeuchtete Kammer. Resuspendiert 153 Milligramm mPEG und 3,9 Milligramm Biotin-PEG in 609 Mikrolitern 10 Millimolar Natriumbicarbonat und Vortex. Zentrifen Sie bei 10.000 x g ab einer Minute bei Raumtemperatur, um Blasen zu entfernen.

Tragen Sie 10 bis 15 Mikroliter dieser Lösung pro Quadrat auf, um das Array vollständig abzudecken, ohne zu überlaufen. Lagern Sie die Deckelgleiten im Dunkeln drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur in die Feuchtigkeitskammer. Waschen Sie dann die Deckgläser, indem Sie sie 10 Sekunden lang nacheinander in drei Bechergläser tauchen, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt sind.

Entfernen Sie die gesamte Feuchtigkeit aus den Deckgläsern mit Stickstoffgas. Lagern Sie die Deckelschlitten Rücken an Rücken in einem 50 Milliliter konischen Röhrchen, das mit Stickstoff gefüllt ist, und verschließen Sie es mit einer Dichtfolie. Umwickeln Sie das Rohr mit Siegelfolie und legen Sie es auf minus 20 Grad Celsius.

Entfernen Sie die funktionalisierten Biotin-PEG-Arrays aus dem Gefrierschrank und gleichen Sie sie auf Raumtemperatur aus. Legen Sie den Deckbeleg mit dem Array nach oben über eine 100 Millimeter große Gewebekulturschale, die mit Siegelfolie ausgekleidet ist. Inkubieren Sie jedes Quadrat des Arrays mit 10 Milligramm pro Milliliter Natriumborhydrid in PBS für vier Minuten bei Raumtemperatur.

Dreimal mit PBS waschen. Als nächstes mit 0,2 Milligramm pro Milliliter NeutrAvidin in T50 für fünf Minuten inkubieren, gefolgt von dreimal Waschen mit T50 BSA. Wiederholen Sie die Inkubation mit zwei Mikrogramm pro Milliliter biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50 BSA für 10 Minuten, gefolgt von Waschen.

Zuerst das Lysat durch Pipettieren auftauen. Verdünnen Sie einen Mikroliter des Lysats in 100 Mikroliter eiskaltes T50 BSA PPI. Inkubieren Sie das Lysat auf dem Array für 10 Minuten, gefolgt von Waschen.

Bereiten Sie AF647 konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper in eiskaltem T50 BSA PPI vor und inkubieren Sie eine Stunde lang auf dem Array. Deponieren Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel. Platzieren Sie das Nanogitter zur Bildgebung auf der Bühne.

Konzentrieren Sie sich mit durchgelassenem weißem Licht auf das Gittermuster. Erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern des Rasters, stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind, und speichern Sie die Bildserie als treuhänderisch. Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein luftiges Muster zu erzeugen, erfassen Sie eine Reihe von 20 Bildern für Verstärkungskalibrierungen und speichern Sie das Bild als Verstärkung.

Erfassen Sie dann eine Reihe von 20 Bildern für den Kamera-Offset, indem Sie das gesamte Licht der Kamera blockieren und den Hintergrund der Bilder speichern. Um einfache Bilder zu erhalten, reinigen Sie zuerst das Ölobjektiv und lagern Sie zusätzliches Öl auf das Objektiv auf. Befestigen Sie das Deckglasarray auf der Mikroskopstufe.

Erfassen Sie Bilder für jede Probe, zuerst im fernroten Kanal, gefolgt von Fluorophoren mit niedrigerer Wellenlänge. Überprüfen Sie den Pufferstand alle 30 bis 45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf. Mit dieser Technik wurde EGFR-GFP aus Gesamtproteinlysaten gewonnen.

Die Autofluoreszenz der hydrophoben Tinte wurde als Leitfaden verwendet, um die Brennebene der Probe zu finden. Rohdatenbilder wurden mit Spektralkanälen aufgenommen, die auf dem Kamerachip getrennt waren. Eine Überlagerung der grünen und fernroten Kanäle wurde für die Datenerfassung weiter untersucht.

Die Kanalregistrierung wurde auf Bildern durchgeführt, die aus dem Nanogitter aufgenommen wurden. Eine Überlagerung von Treuhandbildern zeigte eine unvollständige Registrierung. Die Ausrichtung erfolgte durch Anwendung einer lokalen gewichteten Mittelwerttransformation auf die fernroten und grünen Kanalkoordinaten, die zur Registrierung der nachfolgenden SiMPull-Daten verwendet wurde.

Einzelne Emitter über der Hintergrundphotonenzahl der GFP- und AF647-Kanäle wurden geboxt und eine Gaußsche Lokalisierung durchgeführt, um die Standorte zu identifizieren. Die Kolokalisation von EGFR-GFP in einem F647 wurde durchgeführt, um phosphorylierte Rezeptoren zu identifizieren. Und der Prozentsatz der Kolokalisation wurde verwendet, um den Anteil der phosphorylierten Rezeptoren zu bestimmen.

Hintergrunddetektionen wurden reduziert, wenn Piranha-geätztes Glas mit Natriumborhydrid behandelt wurde. Eine robuste Bindung von EGFR-GFP im Lysat wurde mit minimaler unspezifischer PY99-AF647-Bindung beobachtet, die eine Beibehaltung der Oberflächenfunktionalisierung mit dieser Technik zeigt. SiMPull liefert Informationen über die Proteinphosphorylierung und kann eine breite Palette von Selbstsignalfragen beantworten.

Dies kann unser Verständnis der Signalgebung sowohl im Normal- als auch im Krankheitszustand verbessern.