Name: Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Lernen Sie die Messung von Myosin-Ensemblekräften in Aktinfilamentbündeln mit optischer Pinzette. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen motorischer Proteindynamiken in hierarchischen Zytoskelettsystemen.

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Diese Arbeit wird teilweise vom University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), dem University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), dem Mississippi Space Grant Consortium unter der Fördernummer NNX15AH78H (JCW, DNR) und der American Heart Association unter der Fördernummer 848586 (DNR) unterstützt.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Eine In-vitro-Studie mit optischen Pinzetten in Kombination mit Fluoreszenzbildgebung wurde durchgeführt, um die Dynamik von Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit Aktinfilamenten interagieren. Aktin-Myosin-Aktin-Bündel wurden unter Verwendung von Muskelmyosin II, Rhodamin-Aktin an der Unterseite des Bündels und auf der Deckglasoberfläche und 488-markierten, biotinylierten Aktinfilamenten auf der Oberseite des Bündels zusammengesetzt. Aktinprotein aus Kaninchenmuskeln wurde unter Verwendung von allgemeinen Akt...

Motorproteine sind lebenswichtig und wandeln chemische Energie in mechanische Arbeit um 1,2,3. Myosinmotoren interagieren mit Aktinfilamenten, indem sie Schritte entlang der Filamente ähnlich einer Spur machen, und die Dynamik von Aktin-Myosin-Netzwerken führt unter anderem Muskelkontraktion, Zellmotilität, den kontraktilen Ring während der Zytokinese und die Bewegung der Fracht innerhalb der Zelle durch 3,4,5,6,7,8 . Da Myosine so viele wesentliche Rollen spielen, kann ein Versagen der Funktionalität des Myosin-Aktin-Netzwerks zur Entwicklung von Krankheiten führen, wie z.B. Mutationen in der Myosin-Schwerkette, die eine Herzhyperkontraktilität bei hypertropher Kardiomyopathie (HCM) verursachen9,10,11,12,13,14 . Bei der Muskelkontraktion kooperieren einzelne Myosinmotoren, indem sie als Ensemble zusammenarbeiten, um die erforderliche mechanische Energie bereitzustellen, die das relative Gleiten der AFs 4,15,16,17,18 ausführt. Myosinmotoren bilden Querbrücken zwischen AFs und nutzen Konformationsänderungen aufgrund ihres mechanochemischen Zyklus, um sich kollektiv zum Stachelende der ausgerichteten Filamente 17,18,19,20,21 zu bewegen.
Die Entwicklung quantitativer In-vitro-Motilitätsassays auf SM-Ebene unter Verwendung von Techniken wie optischem Trapping hat es ermöglicht, beispiellose Details über die Funktionsweise einzelner Myosinmotoren zu sammeln, einschließlich der Messung der SM-Krafterzeugung und der Schrittgrößen 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al. entwickelten den optischen Fallenassay "Drei-Perle" oder "Hantel", um die Krafterzeugungsmechanik einzelner Myosin-II-Motoren23,31 zu untersuchen. Da Muskelmyosin II in Teams arbeitet, um AFs zu kontrahieren, aber auf SM-Ebene nicht prozessiv ist, musste die Ausrichtung des optischen Fangassays vom klassischen motorgebundenen Perlenansatz32 neu angeordnet werden. Um den Hanteltest zu bilden, wurden zwei optische Fallen verwendet, um einen AF über einem Myosinmotor zu halten, der an eine an einem Deckglas befestigte Perle gebunden war, und die Kraftabgabe durch den einzelnen Motor wurde durch Bewegungen des AF innerhalb der Falle23 gemessen.
SM-Kräfte und die Verwendung einer Einzelmotor-/Einzelfilament-Assay-Orientierung geben jedoch kein vollständiges Bild über die Krafterzeugung auf Systemebene, da viele Motorproteine, einschließlich Myosin II, nicht isoliert arbeiten und oft nicht als Summe ihrer Teile funktionieren 15,16,17,32,33,34,35,36 . Komplexere Strukturen, die mehr als einen Motor umfassen, der mit mehr als einem Filament interagiert, sind notwendig, um die Synergie von Myosin- und Aktinfilament-Netzwerken besser zu verstehen15,32. Die Hantel-Assay-Orientierung wurde ausgenutzt, um die Erzeugung kleiner Ensemblekräfte zu untersuchen, indem mehrere Myosine an einer Perle befestigt sind oder ein Myosin-dickes Filament an einer Oberfläche befestigt ist und die Motoren mit dem hängenden AF 4,23,34,37,38,39,40 interagieren können.
Andere kleine Ensemble-Assays umfassen einen In-vitro-Filament-Gleitassay, bei dem Myosinmotoren auf eine Deckglasoberfläche beschichtet werden und eine an einen AF gebundene Perle verwendet wird, um die vom Motorteam erzeugte Kraft zu untersuchen 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . In beiden Fällen sind die Myosine an eine starre Oberfläche – Perle oder Deckglas – gebunden und verwenden einen AF. In diesen Fällen sind die Motoren nicht in der Lage, sich frei zu bewegen oder miteinander zu kommunizieren, noch spiegelt die starre Bindung von Myosinen die nachgiebige, hierarchische Umgebung wider, in der die Motoren im Sarkomerzusammenarbeiten würden 32. Frühere Studien haben gezeigt, dass Myosin II seine Umgebung wahrnehmen und sich entsprechend an sich ändernde viskoelastische oder motorische Konzentrationsbedingungen anpassen kann, indem Eigenschaften wie Krafterzeugung und Tastverhältnis41,44,45 verändert werden. Daher besteht die Notwendigkeit, einen optischen Trapping-Assay zu entwickeln, der die motorische Kommunikation und Systemkonformität fördert und erfasst, um ein realistischeres Bild der mechanistischen Grundlagen der Myosin-II-Ensemblekrafterzeugung zu zeichnen.
Hier haben wir eine Methode entwickelt, um hierarchische Strukturen in vitro mit optischem Trapping zu koppeln, indem wir Actomyosin-Bündel oder Sandwiches bilden, die aus mehreren Myosinmotoren bestehen, die zwischen zwei Aktinfilamenten interagieren. Diese modulare Assay-Geometrie hat die Fähigkeit, direkt zu untersuchen, wie molekulare und Umweltfaktoren die Ensemble-Myosin-Krafterzeugung beeinflussen. Darüber hinaus hat die Untersuchung von Krafterzeugungsmechanismen durch diese Aktin-Myosin-Ensembles das Potenzial, bei der Modellierung und dem Verständnis zu helfen, wie sich großräumige zelluläre Aufgaben, wie die Muskelkontraktion, von der molekularen Ebene aus ausbreiten 9,10,13.

<table><tbody><tr><td>Aktinprotein (Biotin): Skelettmuskel</td><td>Zytoskelett</td><td>AB07-A</td><td>Biotinyliertes Aktinprotein</td></tr><tr><td>Aktinprotein, Kaninchenskelett</td><td>Zytoskelett</td><td>AKL99-A</td><td>Aktinprotein</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Aktinstabilisator und Alexa Fluor 488 Färbung</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>Erforderlich für Aktin Assemblierung und Motilität des Myosins</td></tr><tr><td>Beta-D-Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP218069110</td><td>Teil eines Sauerstoffabscheidesystems zur Reduzierung der Photobleiche während der Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Blotting Grade Blocker (Kasein)</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Wird verwendet, um die Oberfläche vor unspezifischer Bindung</td></tr><tr><td>von CaCl2</td><td>Fisher</td><td>Scientific C79500</td> <td>zu schützenCalciumchlorid bietet die notwendige Kontrolle über die Dynamik des Aktin-Myosin-Netzwerks</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>ICN10040280</td><td>Teil eines Sauerstofffängersystems zur Reduzierung der Photobleiche während der Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>Wird zur Herstellung von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>DTT</td> verwendet <td>Fisher scientific</td><td>AC327190010</td><td>Wird zur Puffervorbereitung verwendet</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Regent zur Reinigung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>Teil des Sauerstofffängersystems zur Reduzierung der Photobleiche während der Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>Wird zur Puffervorbereitung</td></tr> verwendet <tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>Wird zum Ätzen und Einstellen von Deckgläsern verwendet Puffer</td></tr><tr><td>pH MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>Wird zur Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet Objektträger Objektträger</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>Wird zur Herstellung von Flusszellen</td></tr><tr><td>verwendet Myosin II-Protein: Skelettmuskel von Kaninchen</td><td>Zytoskelett</td><td>MY02</td><td>Myosin-Motorprotein in voller Länge, isoliert aus dem Skelettmuskel von Kaninchen</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>Optisches Falleninstrument</td></tr><tr><td>Poly-l-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Erleichtert die Adhäsion von Aktinfilamenten auf der Glasoberfläche des Deckglases</td></tr><tr><td>Rhodamin Phalloidin</td><td>Zytoskelett</td><td>PHDR1</td><td>Aktinstabilisator und Rhodamin Fluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Sreptavidin Kügelchen, 1 &mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>Optischer Fanggriff</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher scientific</td><td>PR H5121</td><td>Wird für die Puffervorbereitung</td></tr></tbody></table> verwendet

untersuchung der myosin-ensemblemechanik in aktinfilamentbündeln mit einer optischen pinzette

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

Myosine sind Motorproteine, die ATP hydrolysieren, um entlang der Spuren des Aktinfilaments (AF) zu treten, und sind essentiell für zelluläre Prozesse wie Motilität und Muskelkontraktion. Um ihre krafterzeugenden Mechanismen zu verstehen, wurde Myosin II sowohl auf Einzelmolekülebene (SM) als auch als Motorteams in vitro mit biophysikalischen Methoden wie optischem Trapping untersucht.
Diese Studien zeigten, dass sich das Verhalten der Myosinkrafterzeugung stark unterscheiden kann, wenn man von der Einzelmolekülebene in einer Drei-Perlen-Anordnung zu Gruppen von Motoren übergeht, die auf einer starren Perlen- oder Deckglasoberfläche in einer Gleitanordnung zusammenarbeiten. Diese Assay-Konstruktionen erlauben es jedoch nicht, die Gruppendynamik von Myosin innerhalb der viskoelastischen Strukturhierarchie zu bewerten, wie dies innerhalb einer Zelle der Fall wäre. Wir haben eine Methode mit optischen Pinzetten entwickelt, um die Mechanik der Krafterzeugung durch Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit mehreren Aktinfilamenten interagieren.
Diese Actomyosin-Bündel erleichtern die Untersuchung in einer hierarchischen und konformen Umgebung, die die motorische Kommunikation und die Ensemblekraftabgabe erfasst. Die anpassbare Natur des Assays ermöglicht es, experimentelle Bedingungen zu ändern, um zu verstehen, wie Modifikationen am Myosin-Ensemble, Aktinfilamentbündel oder der Umgebung zu unterschiedlichen Kraftausgängen führen.

Die Durchflusszellen, die die Actomyosin-Bündelsysteme enthalten, haben ein Standarddesign, bestehend aus einem Objektträger und einem geätzten Deckglas, das durch einen Kanal aus doppelseitigem Klebeband getrennt ist (Abbildung 1). Der Assay wird dann vom Deckglas bis zur Verwendung von abgestuften Einführungen, wie im Protokoll beschrieben, erstellt. Der endgültige Assay besteht aus Rhodamin-markierten Aktinfilamenten; die gewünschte Myosinkonzentration (1 μM wurde für die repräsentativen ...

Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.

Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

Die Untersuchung des Aktinverhaltens mit diesem Protokoll ist von Bedeutung, da es dem Benutzer ermöglicht, die Dynamik des motorischen Proteinensembles mit der Präzision des optischen Fallens zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, die Myosinmechanik innerhalb der Aktinstrukturhierarchie zu messen, im Gegensatz zu der traditionellen einmotorigen Einzelfilamentorientierung, die in vielen optischen Fallenexperimenten verwendet wird. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist seine modulare Natur, die es dem Benutzer ermöglicht, den Assay an das hierarchische Zytoskelettsystem seiner Wahl anzupassen.Tragen Sie zunächst zwei Stücke doppelseitiges Klebeband auf die Mitte eines Objektträgers auf, der drei bis vier Millimeter voneinander entfernt ist. Reißen oder schneiden Sie dann das überschüssige Klebeband ab, das am Rand der Folie hängt. Als nächstes fügen Sie den PLL-beschichteten Abdeckstreifen auf dem Band senkrecht zur Längsachse des Objektträgers hinzu, um einen Kanal zu bilden.Verwenden Sie ein kleines Röhrchen, um den Deckel auf das Band und das Mikroskop zu komprimieren, und schieben Sie gründlich, bis das Band transparent ist, um sicherzustellen, dass keine Blasen im Band vorhanden sind, da dies zu Leckagen aus dem Strömungskanal führen kann. Geben Sie 15 Mikroliter des verdünnten Rhodaminaktins in die PLL-Durchflusszelle und leiten Sie die überschüssige Lösung durch die Durchflusszelle, lassen Sie den Durchflusskanal jedoch nicht trocken werden. Dann 10 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.Als nächstes wird ein Milligramm pro Milliliter Caseinlösung in Aktinpolymerisationspuffer hergestellt und 15 Mikroliter der Lösung hinzugefügt, um eine unspezifische Bindung der nachfolgenden Komponenten zu verhindern. Dann fünf Minuten in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Anschließend die gewünschte Konzentration an Myosin in die vorbereitete biotinylierte Aktin- und Perlensuspension geben und vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren.Dann geben Sie sofort 15 Mikroliter der Suspension zusammen mit der gewünschten Myosinkonzentration in die Flusszelle und inkubieren für 20 Minuten. Als nächstes versiegeln Sie die offenen Enden der Durchflusszelle mit Nagellack, um eine Verdunstung während der Bildgebung und der optischen Fangexperimente zu verhindern. Sobald das System fertig ist, schalten Sie den Laser mit dem Laser-Power-Button in der linken unteren Ecke des Bildschirms auf 50 Milliwatt ein und lassen Sie ihn 30 Minuten lang stabilisieren.Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Beleuchtung, Kamera, Objektiv und Bühnenbewegung in der Software, um diese Fenster zur Anzeige und Manipulation während des Experiments aufzurufen. Schalten Sie die Mikroskopbeleuchtung ein, indem Sie auf die Schaltfläche On/Off klicken und sie auf maximale Leistung einstellen, indem Sie klicken und den Balken ganz nach rechts ziehen. Öffnen Sie den Probenbereich und nehmen Sie den Probenhalter vom Mikroskoptisch.Fügen Sie dann die Durchflusszelle hinzu und sichern Sie sie mit den Metallprobenhaltern, wobei Sie sicherstellen, dass sich der Abdeckschein auf der Unterseite befindet. Anschließend werden 30 Mikroliter RO-Wasser in die Mitte des unteren Objektivs gegeben und der Probentisch wieder eingesetzt. Heben Sie dann das untere Objektiv mit dem L2 auf der Fernbedienung an, bis die Wasserperle den Abdeckschein berührt.Als nächstes senken Sie das obere Objektiv mit dem R2 auf der Fernbedienung ab, bis etwa die Hälfte der Entfernung zur Durchflusszelle erreicht ist. Fügen Sie dann 170 Mikroliter RO-Wasser in die Oberseite der Durchflusszelle direkt unter dem oberen Objektiv und senken Sie das obere Objektiv ab, bis es die Oberflächenspannung des Wassers bricht und einen Meniskus bildet. Bewegen Sie anschließend den Mikroskoptisch mit dem Pfeilpad auf der Fernbedienung, bis der Rand des Bandes neben dem Strömungskanal erreicht ist, und schließen Sie dann die Probenklappe.Verwenden Sie das Zielfenster auf dem Bildschirm, um den Rand des Bandes zu lenken und zu fokussieren, indem Sie das untere Objektiv mit dem Namen Laserobjektiv nach oben bringen, indem Sie auf den oberen Pfeil klicken, und das obere Ziel, indem Sie auf den unteren Pfeil klicken. Finden Sie eine schwimmende Perle und fangen Sie sie ein, indem Sie auf den Fallenauslöser klicken, der den Verschluss öffnet und es dem Fanglaser ermöglicht, die Probe zu treffen. Klicken Sie dann auf den Fallencursor auf dem Bildschirm und ziehen Sie ihn, um die Position des Trapping-Lasers zu verschieben.Kalibrieren Sie die Perle nach dem Einfangen, indem Sie auf die Kalibrierungsschaltfläche klicken. Klicken Sie dann auf Einstellungen und geben Sie den Durchmesser der Perle und die Temperatur der Stufe unten links im Softwarefenster ein. Klicken Sie anschließend auf Trap 1, dann auf X Signal und führen Sie die Eckfrequenzanpassung durch, indem Sie auf Ausführen klicken.Klicken und ziehen Sie dann innerhalb des Fensters, um die Funktionsanpassung zu optimieren. Klicken Sie anschließend auf Verwenden Sie es für Empfindlichkeits- und Steifigkeitswerte und akzeptieren Sie dann Werte. Schließen Sie anschließend das Fenster.Finden Sie ein Actomyosin-Bündel, indem Sie nach Perlen suchen, die an AFs auf der Oberfläche des Deckblatts gebunden sind, und indem Sie nach beiden fluoreszierenden AFs suchen, die kolokalisiert sind. Schalten Sie die weiße Lichtquelle ein und verwenden Sie den entsprechenden Filterwürfel, um jedes Aktinfilament abzubilden, indem Sie den Turm drehen. Nach der Überprüfung fangen Sie die Perle ein, die am oberen Filament des Bündels befestigt ist, indem Sie auf den Fallenauslöser klicken.Zeichnen Sie dann die Daten auf, indem Sie mithilfe der Bildschirmsteuerung auf die Oszilloskopschaltfläche klicken. Um Messungen zu visualisieren, ohne die Daten aufzuzeichnen, klicken Sie auf Start und dann auf Autospeichern, um alle Daten zu speichern. Um Messungen aufzuzeichnen, klicken Sie auf Aufnahme starten und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü X-Signal oder Y-Signal aus, welche Daten in Echtzeit visualisiert werden sollen.Die Kraftspur von skelettalen Myosinmotoren, die Kraft innerhalb der konstruierten in vitro Aktinstrukturhierarchie erzeugen, zeigen eine stetige Rampe in Kraft, bis ein Plateau über zwei bis fünf Minuten erreicht ist. Es wird jedoch auch beobachtet, dass einige Actomyosin-Bündel, die keine Nettokraft erzeugen und die Kraftspuren als Basislinienrauschen erscheinen oder aufgrund einer geringen Motorkonzentration oder einer ungünstigen Parallelorientierung der Filamente keine wesentliche Nettokraftzunahme über 90 Sekunden aufweisen. Diese Protokollentwicklung wird den Weg für die Erstellung komplexerer In-vitro-Zytoskelett-Assays ebnen, die weiter dazu beitragen werden, große zelluläre Aufgaben wie Zellteilung und Muskelkontraktion von unten nach oben zu modellieren.

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