Ein Modell für Epilepsie infektiöser Ätiologie am Beispiel des Theiler-Maus-Enzephalomyelitis-Virus
23. Juni 2022
Die intrazerebrale Infektion mit dem Theiler-murinen Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) in C57BL/6-Mäusen repliziert viele der frühen und chronischen klinischen Symptome der viralen Enzephalitis und der anschließenden Epilepsie bei menschlichen Patienten. Dieser Artikel beschreibt die Virusinfektion, die Symptome und die Histopathologie des TMEV-Modells.
Das TMEV-Modell ist eine der ersten experimentellen Plattformen, die es ermöglicht, die Mechanismen der Anfallsentwicklung als Folge einer ZNS-Infektion zu untersuchen. ZNS-Infektionen erhöhen das Risiko für Epilepsie erheblich. Diese Modelle helfen bei der Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele und Wirkstoffe für Risikopatienten.
Experimentatoren sollten in der Arbeit mit Mäusen geschult werden. Die Virusinjektion kann sehr gut geübt werden, indem Farbstoff in tote Tiere injiziert wird, um eine ausreichende Präzision und Routine zu erreichen. Das Verfahren wird von Laura Bell, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.
Entfernen Sie zunächst die Kappe der Insulinspritze und legen Sie einen Polyethylenschlauch als Kragen um die Nadel, um eine ausreichende Injektionstiefe von 2,5 Millimetern zu gewährleisten. Tauchen Sie die Spritze dann 30 Minuten lang in Ethanol und halten Sie die Spritze 30 Minuten lang unter UV-Licht. Setzen Sie dann die Kappe wieder auf die Nadel und wickeln Sie die Spritze in einen Sterilisationsbeutel.
Kleben Sie den Beutel mit Klebeband zu, um ihn zu verschließen, und beschriften Sie ihn mit dem Zubereitungsdatum. Um eine Virusinjektion durchzuführen, holen Sie sich Aliquoten des Daniels-Stammes von TMEV aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie das Virus auf und bewahren Sie es auf Eis auf.
Füllen Sie dann die Spritze mit der Virussuspension. Reinigen Sie anschließend die Bank mit Desinfektionsmittel und arbeiten Sie unter einem Rauchabsorber. Übertragen Sie die betäubte Maus aus der Anästhesiebox unter die Haube und überprüfen Sie die chirurgische Verträglichkeit, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen.
Reinigen Sie dann den Kopf des Tieres mit einem Alkoholpad und neigen Sie den Kopf der Maus leicht nach links, so dass die Injektionsstelle nach oben zeigt. Ziehen Sie die Haut etwas nach hinten und führen Sie die Nadel in den Kopf ein. Als nächstes injizieren Sie 20 Mikroliter intrakordial bis zu einer Tiefe von 2,5 Millimetern in den Schläfenbereich der rechten Hemisphäre.
Lassen Sie die Spritze fünf bis 15 Sekunden lang an Ort und Stelle und prüfen Sie, ob die Injektion undicht ist oder ob Luftblasen zu sehen sind, und bereiten Sie dann eine neue Spritze vor. Wenn Sie die Spritze vorsichtig herausziehen, drehen Sie sie leicht. Setzen Sie das Tier dann in einen neuen Käfig, der während der Genesung von der Narkose halb auf, halb von einem Heizkissen platziert wird.
Und lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein zu halten. Bringen Sie zunächst alle Käfige auf die Bank und beobachten Sie die Tiere zweimal täglich während der Lichtphase auf Krampfanfälle. Bewerten Sie die Anfallsaktivität anhand einer modifizierten Rennskala und geben Sie die Anzahl und Intensität der Anfälle an.
Schieben Sie als Nächstes einen Stift über den Käfig, um etwas Lärm zu machen, und bringen Sie jedes Tier in eine andere Box und zurück. Bei Tieren, die nicht spontan oder nach leichtem Käfigschütteln zugegriffen haben, lösen Sie Anfälle durch intensivere Handhabung aus, während Sie die Maus vorsichtig umdrehen, indem Sie sie am Schwanz von links nach rechts drehen. Beobachten Sie jedes Tier erneut auf das Anfallsverhalten und wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Käfige.
Verhaltensanfälle wurden aufgezeichnet, wenn sie während der Drogeninjektion oder während der anschließenden Überwachungssitzungen zur Anfallsbehandlung auftraten. Die beobachteten Daten wurden als Heatmap dargestellt, die durch die Darstellung der Anfallsstadien in verschiedenen Farben erstellt wurde. Durch die EEG-Aufzeichnung können verschiedene epileptische Ereignisse in der chronischen Phase, Monate nach der Infektion mit TMEV, identifiziert werden.
Die Quantifizierung der Hippocampus-Degeneration und der epileptischen TMEV-infizierten Mäuse zeigt eine signifikante Abnahme der Hippocampus-Fläche und eine entsprechende Zunahme der ventrikulären Fläche von TMEV-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Die immunhistologische Analyse kann Informationen über verschiedene Parameter wie das Vorhandensein von Entzündungszellen liefern. In diesem Fall wurden Schnitte, die den Hippocampus enthielten, mit Antikörpern gefärbt, um T-Lymphozyten zu markieren.
Scheininfizierte Tiere zeigten keine T-Zell-Infiltration, wohingegen bei der Mehrzahl der TMEV-infizierten Mäuse eine moderate Infiltration beobachtet wurde. Einige der infizierten Mäuse zeigen eine starke Infiltration von T-Lymphozyten. Nicht alle Tiere haben in jedem Beobachtungszeitraum Krampfanfälle.
Auch die höchste Inzidenz von Krampfanfällen tritt am fünften und sechsten Tag nach der Impfung auf. Wir verwenden das TMEV-Modell, um die Wirksamkeit neuartiger Anti-Krampf-Medikamente gegen infektionsinduzierte Anfälle zu testen. Assays, die komorbide Verhaltensänderungen und elektrophysiologische Veränderungen untersuchen, können ebenfalls ausgewertet werden.
Das TMEV-Modell hat der Epilepsieforschung das erste ZNS-infektionsinduzierte Modell der Temporallappenepilepsie zur Verfügung gestellt, das die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Epileptogenese nach einer Infektion ermöglicht.
Übersicht
Diese Studie untersucht das Theiler-Maus-Enzephalomyelitis-Virus-(TMEV-)Modell bei C57BL/6-Mäusen, das menschliche Symptome einer viralen Enzephalitis und Epilepsie nachahmt. Die Forschung zielt darauf ab, die Mechanismen der Anfallsentstehung infolge von ZNS-Infektionen zu verstehen und potenzielle therapeutische Zielstrukturen für das Management der Epilepsie zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Virologie
- Epilepsieforschung
Hintergrund
- TMEV-Infektionen führen bei Mäusen zu erheblichen frühen und chronischen Symptomen.
- ZNS-Infektionen erhöhen das Risiko, eine Epilepsie zu entwickeln.
- Das TMEV-Modell ermöglicht die Untersuchung der zugrundeliegenden Anfallsmechanismen.
- Zur korrekten Handhabung und Virusinjektionstechniken ist eine Schulung erforderlich.
Zweck der Studie
- Das TMEV-Modell für durch eine ZNS-Infektion induzierte Epilepsie bewerten.
- Anfälle auslösende Faktoren und therapeutische Kandidaten identifizieren.
- Verhaltens- und elektrophysiologische Veränderungen nach der Infektion verstehen.
Verwendete Methoden
- Die Hauptversuchsplattform beinhaltet die Injektion des TMEV-Virus in C57BL/6-Mäuse.
- Das biologische Modell konzentriert sich auf die Reaktionen des ZNS auf virale Infektionen.
- Zu den Verletzungen und Interventionen gehört die Überwachung von Anfallsaktivität nach der Infektion.
- Zu den wichtigsten Schritten gehören die Vorbereitung des Virus, die Injektion und die Überwachung der Anfallsaktivität.
- Die Elektroenzephalographie (EEG) wird zur Beurteilung der Anfallseigenschaften eingesetzt.
Hauptergebnisse
- Es gibt Hinweise auf eine signifikante Degeneration des Hippocampus bei mit TMEV infizierten Mäusen.
- Die Charakterisierung der T-Zell-Infiltration im Hippocampus zeigte unterschiedliche Ausprägungen der entzündlichen Reaktion.
- Das Modell veranschaulicht den Beginn von Anfällen und deren Auslöser und mündet in die Bestimmung der Wirksamkeit von antikonvulsiven Medikamenten.
- Die Häufigkeit der Anfälle erreicht um den fünften und sechsten Tag nach der Inokulation einen Höhepunkt.
Schlussfolgerungen
- Diese Forschung etabliert das TMEV-Modell als eine entscheidende Plattform für Epilepsiestudien.
- Die Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen infektionsbedingter Epilepsie im zentralen Nervensystem.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können therapeutische Strategien zur Behandlung von Epilepsie nach einer Infektion beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Modellierung einer Epilepsie infektiöser Ätiologie mit der TMEV-Plattform ermöglicht die mechanistische Entlastung von Risiken und die Validierung von Zielstrukturen für die durch ZNS-Infektionen ausgelöste Epileptogenese. Dieses Modell unterstützt das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckung und translationsmedizinischen Forschung, indem es sowohl akute als auch chronische Anfallsphänotypen repliziert, die für die menschliche Erkrankung relevant sind. Seine Anwendung erleichtert die Portfolioauswahl und -priorisierung neuartiger antikonvulsiver Wirkstoffe für Patienten mit hohem Risiko.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung infektionsbedingter epileptogener Mechanismen und die Aufklärung von Signalwegen.
- Unterstützt die biologische Risikominderung durch Modellierung klinisch relevanter Anfallphänotypen nach ZNS-Infektion.
- Erleichtert die funktionelle Zielstrukturvalidierung für antikonvulsive Wirkstoffkandidaten in einem krankheitsrelevanten System.
- Bietet Vorhersagesicherheit für die Weiterentwicklung von Substanzen, die auf die infektionsbedingte Epilepsie abzielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt validierte Tiermodelle zur quantitativen Überwachung von Anfällen und zur Prüfung der Wirksamkeit von Wirkstoffen.
- Standardisiert die Anfallsbewertung und EEG-basierte Messungen, um reproduzierbare Assayausgaben zu gewährleisten.
- Ermöglicht ein skalierbares Screening neuartiger Therapeutika hinsichtlich infektionsinduzierter Anfallsendpunkte.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Wirkstoffeffekte auf sowohl verhaltensbezogene als auch elektrophysiologische Parameter.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung an der translationellen Biomarkerentwicklung anhand histopathologischer und neuroinflammatorischer Endpunkte.
- Stellt die Kontinuität von der mechanistischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung bei infektionsbedingter Epilepsie sicher.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung zentralnervensystemwirksamer Therapeutika.
- Bietet eine prädiktive Risikominimierung für späte biologische Risiken in Epilepsie-Portfolios.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das TMEV-Modell integriert die frühe Entdeckung bis hin zur Leitstrukturfestlegung und präklinischen Validierung für infektionsbedingte Epilepsie.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Verbindung zwischen Infektion und Epileptogenese sowie die Analyse mechanistischer Signalwege.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare Quantifizierung von Anfällen und standardisierte Verhaltens- und EEG-Auswertungen zur Substanztriage.
- Analytik: Bietet quantitative Metriken zur Anfallshäufigkeit, -intensität und histopathologischen Befunden für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet entdeckte Erkenntnisse mit präklinischen Biomarker- und Wirksamkeitsstudien in einem krankheitsrelevanten Kontext.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für laufende Forschung zu antikonvulsiven Wirkstoffen und Neuroinflammation über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit und verringert mechanistische Unschärfen in der Forschung zu infektionsbedingter Epilepsie.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Arbeitsabläufe für die Anfallsüberwachung und Wirkstoffprüfung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitaleffizienz, indem der Fokus auf translationell relevanten Endpunkten liegt.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von auf das zentrale Nervensystem abzielenden therapeutischen Kandidaten.
Durchführungsaspekte
- Setzt Expertise in murinen CNS-Infektionsmodellen und Anfallsüberwachungstechniken voraus.
- Erfordert Zugang zu spezieller Instrumentierung für EEG- und histopathologische Analysen.
- Erfordert die Standardisierung der Anfallsbewertung und der Datenberichterstattung über mehrere Teams hinweg.
- Die Übertragung auf verschiedene Mausstämme oder Infektionsmodelle kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität zwischen den Tieren und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Schulung in Injektionsverfahren.
