Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

Legen Sie zunächst die rasierte, betäubte Maus auf ein Wärmekissen. Kneifen Sie die Haut mit einer Pinzette in der Nähe der vierten Brustwarze zusammen und schneiden Sie die erhabene Haut mit einer scharfen Schere ein, um einen Schnitt von etwa einem Zentimeter in der Mittellinie zu machen. Machen Sie kreisförmige Schnitte um die Drüse sowohl in kranialer als auch in kaudaler Richtung und schälen Sie die Haut vorsichtig vom Bauch ab.

Exogenes Blut unverzüglich mit physiologischer Kochsalzlösung entfernen, um einen späteren Verlust der optischen Auflösung zu vermeiden. Um den Blutverlust zu minimieren, verschließen Sie alle hervorstehenden Blutgefäße mit einem Handkauterisierer. Dann toupieren Sie die Oberflächenschicht sanft mit einer feinen Pinzette, um oberflächliches Binde- und Fettgewebe zu entfernen.

Halten Sie die freiliegende Drüse mit physiologischer Kochsalzlösung feucht. Falls erforderlich, behandeln Sie die Drüse mit exogenen Mitteln, z. B. pharmakologischen Wirkstoffen oder organellenspezifischen Farbstoffen, indem Sie die freiliegenden Drüsen während der Operation baden. Schützen Sie die Bauchdecke mit einer halbtransparenten, flexiblen thermoplastischen Folie.

Positionieren Sie die Maus vorsichtig mit der Bauchseite nach unten auf einem invertierten Mikroskoptisch, so dass der Hautlappen auf das zentrale Deckglas hinausragt. Schützen Sie die freiliegenden Stellen mit einer dünnen Schicht Gel. Klebe das hintere Bein und den Schwanz an die Bühne.

Platzieren Sie dann einen speziell angefertigten gekerbten Abstandshalter, der aus drei geklebten Wattestäbchen hergestellt wurde, zwischen dem Hautlappen und der Körperwand, um die Drüse vor Bewegungsartefakten zu schützen, die durch Atmung und Herzschlag verursacht werden. Kleben Sie eine Kunststoffabdeckung an beiden Enden der Tischöffnung sicher ab, um zu verhindern, dass der Hautlappen während der Bildgebung verrutscht. Führen Sie einen subkutanen Verweilkatheter unter die Rückenhaut ein, der an einem Schlauch, einer Spritze und einer Pumpe befestigt ist.

Bestätigen Sie mit der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie, dass der Hautlappen stabil ist und ausreichend durchblutet wird. Konventionelle konfokale Mikroskopie der EGFP-Zyto- oder EGFP-Membranmaus, markiert mit BODIPY 665676, und Zwei-Photonen-Mikroskopie der EGFP-Membranmaus, markiert mit Monodansylpentan, und tdTomato-Membranmaus, markiert mit Monodansylpentan. In EGFP-Zytomäusen wurde das Zytoplasma von sekretorischen Epithelzellen eindeutig durch EGFP markiert.

Gleichzeitig erschienen die mit BODIPY gefärbten Lipidtröpfchen 665676 als runde fluoreszierende Körper, insbesondere zur apikalen Oberfläche hin. Die Zeitrafferanalyse zeigte, dass BODIPY gefärbte Lipidtröpfchen 665676, die sich mit variabler Geschwindigkeit vom basalen in den apikalen Bereich bewegen und während des Transports miteinander verschmelzen. Bei EGFP-Membranmäusen hob EGFP die Plasmamembranen von Kapillar- und sekretorischen Epithelzellen hervor und BODIPY-gefärbte Lipidtröpfchen waren im gesamten Zytoplasma sichtbar.

Zwei Photonenmikroskopien der Brustdrüsen von EGFP-Membran- oder tdTomato-Membranmäusen ermöglichten eine umfassendere Untersuchung der Drüsenmorphologie. Kollagenfasern an der Oberfläche werden im Monodansylpentan-Kanal durch die Erzeugung der zweiten Harmonischen sichtbar gemacht. Weiter im Parenchym wird das sekretorische Epithel mit basalen, lateralen und apikalen Plasmamembranen und Monodansylpentan-gefärbten Lipidtröpfchen freigelegt.

Das zentrale Lumen wird weiter in die Lungenbläschen hinein deutlich. Das rote tdTomato-Fluorophor war besonders nützlich für die Markierung des Kapillarendothels, im Gegensatz zu EGFP bei EGFP-Zytomäusen.