Name: Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Lernen Sie die extrazelluläre Glukosemessung zur Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays für Stoffwechselstudien in Zellen und Geweben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Glukoseaufnahme-Kinetiken bei verschiedenen Nährstoffen und Medikamenten.

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Das Projekt wurde vom Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award und dem Kathleen Kelly Award unterstützt. Weitere Unterstützungen waren das National Center for Research Resources UL1RR025755 und NCI P30CA16058 (OSUCCC), die NIH Roadmap for Medical Research. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten des National Center for Research Resources oder des NIH dar.

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (OSU, Protokoll 2007A0262-R4) genehmigt.
HINWEIS: Alle Verfahren müssen in einer Biosicherheitskabine der Klasse II mit eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Materialien
HINWEIS: Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
<ol><li>Herstellung von Medium 1, Zentrifugationsmedium 2 und Lager- und Arbeitslösungen von fluoreszierender 2-Desoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-D-glucose (2-NBDG oder FD-Glucose) gemäß Tabelle 1 in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Schützen Sie FD-Glukose während des gesamten Experiments vor Licht, indem Sie alle Lichter unter der Haube ausschalten.</li>
	<li>Verwenden Sie gebrauchsfertige Zellkulturreagenzien: Trypsin-EDTA, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und glukosefreies und phenolrotfreies Dulbecco's Modified Eagle Medium (im Folgenden glukosefreies DMEM).</li>
	<li>Verwenden Sie 20 ml RIPA-Lysepuffer (Radioimmunprecipitation Assay). HINWEIS: In den folgenden Abschnitten werden extrazelluläre Depletion und intrazelluläre Aufnahme verschiedener FD-Glukosedosen in 3T3-L1-Fibroblasten mit und ohne Insulinstimulation verglichen (Abbildung 2).</li>
</ol>2. 3T3-L1 Zellkultur und Wartung
<ol><li>Kultur 3T3-L1 Maus-Fibroblasten durch Beschichtung von 1 x 106 Zellen, verdünnt in 20 ml Medium 1 in zwei 96-Well-Platten. Platte 100 μL Zellsuspension pro Well, um sicherzustellen, dass die Homogenität dieser Suspension durch Mischen erhalten bleibt. Züchten Sie Zellen für 48 h in einem 37 °C Inkubator (5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit) ohne Medienwechsel bis etwa 70% -80% Zusammenfluss.</li>
	<li>Halten Sie die Zellen zusammenfließend und nüchtern, indem Sie sie 48 h lang im selben Medium kultivieren. Variieren Sie die Inkubationszeit von 24-72 h je nach gewünschtem katabolen Fastenzustand.</li>
</ol>3. Verhungern von 3T3-L1-Zellen
<ol><li>Dekantieren Sie Medien aus Zellen in den 96-Well-Platten. Nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.</li>
	<li>Spülen Sie die 96-Well-Platte mit 100 μL PBS pro Well ab und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern.</li>
	<li>100 μL glucosefreies DMEM pro Bohrung hinzufügen und 40 min inkubieren. Passen Sie den Zeitpunkt der Inkubation in Abhängigkeit von Zelltyp, Reizen und gewünschtem Fastengrad an. HINWEIS: Der Zeitpunkt der Inkubation kann je nach Jahreszeit optimiert werden.</li>
</ol>4. Herstellung von FD-Glucose-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
HINWEIS: Das Experiment in Abbildung 2 untersucht extrazelluläre und interzelluläre Medien mit und ohne Stimulation mit Insulin.
<ol><li>Verwenden Sie acht Replikate (eine Reihe in einer 96-Well-Platte) für jede Stimulationsbedingung. Bereiten Sie daher 1 ml für jede Stimulationsbedingung vor (siehe Tabelle 2 und unten).</li>
	<li>Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen ohne Insulin: FD-Glukose von 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml und 0 μg / ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Verwenden Sie acht Stimulationsbedingungen mit Insulin (10 μg / ml, Endkonzentration): FD-Glukose von 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / ml, 0,1 μg / ml, 0,05 μg / ml und 0 μg / ml (Kontrolle ohne FD-Glukose) in einer weiteren 96-Well-Platte.</li>
	<li>Zur Vorbereitung der Stimulationsbedingungen verdünnen Sie 1 μL 5 mg/ml FD-Glucose-Arbeitslösung (Tabelle 1) in 999 μL glukosefreiem DMEM, um 1 ml Arbeitsmateriallösung (1:1000 Verdünnung oder 5 μg/ml) zu erhalten.<ol><li>Bereiten Sie mit dieser Arbeitsstofflösung 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 und 1:100.000 Verdünnungen von FD-Glucose vor, um 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml und 0,05 μg/ml (Tabelle 2) in 2 ml-Röhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Licht zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.4 und fügen Sie 1 μl Insulin (10 mg/ml, Endkonzentration) zu jeder der oben genannten Bedingungen hinzu. HINWEIS: Die endgültige Insulinkonzentration in diesen Proben beträgt 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. Um eine Homogenisierung zu erreichen, fügen Sie Insulin zu den Röhrchen hinzu, bevor Sie andere Lösungen hinzufügen.</li>
</ol>5. Behandlung von verhungerten 3T3-L1-Zellen
<ol><li>Dekantieren Sie nach 40 Minuten Inkubation das glukosefreie DMEM aus jedem Bohrloch in 96-Well-Platten und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern.</li>
	<li>Fügen Sie jeweils 100 μL (pro Well) aus den verschiedenen oben beschriebenen Behandlungsbedingungen zu Bohrlöchern entlang einer Spalte hinzu und 100 μL (pro Well) von der gleichen Behandlungsbedingung zu den Wells entlang der Reihe (acht Replikate) in beiden 96-Well-Platten. Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen mit und ohne Insulin verwendet haben. Fügen Sie den Kontrollquellen (n = 8) allein glukosefreies DMEM hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 40 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit) im Dunkeln.</li>
</ol>6. Extrazelluläre und interzelluläre Messungen für stimulierte 3T3-L1-Zellen
<ol><li>Nachdem die Zellen für 40 min stimuliert wurden, übertragen Sie die Stimulationsmedien von beiden Platten in neue 96-Well-Platten, die das gleiche experimentelle Layout beibehalten.</li>
	<li>Dekantieren Sie die verbleibende Lösung aus den ursprünglich stimulierten 96-Well-Platten mit Zellen auf sterilen Papiertüchern.</li>
	<li>Optional Zellen mit PBS waschen. Entfernen Sie PBS und dekantieren Sie die verbleibende Lösung auf sterile Papiertücher.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL des RIPA-Lysepuffers zu jeder Vertiefung hinzu. Fügen Sie optional Proteasehemmer zum RIPA-Puffer hinzu, um Proteine zu schützen. Legen Sie Platten mit RIPA für 30 min in einen Shaker.</li>
	<li>Messen Sie mit einem Mikroplattenleser (Table of Materials) die Fluoreszenz bei Anregungs- (Ex) und Emissionswellenlängen (Em) von 485 bzw. 535 nm, zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann die Platte mit RIPA-lysierten Zellen am Ende der 30-minütigen Inkubation (siehe Schritt 6.4).</li>
</ol>7. Proteinbasierte Normalisierung der intrazellulären Glukoseaufnahme
HINWEIS: Die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme hängt von der Zellzahl ab. Die Proteinspiegel in zellulären Lysaten sind proportional zu den Zellzahlen, die es ermöglichen, den intrazellulären FD-Glukosespiegel auf die Anzahl der Zellen in jedem Brunnen zu normalisieren.
<ol><li>Führen Sie den BCA-Proteinassay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in jedem Bohrloch, das RIPA-lysierte Zellen enthält.</li>
	<li>Verwenden Sie 10 μL des RIPA-Homogenats und messen Sie Proteinkonzentrationen in dreifacher Reihenfolge, um die Genauigkeit der Messungen in 96-Well-Platten zu erhöhen.</li>
	<li>Quantifizieren Sie das Protein basierend auf Proteinstandards (0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 μg / ml-Protein), die zusammen mit Proben auf jeder 96-Well-Platte analysiert werden.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 562 nm und quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen in jeder Probe basierend auf der linearen Regressionsformel, die für den Proteinstandard erhalten wurde.</li>
	<li>Normalisieren Sie den Gehalt an intrazellulärer FD-Glukose, indem Sie den Fluoreszenzwert / die Proteinkonzentration in jedem Brunnen verwenden. Der extrazelluläre FD-Glukose-Abbau erfordert keine Normalisierung.</li>
	<li>Optional können Sie die durchschnittlichen Basiswerte in Kontrollstichproben für eine zusätzliche Normalisierung (100 %) verwenden.</li>
</ol>8. Ex-vivo-Messung des extrazellulären FD-Glukosemangels in Organen
<ol><li>Behandeln Sie Mäuse mit Verbindungen, die den Glukosestoffwechsel vor der Organdissektion stimulieren, wie folgt.</li>
	<li>Verwenden Sie neun Wochen alte männliche Lep-ob-Mäuse (n = 11). Füttern Sie alle Mäuse vor dem Experiment mit einer regelmäßigen Chow-Diät.</li>
	<li>Weisen Sie Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen für intraperitoneale (i.p.) Injektionen ein.<ol><li>Injizieren Sie Mäuse aus der Kontrollgruppe Lepob mit 0,1 ml sterilem PBS (n = 4).</li>
		<li>Injizieren Sie Mäusen aus der Insulin-Lep-ob-Gruppe 0,1 ml steriles PBS, das 12 IE Humaninsulin pro Gramm Körpergewicht (BW) enthält (n = 3).</li>
		<li>Injizieren Sie Mäuse aus der AAC2 Lepob-Gruppe mit 0,1 ml sterilem PBS, das 0,1 nmol AAC2 pro Gramm Körpergewicht (BW) (n = 4) enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach 15 min inhalieren Mäuse 5% Isofluran und Exsanguinatblut durch Herzpunktion von den betäubten Tieren26.</li>
	<li>Sezieren Sie viszerales epidydimales weißes Fettgewebe (200 mg), Leber (200 mg) und das ganze Gehirn von jedem Tier. Verwenden Sie eine Biosicherheitshaube der Klasse II für die Handhabung von Geweben.</li>
	<li>Bereiten Sie FD-Glucose (0,29 mM) Arbeitslösung in glukosefreiem DMEM in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II ohne Licht vor.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenz der FD-Glucose-Arbeitslösung (0,29 mM) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplattenleser.</li>
	<li>Inkubieren Sie die entnommenen Gewebe / Organe in einer 6-Well-Platte, die PBS enthält, für 1 min. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einem separaten Brunnen.</li>
	<li>Nach 1 Minute legen Sie jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS zu absorbieren. Gewebe/Organe in eine separate 6-Well-Platte mit 4.000 μL glucosefreiem DMEM überführen und 2 min inkubieren.</li>
	<li>Nach 2 min entfernen und übertragen Sie das Gewebe in Vertiefungen einer 6-Well-Platte, die 0,29 mM FD-Glukose-Arbeitslösung (1 ml/Well) enthält. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten, die Gewebe enthalten, in FD-Glucose-Arbeitslösung bei 37 ° C (5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit).</li>
	<li>Sammeln Sie 100 μL FD-Glukose-Arbeitslösung aus jedem Bohrloch nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation, um die Kinetik der extrazellulären FD-Glukoseerschöpfung zu analysieren. Vor und nach dem Sammeln schütteln.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μL FD-Glucose-Arbeitslösung in 96-Well-Platten, um die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 nm mit einem Mikroplattenleser zu messen.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Fluoreszenz auf den 0-Minuten-Wert (100%) für jedes Organ in jedem Tier (Abbildung 3).</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben keine Probleme offenzulegen und haben keinen Interessenkonflikt.

Der direkte Vergleich der extrazellulären FD-Glukose-Depletion mit der normalisierten intrazellulären Glukoseaufnahme in der Zellkultur zeigte eine hohe Korrelation, was darauf hindeutet, dass der extrazelluläre Glukosemangel eine Ersatzmessung für die Beurteilung der Glukoseaufnahme sein könnte. Die Messung von extrazellulärer FD-Glukose kann einen breiten Bereich von FD-Glukosekonzentrationen verwenden, auch 0,5-2,5 μg FD-Glukose / ml scheinen den optimalen Bereich zu liefern. Extrazelluläre FD-Glukose erfordert keine ...

Die Nachfrage nach der Messung der Glukoseaufnahme steigt zusammen mit der dringenden Notwendigkeit, einen epidemischen Anstieg einer Vielzahl von Krankheiten, die vom Glukosestoffwechsel abhängen, anzugehen. Zugrunde liegende Mechanismen von degenerativen Stoffwechselerkrankungen, neurologischen und kognitiven Störungen1, entzündlichen 2 und Infektionskrankheiten3, Krebs4,5 sowie Alterung6, hängen vom Glukosestoffwechsel für Energie und deren Speicherung, anabole Prozesse, Protein- und Genmodifikation, Signalisierung, Regulation von Genen und Nukleinsäuresynthese und Replikation ab 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) steht in direktem Zusammenhang mit einer Fehlfunktion der Regulation der Glukoseaufnahme. DM ist ein Spektrum chronischer Krankheiten wie Typ-1-, -2- und -3-Diabetes mellitus, Schwangerschaftsdiabetes, Altersdiabetes der Jungen und andere Arten dieser Krankheit, die durch Umwelt- und / oder genetische Faktoren induziert werden. Im Jahr 2016 zeigte der erste globale Bericht der WHO über Diabetes, dass sich die Zahl der Erwachsenen, die mit der am weitesten verbreiteten DM leben, seit 1980 auf 422 Millionen Erwachsene fast vervierfachthat 10, und diese Zahl der DM-Patienten ist in den letzten Jahrzehnten exponentiell gestiegen. Allein im Jahr 2019 wurden schätzungsweise1,5 Millionen Todesfälle direkt durch 10 DM verursacht. Dieser dramatische Aufschwung ist auf den Anstieg der Typ-2-DM und die Bedingungen zurückzuführen, die sie antreiben, einschließlich Übergewicht und Fettleibigkeit10. Die COVID-19-Pandemie zeigte einen zweifachen Anstieg der Mortalität bei Patienten mit DM im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung, was auf die tiefgreifende, aber wenig verstandene Rolle des Glukosestoffwechsels bei der Immunabwehrhindeutet 3. Prävention, Früherkennung und Behandlung von DM, Fettleibigkeit und anderen Krankheiten erfordern die Optimierung von Messungen der Glukoseaufnahme durch verschiedene Gewebe und die Identifizierung von Umweltfaktoren 11, Ernährung 12, endokrine13, genetische14 und epigenetische 15, die die Glukoseaufnahme beeinflussen.
In der Forschung wird die intrazelluläre und/oder Gewebeaufnahme von Glukose üblicherweise durch fluoreszenzmarkierte Glukose (FD-Glukose) in vitro 16,17,18 und in vivo 19 gemessen. FD-Glucose wurde zu einer bevorzugten Methode im Vergleich zu präziseren Methoden mit radioaktiv markierter Glukose 20, analytischer Massenspektroskopieanalyse 21, Metabolomik 22, Kernspinresonanzmethoden 23 und Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)5,24. Im Gegensatz zur Aufnahme von FD-Glukose können analytische Methoden, die mehr biologisches Material erfordern, eine mehrstufige Probenvorbereitung, teure Instrumente und komplexe Datenanalysen umfassen. Effektive und kostengünstige Messungen der FD-Glukoseaufnahme in Zellkulturen wurden in Proof-of-Concept-Experimenten verwendet und erfordern möglicherweise eine Validierung durch andere Methoden.
Die Grundlage der FD-Glukoseanwendung für Glukoseaufnahmestudien ist der reduzierte Metabolismus von FD-Glukose im Vergleich zu endogener Glukose25. Nichtsdestotrotz sind sowohl endogene Glukose als auch FD-Glukose dynamisch auf alle zellulären Kompartimente verteilt, um sie in anabolen, katabolen und Signalprozessen einzusetzen. Die Kompartimentierung und zeitabhängige Verarbeitung25 von FD-Glucose stören die Fluoreszenzmessungen und stellen die wichtigsten limitierenden Faktoren für die Verwendung dieses Assays in Hochdurchsatz-Screening-Experimenten, kinetischen Analysen, 3D-Zellkulturen, Co-Kulturen und Gewebeexplantationsexperimenten dar. Hier liefern wir Daten, die eine hohe Korrelation zwischen dem extrazellulären Abbau von FD-Glukose und seiner intrazellulären Aufnahme zeigen, was auf den extrazellulären Abbau von FD-Glucose als Ersatzmessung für die intrazelluläre Glukoseaufnahme hindeutet. Die Messung des extrazellulären Erschöpfungs von Glukose wurde angewendet, um gewebespezifische Unterschiede in der Glukoseaufnahme bei Mäusen, die mit Insulin behandelt wurden, und einem experimentellen Medikament18 zu validieren, um einen Proof-of-Principle dieser Methode zu liefern.
Das aktuelle Protokoll beschreibt intrazelluläre und extrazelluläre (Abbildung 1) Messungen der FD-Glukoseaufnahme in 3T3-L1-Zellen. Protokollabschnitte 1-7 erklären die Kultur und das Wachstum von Zellen für 48 h; Zellhunger, Stimulation und extrazelluläre Basismessungen; und Poststimulationsmessungen von extrazellulärer FD-Glucose und intrazellulären Messungen von FD-Glucose und Protein. Protokollabschnitt 8 beschreibt die Ex-vivo-Messung der extrazellulären Aufnahme von FD-Glucose in Geweben, die von ob /ob-Mäusen in Gegenwart und Abwesenheit von Insulin und Aminosäureverbindung 2 (AAC2) seziert wurden, wie an anderer Stelle18 beschrieben.

<table><tbody><tr><td>3T3-L1 Maus-Fibroblasten</td><td>ATCC</td><td>CL-173</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Falcon</td><td>353227</td><td>Kunststoffware</td></tr><tr><td>B6. V-Lepob/J männliche Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Lagernummer 000632</td><td>Mäuse</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 modularer Multimode-Mikroplatten-Reader (Fisher Scientific, USA)</td><td>Fisher Scientific, Vereinigte Staaten von Amerika</td><td> B-SHT</td><td>Gerät</td></tr><tr><td>Kälberserum</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>161790-060</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Kälberserum</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>26010-066</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Zellinkubator</td><td>Forma</td><td>Series II Water Jacket</td><td>Device</td></tr><tr><td>Diet (Maus-/Rattennahrung, bestrahlt)</td><td>Envigo</td><td>Teklad LM-485</td><td></td></tr><tr><td>Diät Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma LifeScience</td><td>D2650-100 ml</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp; 11965-092</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500mL</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Fluoreszierend 2-Desoxy-2-[(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose)</td><td>Sigma</td><td>72987-1MG</td><td>Assay</td></tr><tr><td>Glukosefrei und phenolrotfrei DMEM</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Humaninsulin 10 mg/ml</td><td>MilliporeSigma, Kat N 91077C</td><td>Kat N 91077C</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Isofluran, 5%</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Anästetisches</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (P/S)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DA537-500 mL</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Pierce Bichininsäure (BCA) Protein-Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat N23225</td><td>Assay</td></tr><tr><td>Radioimmunpräzipitation Assay Lysepuffer</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24948</td><td>Assay</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp; 25300-054</td><td>Zellkultur</td></tr></tbody></table>

extrazellulärer glukosemangel als indirektes maß für die glukoseaufnahme in zellen und geweben ex vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Die anhaltende weltweite Diabetes-Epidemie erhöht die Nachfrage nach der Identifizierung von umweltbedingten, ernährungsphysiologischen, endokrinen, genetischen und epigenetischen Faktoren, die die Glukoseaufnahme beeinflussen. Die Messung der intrazellulären Fluoreszenz ist eine weit verbreitete Methode, um die Aufnahme von fluoreszenzmarkierter Glukose (FD-Glukose) in Zellen in vitro zu testen oder um glukoseverbrauchende Gewebe in vivo abzubilden. Dieser Assay bewertet die Glukoseaufnahme zu einem ausgewählten Zeitpunkt. Die intrazelluläre Analyse geht davon aus, dass der Stoffwechsel von FD-Glukose langsamer ist als der von endogener Glukose, die an katabolen und anabolen Reaktionen und Signalen beteiligt ist. Der dynamische Glukosestoffwechsel verändert jedoch auch die Aufnahmemechanismen, was kinetische Messungen der Glukoseaufnahme als Reaktion auf verschiedene Faktoren erfordern würde. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des extrazellulären FD-Glukose-Abbaus und validiert ihre Korrelation mit der intrazellulären FD-Glukose-Aufnahme in Zellen und Geweben ex vivo. Der extrazelluläre Glukosemangel kann potenziell für kinetische und dosisabhängige Hochdurchsatzstudien sowie für die Identifizierung von Verbindungen mit glykämischer Aktivität und ihren gewebespezifischen Wirkungen geeignet sein.

Die intrazelluläre Aufnahme und der extrazelluläre Glukosemangel wurden in 3T3-L1-Präadipozyten als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von FD-Glucose (Abbildung 2) mit und ohne Insulinstimulation gemessen. Abbildung 2A zeigt eine dosisabhängige Erhöhung der intrazellulären Aufnahme von FD-Glukose, die in Gegenwart von Insulin signifikant erhöht war. Die gleichzeitige Abnahme der extrazellulären FD-Glukose in denselben Zellen ist in <strong class="xfig...

Die extrazelluläre Erschöpfung von fluoreszenzmarkierter Glukose korreliert mit der Glukoseaufnahme und könnte für das Hochdurchsatz-Screening der Glukoseaufnahme in ausgeschnittenen Organen und Zellkulturen verwendet werden.

Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Die Glukoseaufnahme ist der Schlüssel zum Verständnis von Gesundheit und Krankheit. Denn Glukose spielt eine entscheidende Rolle bei metabolischen und strukturellen Anforderungen im menschlichen Körper sowie eine wichtige Rolle bei der Regulierung. Die extrazelluläre Messung von Glukose ermöglicht die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays für die Kinetik der Glukoseaufnahme in Zellen, Geweben und Organen unterschiedlicher genetischer Herkunft als Reaktion auf Nährstoffe oder Medikamente.Dieser Assay wäre ein wertvolles Werkzeug für die Entdeckung von Therapeutika und Ernährung für Diabetes, Krebs, degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Fettleibigkeit und alle Erkrankungen der Glukose und des Stoffwechsels. Der Assay benötigt eine Anpassung der Zeit für Hunger und Stimulation, die auf metabolischen Besonderheiten für verschiedene Gewebe und Zellkulturen basieren sollte. Kultur von 3T3-L1-Mausfibroblasten durch Plattieren von 10 bis 6 Zellen, verdünnt in 20 Milliliter Medium 1 in 296 Well-Platten.Platte 100 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung, um die Homogenität dieser Suspension durch Mischen zu erhalten. Züchten Sie Zellen für 48 Stunden in einem 37-Grad-Inkubat

extracellular-glucose-depletion-as-an-indirect-measure-glucose-uptake

Research

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Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur indirekten Messung der intrazellulären Glukoseaufnahme. Der Assay verwendet ein fluoreszenzmarkiertes Glukoseanalogon, um eine Korrelation zwischen der extrazellulären Glukoseverarmung und der intrazellulären Glukoseaufnahme herzustellen.

In vitro Glukoseabbau-Assay: Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Quantifizierung der zellulären Glukoseaufnahme durch extrazelluläre Glukoseabbaumessung

In diesem Video demonstrieren wir eine ex vivo-Technik zur Messung der extrazellulären Glukoseanaloga-Depletion in entnommenen Mausorganen. Dabei wird das Mausgewebe in einer Lösung inkubiert, die fluoreszenzmarkierte Desoxyglukose enthält, die von den Zellen aufgenommen wird. Die Glukoseanalogonaufnahme kann indirekt durch Messung der Fluoreszenz des inkubierten Mediums bestimmt werden.

Messung der extrazellulären fluoreszierenden Glukoseanaloga-Depletion: Eine Surrogat-Messtechnik zur Beurteilung der Glukoseaufnahme in Mausorganen ex vivo

Wir beschreiben hier eine genaue, reproduzierbare und bequem biochemische Methode zur Titration von Glykogen in vitro. Diese Technik nutzt die Abcam Glykogen-Assay-Kit und ist auf aufeinander folgende Hydrolyse von Glykogen durch Fluoreszenz Glukose und Glukose-Titration.

Biochemische Titration von Glykogen<em&gt; In-vitro-</em

Monozyten sind integrale Bestandteile des menschlichen angeborenen Immunsystems, die auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind, wenn sie aktiviert werden. Wir beschreiben ein durchflusszytometrisches Protokoll zur Messung der Glukosetransporterexpression und der Glukoseaufnahme durch Gesamtmonozyten und Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Diese Studie beschreibt ein Protokoll, das 18F-FDG und Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT) Bildgebung zusammen mit kinetischer Modellierung verwendet, um die in vivo Echtzeitaufnahme von 18F-FDG in Gewebe zu quantifizieren.

Die Bestimmung Glucose Metabolism Kinetics Verwendung<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

Bei diesem Verfahren werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glucose-Aufnahmeraten werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2-Desoxy-D-Glucose.

Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in<em&gt; In vitro</em&gt; Kultivierte menschliche primäre Myotubes

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.

Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Die Triglycerid-Lipolyse in Adipozyten ist ein wichtiger Stoffwechselprozess, der zur Freisetzung von freien Fettsäuren und Glycerin führt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen und stimulierten Lipolyse in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung.

Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

Mehrere Zelltypen in der Netzhaut, darunter Endothelzellen, Neuronen und Gliazellen, exprimieren Glukosetransporter (GLUTs), um die Glukoseaufnahme in die Zellen zu ermöglichen. Unter Verwendung von ex vivo neuraler Netzhaut der Maus und dem fluoreszierenden Glukoseanalogon 6-NBDG beschreiben wir eine relativ schnelle und kostengünstige Methode zur Messung der Glukoseaufnahme in der gesamten Mausnetzhaut.

Messung der Aufnahme des Glukoseanalogons 6-(n-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-desoxyglucose in intakter neuraler Netzhaut der Maus

Lernen Sie die extrazelluläre Glukosemessung zur Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays für Stoffwechselstudien in Zellen und Geweben. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Glukoseaufnahme-Kinetiken bei verschiedenen Nährstoffen und Medikamenten.

Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

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