Name: Isolierung von intrapulmonalen Arterien- und glatten Muskelzellen zur Untersuchung von Gefäßreaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung intrapulmonaler Arterien und glatter Muskelzellen zur Untersuchung vaskulärer Reaktionen. Diese Methode ermöglicht pharmakologische Studien zur Gefäßphysiologie.

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Die Autoren danken dem National Research Council of Thailand, dem Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) und dem International Research Network (IRN61W0005) für die finanzielle Unterstützung sowie dem Department of Physiology Faculty of Medical Science der Naresuan University für die Unterstützung von Forschungseinrichtungen.

Die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden von der Ethikkommission des Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), Protokollnummer NU-AE620921, für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke genehmigt.
1. Zusammensetzung physiologischer Lösungen
<ol><li>Die Krebslösung wird durch Auflösen von Chemikalien in destilliertem Wasser formuliert, um die Endkonzentrationen wie folgt zu erreichen: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2und 11 mM Glucose8. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,3 mit 1 M NaOH ein und heizen Sie vor Gebrauch auf 37 °C vor.</li>
	<li>Bereiten Sie kalte Krebslösung ähnlich wie in Schritt 1.1 beschrieben vor. zur Verwendung als Isoliermedium von IPA, wie in Schritt 2 beschrieben.</li>
</ol>2. Isolierung der intrapulmonalen Arterie (IPA)
<ol><li>Betäuben Sie 8 Wochen alte männliche Wistar-Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumthiopental (100 mg/kg)9. Überprüfen Sie die Ratten auf ihre Reaktion auf schmerzhafte Reize im Tiefschlaf, indem Sie eine Pinzette verwenden, die an ihre Füße geklemmt ist, und stellen Sie dann sicher, dass die Ratten keine Fußrückzugsreaktion haben, bevor Sie sie in Schritt 2.2 einschläfern.</li>
	<li>Schneiden Sie den mittleren Brustkorb der Ratte und das Herzterminal mit einer Schere (Größe 14 cm) auf. Dann lokalisieren Sie die Lungenwurzel mit einer Schere (Größe 14 cm). Die gesamte Lunge wird mit einer Schere geschnitten und in kalte Krebslösung10,11 getaucht.</li>
	<li>Schneiden Sie einen einzelnen Lungenlappen mit einer Schere (Größe 11 cm) und legen Sie ihn auf eine Petrischale (Größe 9 cm) mit der medialen Seite/Wurzel der Lunge nach oben (Abbildung 2A, B). Beobachten und identifizieren Sie die Ausrichtung der Vene, der Bronchien und der Arterie von oben nach unten (Abbildung 2B).</li>
	<li>Den Bronchus längs mit einer Schere (Größe 11 cm) aufschneiden. Verwenden Sie dann die Pinzette (Größe 11 cm), um die Spitze des Bronchus zu greifen. Sezieren und entfernen Sie vorsichtig die Bronchus und Venen aus der Lunge. Beachten Sie, dass die IPA immer anatomisch unter dem Bronchus ausgerichtet ist.</li>
	<li>Danach kann die Haupt-IPA visualisiert werden (Abbildung 2C). Greifen Sie mit der Pinzette (Größe 11 cm) die Spitze des IPA und sezieren Sie sie vorsichtig mit einer Schere (Größe 11 cm) aus dem Lungengewebe.</li>
	<li>Bewahren Sie das isolierte IPA in kalter Krebslösung auf, bis die Organbadanordnung eingerichtet ist (pH 7,3 und Temperatur 4 °C)1 1.</li>
</ol>3. Isolierung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs)
<ol><li>Isolieren Sie IPA wie zuvor in Schritt 2 beschrieben. Den Hauptast des IPA längs mit einer Schere (Größe 11 cm) aufschneiden und in kleine Streifen (2 mm) schneiden (Abbildung 3A).</li>
	<li>Die IPA-Streifen werden in ein Dissoziationsmedium (DM)10,12 getaucht, das 110 mM NaCl,5 mM KCl, 0,5 mMKH2PO4, 0,5 mM NaH2PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM Phenolrot, 10 mM Taurin, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 11 mM Glucose und 0,16 mMCaCl2 enthält. und stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH ein. Die Streifen werden 1 h lang bei 4 °C in TM mit 1 mg/ml Papain, 0,04 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,4 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT) inkubiert und 15 min bei 37 °C weiter inkubiert. 1 mg/ml Kollagenase Typ 1A in DM zugeben und bei 37 °C für 5 min weiter inkubieren. HINWEIS: DM ist eine Lösung zur Erhaltung der Zelllebensfähigkeit. Papain und Kollagenase Typ 1A sind Enzyme, die die extrazellulären Matrixproteine abbauen, um einzelne Zellen zu isolieren. BSA ist ein Serumalbuminprotein, das zur Stabilisierung von Enzymen während der Lagerung und enzymatischer Reaktionen verwendet wird. DTT ist ein Reduktionsmittel, das verwendet wird, um die Aktivität von Enzymen während des Zellisolierungsprozesses zu stabilisieren und zu fördern. Taurin ist Aminoschwefelsäure, die zur Stabilisierung der Zellmembran und Zellintegrität verwendet wird.</li>
	<li>Das Gewebe wird in frisches TM überführt und durch sanftes Reiben mit einer Pasteur-Glaspipette dispergiert (Abbildung 3B). Triturieren Sie weiter, bis isolierte VSMCs in der Badelösung unter dem Mikroskop sichtbar werden (Abbildung 3C). HINWEIS: Frisch isolierte VSMCs können zur Untersuchung der vaskulären Physiologie / Pathophysiologie verwendet werden, zusammen mit verschiedenen experimentellen Untersuchungen, wie Modulation durch pharmakologische Wirkstoffe, elektrophysiologische Patch-Clamp-Analyse, Kalziumbildgebung usw. Die vorliegende Studie konzentriert sich jedoch nur auf die Vasorelaxation von isoliertem IPA unter Verwendung der Organbadtechnik.</li>
</ol>4. Organbadtechnik
<ol><li>Isolieren Sie IPA wie zuvor in Schritt 2 beschrieben. Schneiden Sie den Hauptzweig des IPA in Ringe von ~2 mm Länge (Abbildung 2D)13.</li>
	<li>Befestigen Sie die IPA-Ringe in Orgelbadkammern (Abbildung 4), indem Sie sie auf zwei Edelstahldrähte mit einem Durchmesser von 40 μm auffädeln (Abbildung 2E)11,13,14.</li>
	<li>Befestigen Sie Edelstahldrähte, die mit IPA-Ringen montiert sind, an den isometrischen Kraftaufnehmern, die mit dem Datenerfassungsgerät und dem Computersystem verbunden sind, das mit der geeigneten physiologischen Software zur Datenaufzeichnung und -analyse installiert ist, und erhöhen Sie dann vorsichtig die Spannung des IPA-Rings auf 1 g11.</li>
	<li>Lassen Sie die Gefäßsegmente für ca. 45 min bei einer Ruhespannung von 1 g im Gleichgewicht liegen. Stellen Sie während der Gleichgewichtsphase sicher, dass die Krebslösung regelmäßig alle 15 Minuten gewechselt wird. Nach dieser Äquilibrierungsphase wird die Lebensfähigkeit der Gefäße durch Messung ihrer Vasokonstriktion auf eine Lösung mit hohem extrazellulärem K+ (80 mM) gemessen, die 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2und 11 mM Glucose 10,11 enthält.</li>
	<li>Beurteilen Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Endothel, indem Sie die Relaxationsreaktion auf Acetylcholin (1 x 10−5 M) in Ringen berechnen, die mit Phenylephrin (PE, 1 x 10−5 M) vorkontrahiert sind (Beachten Sie, dass die vaskulären Kontraktionen nach Zugabe von PE für 1 h stabil bleiben). Betrachten Sie die Ringe als endothelintakt, wenn sie mehr als 70% Relaxation quantifizieren (Abbildung 5A). Wenn sie weniger als 10% Relaxation aufweisen, betrachten Sie die Ringe als endothelentblößt13 (Abbildung 5B). Entfernen Sie das Endothel mechanisch, indem Sie es vorsichtig mit einem kleinen Draht in das Gefäß reiben, um eine Denudation zu induzieren.</li>
	<li>Wieder ausgleichen Sie die arteriellen Ringe für 30 min vor Beginn der Testexperimente.</li>
</ol>5. Vasorelaxierende Reaktion auf Pflanzenextrakt
<ol><li>Untersuchen Sie die entspannende Wirkung des Pflanzenextrakts, indem Sie IPA-Ringe mit PE (1 x 10−5 M) vorkontrahieren.</li>
	<li>Dann fügen Sie den Pflanzenextrakt (1-1.000 μg / ml) vorsichtig kumulativ zu endothelintakten Ringen und endothelentblößten Ringen hinzu, um eine Vasorelaxation zu induzieren (Abbildung 6A, B) und eine konzentrationsabhängige Reaktionskurve zu erhalten (Abbildung 6C).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Wirkung von Dimethylsulfoxid (DMSO), das als Lösungsmittel verwendet wird, ebenfalls ähnlich bewertet wird, um als Negativkontrolle zu dienen (Abbildung 6C).</li>
</ol>6. Mechanismus der Pflanzenextrakt-induzierten Vasorelaxation über das Endothel
<ol><li>Bewerten Sie den vasorelaxierenden Wirkmechanismus des Pflanzenextrakts über endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS), Cyclooxygenase (COX)13 und Endothel-abgeleiteten Hyperpolarisationsfaktor (EDHF)-Signalwege, indem die endothelintakten IPA-Ringe 30 min lang mit den folgenden Inhibitoren inkubiert werden (Abbildung 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-argininmethylester (L-NAME, ein eNOS-Inhibitor)9, 1 x 10−5 M Indomethacin (ein COX-Hemmer)9, oder eine Kombination aus 1 x 10−7 M Apamin (ein kleiner Calcium-aktivierter Kaliumkanalblocker) und 1 x 10−7 M Charybdotoxin (ein intermediärer und hochleitfähiger kalziumaktivierter Kaliumkanalblocker), bevor IPA-Kontraktionen mit 1 x 10−5 M PE induziert werden.</li>
	<li>Dann, nachdem sich die Kontraktionen zur PE-Stabilisierung stabilisiert haben, fügen Sie kumulative Konzentrationen (0,1-1.000 μg / ml) des Pflanzenextrakts hinzu.</li>
	<li>Präsentieren Sie die Wirkungen von Pflanzenextrakt als prozentuale Relaxation der IPA-Ringe in Gegenwart von Inhibitoren im Vergleich zur Reaktion der IPA-Ringe ohne Inhibitoren (Abbildung 7B-D) und konstruieren Sie die Konzentrations-Wirkungskurve.</li>
</ol>7. Mechanismus der Pflanzenextrakt-induzierten Vasorelaxation über K+ -Kanäle der glatten Gefäßmuskulatur
<ol><li>Vorinkubierte Endothel-entblößte IPA-Ringe für 30 min mit 1 x 10−3 M 4-Aminopyridin (4-AP), einem Blocker des spannungsabhängigen Kaliumkanals (KV) (Abbildung 8A), 1 x 10−5 M Glibenclamid, einem Blocker des ATP-sensitiven Kaliumkanals (KATP) oder 1 x 10−7 M Iberiotoxin, einem Blocker mit großem Leitwert Ca 2+-aktivierten K+-Kanälen (KCa), vor der Induktion von IPA-Kontraktionen mit 1 x 10−5 M PE.</li>
	<li>Dann fügen Sie kumulative Konzentrationen des Pflanzenextrakts hinzu.</li>
	<li>Präsentieren Sie die Wirkungen von Pflanzenextrakt als prozentuale Relaxation der IPA-Ringe mit Inhibitor im Vergleich zu den IPA-Ringen ohne Inhibitor (Abbildung 8B-D) und konstruieren Sie die Konzentrations-Wirkungskurve.</li>
</ol>8. Mechanismus der Pflanzenextrakt-induzierten Vasorelaxation durch Hemmung des extrazellulären Kalziumeinstroms (Ca2+) in VSMCs
<ol><li>Vorinkubierte Endothel-entblößte IPA-Ringe für 30 min in Ca2+-freier Krebslösung, die 1 mM Ethylenglykol-Bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) enthält (Abbildung 9A).</li>
	<li>Ersetzen Sie dann die Badelösung 10 min lang durch eine Ca2 +-freie 80 mM K+ -Lösung, um die VSMCs zu depolarisieren, die dann die VOCCs öffnen (Abbildung 9A).</li>
	<li>Kumulativ CaCl2 (0,01-10 mM) zugeben, um eine Vasokonstriktion des IPA zu induzieren und die Konzentrations-Wirkungskurve zu konstruieren(Abbildung 9A).</li>
	<li>Wiederholen Sie dieses Protokoll in den gleichen IPA-Ringen, aber inkubieren Sie sie mit Pflanzenextrakt oder 1 μM Nicardipin (L-Typ Ca 2+ Kanalblocker) in Ca2+ mit 80 mM K+ Lösung für 10 min, gefolgt von der kumulativen Zugabe von CaCl28.</li>
	<li>Vergleichen Sie schließlich die kontraktile Reaktion mit der maximalen Kontraktion, die zuvor durch Kontroll-CaCl-2-Herausforderungen hervorgerufen wurde (Abbildung 9B).</li>
</ol>9. Mechanismus der Pflanzenextrakt-induzierten Vasorelaxation durch Hemmung der intrazellulären Calciumfreisetzung (Ca2+) aus dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR)
<ol><li>Endothel-entblößte IPA-Ringe für ca. 5 min einer 80 mM K+-Lösung aussetzen, die VSMCs depolarisieren, die VOCCs öffnen und schließlich die Ca2+-Last in die SR erzeugen (Abbildung 10A).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Badelösung für 10 min durch Ca2+-freie Krebslösung, die 1 mM EGTA enthält (Abbildung 10A).</li>
	<li>Fordern Sie dann die IPA-Ringe mit 1 x 10−5 M PE heraus, was den Phospholipase-C/IP-3-Weg aktiviert, schließlich Ca2+ aus der SR freisetzt und eine vorübergehende Kontraktion von IPA hervorruft (Abbildung 10A).</li>
	<li>Wiederholen Sie dasselbe Protokoll, um ebenfalls vorübergehende Kontraktionen zu PE zu ermitteln.</li>
	<li>Fordern Sie die IPA-Ringe erneut mit 80 mM K+ Lösung für ca. 5 min heraus, dann ersetzen Sie die Badelösung für 10 min durch Ca2+-freie Krebslösung, die 1 mM EGTA mit oder ohne Pflanzenextrakt enthält.</li>
	<li>Fordern Sie die IPA-Ringe erneut mit 1 x 10−5 M PE heraus.</li>
	<li>Vergleichen Sie die durch PE induzierten IPA-Kontraktionen zwischen dem Zustand mit und ohne Pflanzenextrakt (Abbildung 10B).</li>
</ol>10. Statistische Auswertung
<ol><li>Vergleichen ±Sie diese Werte mit dem Student's t-Test oder analysieren Sie diese Werte mit einer Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt vom Tukey-Kramer-Post-hoc-Test mit geeigneter statistischer Software. Betrachten Sie die Unterschiede bei p < 0,05 als statistisch signifikant. Hier gab es n = 6 Ratten/Versuchsprotokoll. HINWEIS: Die Aufzeichnung von Vasokonstriktion und Vasorelaxation kann mit geeigneter auf dem Computer installierter Software beurteilt werden. Zum Beispiel zeigt Abbildung 5A , dass, wenn die Blutgefäße durch die PE stimuliert werden, die eine Kontraktion verursacht, dies an der erhöhten Spannung der ursprünglichen Spur beobachtet werden konnte. Die Verfolgung stabilisiert sich in 20-30 Minuten, was als 100% ige Kontraktion angesehen wird. Danach stimuliert das ACh die Blutgefäße und bewirkt eine Entspannung, die an der verminderten Spannung der ursprünglichen Spur beobachtet werden konnte. Somit wird die reduzierte Spannung als Prozentsatz im Vergleich zu 100% Kontraktion berechnet.</li>
</ol>

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<li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li>
<li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Manuskript beschreiben wir die Technik zur Isolierung von Ratten-IPA und VSMCs. Mehrere experimentelle Protokolle wurden verwendet, um die vaskuläre Reaktion von IPA in vitro zu untersuchen, die verwendet werden kann, um die pharmakologische Wirkung und mechanistische Grundlage der durch Pflanzenextrakt induzierten IPA-Vasorelaxation zu charakterisieren.
Hinsichtlich der endothelabhängigen gefäßerweiternden Wirkung des Pflanzenextrakts wurden verschiedene Blocker wie L-NAME ...

Das Lungengefäßsystem ist ein Niederdruck-Gefäßsystem, in dem die Hauptfunktion darin besteht, sauerstoffarmes Blut in den gasaustauschenden Bereich der Lunge zu liefern. Die Lungenarterien in der Lunge sind in Ästen parallel zum Bronchialbaum angeordnet und bilden schließlich ein ausgedehntes Netzwerk von Kapillaren, das sich über mehrere Alveolen erstreckt und schließlich zu Venolen und Venen zusammenführt. Der Gefäßtonus der Lungenarterie wird durch mehrere Faktoren gesteuert, die die Interaktion zwischen dem Endothel und den vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) beinhalten1.
In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die endothelabhängige und -unabhängige Vasorelaxation der intrapulmonalen Arterie (IPA). Im Hinblick auf die endothelabhängige Vasorelaxation könnten verschiedene Mechanismen, die auf der Oberfläche von Endothelzellen auftreten, die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöhen (z.B. bindet Acetylcholin [ACh] an Muskarinrezeptor [M3]), was zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), Prostacyclin (PGl2) und Endothel-abgeleitetem Hyperpolarisationsfaktor (EDHF) führt (Abbildung 1 ). NO ist der wichtigste Endothel-abgeleitete Entspannungsfaktor, der aus L-Arginin durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)2 synthetisiert wird, die dann aus den Endothelzellen zu VSMCs dissoziiert (Abbildung 1) und das Enzym lösliche Guanylylzyklase (sGC) stimuliert; Dieses Enzym wandelt Guanosintriphosphat (GTP) in zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) um, das die Proteinkinase G (PKG) aktiviert und den zytosolischen Ca2+-Spiegel senkt, wodurch eine Vasorelaxation verursacht wird (Abbildung 1). PGl2 wird von Endothelzellen über den Cyclooxygenase (COX) -Weg 3,4 synthetisiert. Es bindet an den Prostacyclinrezeptor (IP) auf VSMCs und stimuliert das Enzym Adenylylzyklase (AC), das dann Adenosintriphosphat (ATP) in zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) umwandelt (Abbildung 1)3,4. cAMP aktiviert die Proteinkinase A (PKA), senkt den zytosolischen Ca2+-Spiegel und verursacht Vasorelaxation5 (Abbildung 1). Der EDHF-Signalweg ist auch an der endothelabhängigen Vasorelaxation über verschiedene endotheliale Mediatoren und elektrische Ereignisse beteiligt. Die Aktivierung des EDHF-Signalwegs führt zur Hyperpolarisation von VSMCs, wodurch spannungsbetriebene Ca 2+ Kanäle (VOCCs) geschlossen, intrazelluläre Ca2+ Spiegel reduziert und Vasorelaxation induziertwerden 6. Die endothelunabhängige Vasorelaxation erfolgt direkt an VSMCs über mehrere Mechanismen, wie die Reduktion des intrazellulären Ca 2+ Spiegels, die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase (MLCK), die Aktivierung der Myosin Light Chain Phosphatase (MLCP) und die Reduktion der Ca2+ Sensitivität gegenüber der kontraktilen Maschinerie von VSMCs. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Vasorelaxation, die durch die Öffnung verschiedener K+-Kanäle, die Blockade von VOCCs und die Hemmung der Ca 2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum7 verursacht wird, was zur Senkung der intrazellulären Ca 2+-Spiegel führt, wodurch die VSMC-Myosin-Leichtkettenphosphorylierung bzw. die Myosin-Aktin-Bindung bzw. Querbrückenbildung verringert wird. letztendlich zu Vasorelaxation führen.
Die Technik zur Auswertung von Vasokonstriktions- und Vasorelaxationsmessungen in isoliertem IPA ist für Nagetiere gut etabliert, aber die Daten variierten je nach den experimentellen Protokollen. Die vorliegende Studie beschreibt die Methode zur Bewertung der vaskulären Reaktivitäten von IPA-Präparaten der Ratte in vitro, die in Abwesenheit externer Faktoren, die die vaskuläre Reaktion in vivo modulieren, wie Nervensignale, Hormone, Zytokine, Blutdruck usw., durchgeführt wurden.
Wir verwendeten mehrere experimentelle Protokolle mit dem Pflanzenextrakt als Beispiel für die Untersuchung der vaskulären Reaktivitäten von IPA. Verschiedene Blocker (Abbildung 1) wurden verwendet, um die Mechanismen der endothelabhängigen und -unabhängigen Vasorelaxation zu identifizieren, die durch den Pflanzenextrakt induziert werden. Dennoch können die gleichen Protokolle angepasst werden, um die vaskulären Reaktionen von IPA auf Medikamente, Extrakte oder sekundäre Pflanzenstoffe zu bewerten, die zur Behandlung verschiedener Lungenpathologien verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632 CAS-NR. 348-12-3</td><td></td></tr><tr><td>4-Aminopyridin (4-AP)</td><td>Aldrich Chemical</td><td>A78403 CAS-NR. 504-24-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625 CAS-NR. 60-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Apamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9459 CAS-NR. 24345-16-2</td><td></td></tr><tr><td>Rind Serumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153 CAS-NR. 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcholid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA960 CAS-NR. 1707055184</td><td></td></tr><tr><td>Charybdotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7802 CAS-NR. 95751-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891 CAS-Nr. 9001-12-1</td><td>aus Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>D(+)- Glukosemonohydrat</td><td>Millipore Corporation</td><td>K50876942 924 CAS-NR. 14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 CAS-NR. 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889 CAS-NR. 67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 CAS NO. 60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette 11 cm.</td><td>Rostfreie Dumoxel-Pinzette</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>14 cm.</td><td>Rostfreies Dumoxel-Glibenclamid</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6039 CAS-Nr. 16673-34-0</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Programm</td><td>Software Version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 CAS-NR. 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5904 CAS-NR. 1002546960</td><td>rekombinant von Mesobuthus tamulus</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378 CAS NO. 53-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Labchart Program</td><td>Software Version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australien).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Ajax Finechem</td><td>296 CAS-NR. 1506254995</td><td></td></tr><tr><td>Männliche Wistar-Ratten</td><td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG-Nitro-L-Argininmethylester (L-NAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751 CAS-NR. 51298-62-5</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510 CAS-NR. 54527-84-3</td><td></td></tr><tr><td>Orgelbad 15 mL.</td><td>-</td><td>-</td><td>Spezifische Bestellung durch die Forscher</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762 CAS-NR. 9001-73-4</td><td>FromPapaya Latex</td></tr><tr><td>Phenal red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5530 CAS-NR. 34487-61-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126 CAS-NR. 61-76-7</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Kemaus</td><td>KA383 CAS-NR. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Aldrich Chemical</td><td>EC231-913-4 CAS-NR. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>S+A2:E36odiumchlorid</td><td>Kemaus</td><td>KA465 CAS-NR. 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Schere 11 cm.</td><td>Spall</td> <td>Edelstahl-Schere</td><td></td></tr> <tr><td>14 cm.</td><td>Spall Stainless-Sodium</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bicarbonate</td><td>Ajax Finechem</td><td>475 CAS-NR. 912466</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Aldrich Chemical</td><td>33,198-8 CAS-NR. 7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Ajax Finechem</td><td>482 CAS-NR. 1506196602</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiopentalanesthal</td><td></td><td>JPN3010002 CAS-NR. 1C 314/47</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625 CAS-NR. 107-35-7</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad WBU 45</td><td>Memmert</td><td>2766 CAS-NR. -</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von intrapulmonalen arterien- und glatten muskelzellen zur untersuchung von gefäßreaktionen

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Die intrapulmonale Arterie (IPA) und die vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs), die aus Rattenlungen isoliert wurden, können verwendet werden, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Vasokonstriktion und Vasorelaxation zu untersuchen. Nach der Isolierung der IPA- und VSMCs können die Eigenschaften der vaskulären Reaktionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen in Abwesenheit extrinsischer Faktoren wie Nervensignale, Hormone, Zytokine usw. beurteilt werden. Daher dienen die IPA und VSMCs als hervorragende Modelle für die Untersuchung der vaskulären Physiologie / Pathophysiologie, zusammen mit verschiedenen experimentellen Untersuchungen, wie Modulation durch pharmakologische Wirkstoffe, Patch-Clamp-elektrophysiologische Analyse, Kalziumbildgebung usw. Hier haben wir eine Technik zur Isolierung des IPA verwendet, um vaskuläre Reaktionen in einem Organbadaufbau zu untersuchen. IPA-Segmente wurden über intraluminale Drähte auf die Organbadkammer montiert und durch verschiedene pharmakologische Wirkstoffe stimuliert. Die Veränderungen des IPA-Gefäßtonus (d.h. Vasokonstriktion und Vasorelaxation) wurden mit einem isometrischen Kraftaufnehmer und einer physiologischen Datenanalysesoftware aufgezeichnet. Wir implementierten mehrere experimentelle Protokolle, die angepasst werden können, um die Mechanismen der Vasorelaxation / Vasokonstriktion zur Untersuchung der pharmakologischen Aktivitäten von phytochemischen oder synthetischen Arzneimitteln zu untersuchen. Die Protokolle können auch verwendet werden, um die Rolle von Medikamenten bei der Modulation verschiedener Krankheiten, einschließlich pulmonaler arterieller Hypertonie, zu bewerten. Das IPA-Modell ermöglicht es uns, die Konzentrations-Wirkungs-Kurve zu untersuchen, die für die Bewertung der pharmakodynamischen Parameter von Arzneimitteln entscheidend ist.

Das Protokoll in der vorliegenden Studie wurde entwickelt, um die optimalen experimentellen Bedingungen für die Messung physiologischer Phänomene zu bestimmen, die in den vaskulären Reaktionen isolierter IPA-Präparate beobachtet werden. Die Pilotexperimente wurden durchgeführt, um die möglichen Ergebnisse, die zum Verständnis der vaskulären Effekte und der mechanistischen Grundlage der vasorelaxierenden Wirkung des Pflanzenextrakts beitragen, wie folgt zu beschreiben.
Vasorelaxierende ...

Vaskuläre Reaktionen des arteriellen Lungenkreislaufs können mit Hilfe von intrapulmonalen Arterien (IPA) und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) erforscht werden. Die vorliegende Studie beschreibt detailliert die Isolierung von IPA und die Protokolle, die zur Untersuchung der Vasorelaxation als Reaktion auf physiologische Reize verwendet werden.

Isolierung von intrapulmonalen Arterien- und glatten Muskelzellen zur Untersuchung von Gefäßreaktionen

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Diese Studie beschreibt die Isolierung der intrapulmonalen Arterie von Ratten und vaskulären glatten Muskelzellen. Mehrere experimentelle Protokolle wurden verwendet, wie z.B. die Verwendung der Organbadtechnik zur Untersuchung der vaskulären Reaktion der intrapulmonalen Arterie. Intrapulmonale Arterien und vaskuläre glatte Muskelzellen sind ausgezeichnete Modelle, um vaskuläre Physiologie und Pathophysiologie zu untersuchen.Anpassungen dieser Technik könnten die vaskulären Reaktionen von Medikamenten, Extrakten oder sekundären Pflanzenstoffen bewerten. Die Montage des isolierten intrapulmonalen arteriellen Rings in einem Organbad ermöglicht die Verwendung isolierter intrapulmonaler Arterien, um die Rolle eines Arzneimittels bei der Modulation verschiedener Krankheiten, einschließlich pulmonaler Hypertonie, zu bewerten. Die experimentellen Protokolle sind technisch machbar, aber die entscheidenden Schritte sind kompliziert und wesentlich für den Erfolg, so dass eine visuelle Demonstration es einfacher macht, sie zu verstehen und zu verfolgen.Kittiwoot To-on, ein Masterstudent in Physiologie vom Cardiovascular Research Unit Laboratory, Department of Physiology, Faculty of Medical Science, Naresuan University, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie einen einzelnen Lungenlappen mit einer 11-Zentimeter-Schere schneiden und auf eine neun Zentimeter große Petrischale legen, wobei die mediale Seite oder Lungenwurzel nach oben zeigt. Beobachten und identifizieren Sie die Ausrichtung der Vene, Bronchien und Arterie von oben nach unten.Schneiden Sie den Bronchus längs mit einer Schere auf. Verwenden Sie dann die 11-Zentimeter-Pinzette, um die Spitze des Bronchus zu greifen. Sezieren und entfernen Sie vorsichtig die Bronchus und Venen aus der Lunge.Verwenden Sie die Pinzette, um die Spitze der intrapulmonalen Arterie zu greifen und sie vorsichtig mit einer Schere aus dem Lungengewebe zu sezieren. Halten Sie die isolierte intrapulmonale Arterie in kalter Krebslösung, bis die Organbadanordnung eingerichtet ist. Nach der Isolierung der intrapulmonalen Arterie den Hauptast der intrapulmonalen Arterie längs mit der 11-Zentimeter-Schere aufschneiden und in zwei Millimeter große Streifen schneiden.Tauchen Sie die intrapulmonalen Arterienstreifen in DM, dann inkubieren Sie die Streifen für eine Stunde bei vier Grad Celsius in TM, die ein Milligramm pro Milliliter Papain, 0,04% BSA und 0,4 Millimolar DTT enthalten. Dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ IA in DM hinzu und inkubieren Sie erneut bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.Das Gewebe in frisches TM überführen und durch sanftes Reiben mit einer Pasteur-Glaspipette dispergieren. Verreiben Sie weiter, bis isolierte glatte Gefäßmuskelzellen in der Badelösung unter dem Mikroskop sichtbar werden. Isolieren Sie die intrapulmonale Arterie, wie zuvor gezeigt, und schneiden Sie den Hauptast der intrapulmonalen Arterie in Ringe von etwa zwei Millimetern Länge.Befestigen Sie die intrapulmonalen Arterienringe in Organbadkammern, indem Sie sie auf zwei Edelstahldrähte mit einem Durchmesser von 40 Mikrometern auffädeln. Befestigen Sie Edelstahldrähte, die mit intrapulmonalen Arterienringen befestigt sind, an den isometrischen Kraftaufnehmern, die mit dem Datenerfassungsgerät verbunden sind, und an dem Computersystem, das mit der geeigneten physiologischen Software zur Datenerfassung und -analyse installiert ist. Dann erhöhen Sie sanft die Spannung des intrapulmonalen Arterienrings auf ein Gramm.Lassen Sie die Gefäßsegmente bei einer Ruhespannung von einem Gramm etwa 45 Minuten im Gleichgewicht liegen. Stellen Sie während der Äquilibrierungsphase sicher, dass die Krebslösung regelmäßig alle 15 Minuten gewechselt wird. Testen Sie nach dem Gleichgewicht die Lebensfähigkeit der Gefäße, indem Sie ihre Vasokonstriktion zu einer hohen extrazellulären Kaliumlösung messen.Beurteilen Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Endothel, indem Sie die Relaxationsreaktion auf Acetylcholin in Ringen berechnen, die mit PE vorkontrahiert sind. Entfernen Sie das Endothel mechanisch, indem Sie das Innere des Gefäßes vorsichtig mit einem kleinen Draht reiben, um eine Denudation zu induzieren. Dann gleichen Sie die arteriellen Ringe für 30 Minuten vor Beginn der Testexperimente aus. Untersuchen Sie die entspannende Wirkung des Pflanzenextrakts, indem Sie intrapulmonale Arterienringe mit PE vorkontrahieren. Dann fügen Sie vorsichtig 0,1 bis 1000 Mikrogramm pro Milliliter des Pflanzenextrakts kumulativ zu endothelintakten Ringen und endothelentblößten Ringen hinzu, um Vasorelaxation zu induzieren und eine konzentrationsabhängige Reaktionskurve zu erhalten.Stellen Sie sicher, dass das wirksame DMSO, das als Lösungsmittel verwendet wird, ebenfalls ähnlich bewertet wird, um als Negativkontrolle zu dienen. Bewerten Sie den vasorelaxierenden Wirkmechanismus des Pflanzenextrakts, wie im Textmanuskript erwähnt. Dann, nachdem sich die Kontraktionen zu PE stabilisieren, fügen Sie kumulative Konzentrationen des Pflanzenextrakts hinzu.Präsentieren Sie die Wirkungen von Pflanzenextrakt als prozentuale Entspannung der intrapulmonalen Arterienringe in Gegenwart von Inhibitoren im Vergleich zur Reaktion der intrapulmonalen Arterienringe ohne Inhibitoren und konstruieren Sie die Konzentrationsreaktionskurve. In einer intakten intrapulmonalen Arterie des Endothels löste der Pflanzenextrakt eine konzentrationsabhängige Reaktion der Vasorelaxation aus. Die Eradikation des Endothels reduzierte die durch den Pflanzenextrakt induzierte Vasorelaxation erheblich, was sich in der Erhöhung des EC50 um das 2,2-fache widerspiegelt, die Hemmung von eNOS und EDHF verringerte offensichtlich die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt.Dadurch verschob sich die Konzentrationsreaktionskurve nach rechts und erhöhte den EC50, ohne die Emax-Werte zu verändern. Im Gegenteil, Indomethacin zeigte keine Wirkung auf die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt. In den endothelentblößten intrapulmonalen Arterienringen verringerten Kalzium-aktivierte Kaliumkanalblocker die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt.Während Blocker von spannungsabhängigen oder ATP-empfindlichen Kaliumkanälen keine Abweichung zeigten. Die Vorinkubation mit dem Pflanzenextrakt hemmte die Calciumchlorid-induzierte Kontraktion. Die endothelentblößten intrapulmonalen Arterienringe, die mit kalziumfreier Krebslösung und PE vorinkubiert wurden, führten zu einer vorübergehenden Kontraktion.Im Vergleich zum Vehikel reduzierten die Pflanzenextrakte die durch PE induzierte Kontraktion signifikant. Während des Eingriffs muss man Vene, Bronchien und Arterie frühzeitig eindeutig identifizieren. Das Schneiden oder Beschädigen der Arterie reduziert ihre Länge und beeinflusst die vaskulären Reaktionen. Diese Technik kann angepasst werden, um Verbindungen zu untersuchen, die als Prototypen für die Behandlung von pulmonalen vaskulären Erkrankungen wie pulmonaler arterieller Hypertonie dienen könnten.

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Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

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