Name: Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung mitochondrialer Funktion im Ischiasnerv. Diese Methode ermöglicht die simultane Messung von Sauerstoffverbrauch und ROS-Produktion in situ für neurobiologische Forschung.

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Diese Studie wurde finanziert vom Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Wir danken Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli und Dr. Claudio Masuda für die Unterstützung mit Laboreinrichtungen und Dr. Martha Sorenson für die freundlichen und wertvollen Kommentare zur Verbesserung des Artikels.

Das vorliegende Protokoll wird von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) und den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt. Der Ischiasnerv wird aus vier Monate alten männlichen C57BL / 6-Mäusen isoliert, die gemäß den institutionellen Richtlinien durch Zervixdislokation eingeschläfert werden. Die Protokollschritte sind optimiert, um eine Verschlechterung der Mitochondrien zu vermeiden. Daher wurde in diesem Protokoll die Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren vor der Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervengewebes der Maus durchgeführt.
1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Bereiten Sie den Gewebekonservierungspuffer (TP-Puffer) vor.<ol>
<li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien in Reinstwasserlösung vor: 10 mM Ca-EGTA-Puffer mit 0,1 μM freiem Kalzium, 20 mM Imidazol, 20 mM Taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM Phosphokreatin (siehe Materialtabelle), pH 7,1. Bei -20°C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie den Mitochondrien-Atmungspuffer (MR-Puffer) vor.<ol>
<li>Bereiten Sie die folgenden Reagenzien in Reinstwasserlösung vor: 0,5 mMK2EGTA, 3 mM MgCl 2, 60 mM MES, 20 mM Taurin, 10 mM KH2 PO 4, 20 mM HEPES, 110 mM D-Saccharose, 1 mg/ml BSA (fettsäurefrei) (siehe Materialtabelle), pH7,4. Bei -20 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Sapolin-Stammlösung vor, indem Sie 5 mg Saponin (siehe Materialtabelle) in 1 ml TP-Puffer (Schritt 1.1) auflösen und auf Eis halten. Saponin wird frisch zubereitet.</li>
	<li>Bereiten Sie Amplex Red vor, indem Sie das Pulver (siehe Materialtabelle) mit DMSO resuspendieren, um eine Lagerkonzentration von 2 mM zu erhalten, und lagern Sie es bei -20 °C in einer vor Licht geschützten Durchstechflasche. HINWEIS: Um zu vermeiden, dass die Sonde durch Einfrieren und Auftauen abgenutzt wird, machen Sie kleine Aliquots für die Lagerung nicht länger als 6 Monate25.</li>
</ol>2. Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren für die hochauflösende Respirometrie (HRR)
<ol><li>Reinigen Sie die HRR-Kammern des Instruments und der Spritzen (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>HRR-Kammern öffnen, mit destilliertem Wasser bis zur Oberseite füllen und 5 min 3x umrühren. Wiederholen Sie mit Ethanol und dann noch einmal mit Wasser. Waschstopfen und Spritzen mit Wasser/Ethanol/Wasser je 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenden Sie die folgenden Kalibrierungseinstellungen in der HRR-Software an (siehe Materialverzeichnis).<ol>
<li>Addieren Sie in der HRR-Softwaresteuerung die experimentelle Temperatur (37 °C), die Parameter für den Sauerstoffsensor (Verstärkung, 2; Polarisationsspannung, 800 mV) und für den amperometrischen Sensor (Verstärkung, 1000; Polarisationsspannung, 100 mV).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrieren Sie die Sauerstoffsensoren.<ol>
<li>Pipette 2,1 ml MR-Puffer (Schritt 1.2) in jede Kammer. Schließen Sie mit den Stoppern und saugen Sie Luft in die Kammer, bis sich eine Blase bildet. Im Kalibriermodus 1 h bei 37 °C umrühren, bis der Sauerstofffluss pro Masse stabil ist.</li>
		<li>Führen Sie eine Luftkalibrierung der polarographischen Sauerstoffsensoren in der Software gemäß dem Protokoll24 des Herstellers durch. HINWEIS: Der Kalibrierungsschritt wird vor einem Experiment nur einmal durchgeführt. Zusätzliche Experimente in gleichem Atmungsmedium und gleicher Temperatur können nach dem bloßen Waschen von Kammern durchgeführt werden (Schritt 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervs
<ol><li>Entfernen Sie den Ischiasnerv mit den folgenden Schritten.<ol>
<li>Euthanasieren Sie das Tier durch Zervixdislokation, nachdem Sie es aus seinem Käfig entfernt und sanft auf der Bank ruhen lassen.</li>
		<li>Machen Sie bei dem eingeschläferten Tier einen Schnitt mit einer Schere im unteren Rückenbereich, beginnend in der Nähe der Wirbelsäule und den Oberschenkel hinunter zum Fuß. Entfernen Sie Haut und Muskeln, die am Nerv befestigt sind, und schneiden und entfernen Sie dann den gesamten Ischiasnerv.</li>
		<li>Wiegen Sie das Gewebe sofort und legen Sie es in eine Durchstechflasche, die mit kaltem TB-Puffer (4 °C) gefüllt ist. Führen Sie die Schritte 3.2-3.3 auf dem Eis aus. HINWEIS: Das Nassgewebegewicht wird verwendet, um den Sauerstoffverbrauch und den ROS-Produktionsfluss in den folgenden Schritten zu normalisieren. Wenn das Gewebe nicht sofort gewogen werden kann, bewahren Sie es in einem kalten TB-Puffer auf. Das Verfahren wird in frischem Gewebe durchgeführt und darf nicht eingefroren werden, um mitochondriale Schäden zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die Gewebepräparation legen Sie den Ischiasnerv in eine Petrischale mit genügend TP-Puffer, um ihn zu bedecken. Halten Sie ein Ende des Nervs mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer anderen Pinzette die Nervenbündel horizontal heraus. HINWEIS: Dieses Verfahren muss in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, um eine Verschlechterung des Gewebes zu vermeiden. Das Gewebe ist bereit, wenn es als transparente neblige Schichten gegenüber dem vorherigen weißen undurchsichtigen Gewebe sichtbar gemacht werden kann (Abbildung 1).</li>
	<li>Übertragen Sie zuerst das gespreizte Gewebe in eine kleine Schale, die 1 ml TP-Puffer für die Gewebepermeabilisierung enthält. Um mit der Permeabilisierung zu beginnen, wird das Gewebe mit einer Pinzette in eine Schale überführt, die 1 ml TP-Puffer und 10 μL Saponin enthält (aus Stammlösung, Schritt 1.3).<ol>
<li>In einem Mikroplatten-Shaker vorsichtig für 30 min schütteln, dann das Gewebe mit einer Pinzette in eine frische Schale mit MR-Puffer (1 ml) geben und vorsichtig für 10 min schütteln. Überführen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kalibrierte HRR-Kammer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion
<ol><li>Füllen Sie die HRR-Kammern mit 2,1 ml MR-Puffer, fügen Sie Amplex Red (Schritt 1.4) zu einer Endkonzentration von 5 μM und Peroxidase zu 2 E/ml hinzu und fügen Sie den permeabilisierten Ischiasnerv hinzu (Schritt 3).<ol>
<li>Schließen Sie die Fluoreszenzsensoren des Instruments an, schalten Sie die Lichter im Steuerungsbereich der Software aus und drücken Sie Mit Oxygraph verbinden. Geben Sie unter "Protokolle bearbeiten" in der Software das in Schritt 3.1.3 gemessene Gewebegewicht ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Gehen Sie zu "Layout", wählen Sie die Option "Spezifischer Fluss pro Probeneinheit" und wählen Sie Plots aus, um gleichzeitig auf die Sauerstoffverbrauchsanzeige und, falls gewünscht, auf dieH2O2-Produktionzuzugreifen. Warten Sie ~ 10 min. HINWEIS: Diese Zeit ist erforderlich, um den basalen Fluss des Sauerstoffverbrauchs ohne zusätzliches Substrat (basal) zu stabilisieren. Stellen Sie vor weiteren Injektionen sicher, dass der Sauerstofffluss stabilisiert wird.</li>
	<li>Injizieren Sie zwei H2O2-Impulse mit jeweils einer Endkonzentration von 260 μM, um sie später in der Kammer zu kalibrieren.</li>
	<li>Injizieren Sie 20 μL Succinat (siehe Materialtabelle), ein substrat des mitochondrialen Komplexes II, um das mitochondriale Elektronentransportsystem zu aktivieren. HINWEIS: Verschiedene mitochondriale Substrate können an dieser Stelle hinzugefügt werden, um die mitochondriale Funktion durch verschiedene Komplexe zu bewerten. Repräsentative Ergebnisse mit unterschiedlichen Substraten für die mitochondrialen Komplexe I und II sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. An dieser Stelle ist in Abbildung 3 ein gleichzeitiger Anstieg des O2-Verbrauchs und der H2O2-Produktion zu beobachten.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL Adenosindiphosphat (ADP) hinzu, um die Adenosintriphosphat (ATP) -Synthese zu aktivieren. HINWEIS: ADP stimuliert die ATP-Synthese und reduziert das Membranpotential. Es wird erwartet, dass ein Anstieg desO2-Verbrauchs und ein Rückgang der Produktion vonH2O2beobachtet werden26,27.</li>
	<li>Fügen Sie nacheinander 5 μL Cytochrom c (siehe Materialtabelle) als Indikator für die Membranintegrität hinzu. HINWEIS: Wenn das Gewebe gut vorbereitet und permeabilisiert ist, sollte Cytochrom c den Sauerstoffverbrauch nicht um mehr als 15% erhöhen. Wenn dies der Fall ist, suchen Sie im Abschnitt zur Fehlerbehebung nach Empfehlungen.</li>
	<li>Titrieren Sie mit Aliquots von 0,2 μg/ml Oligomycin (siehe Materialtabelle), bis kein weiterer Rückgang desO2-Verbrauchs beobachtet wird. HINWEIS: Oligomycin wirkt, indem es die ATP-Synthese hemmt, was zu einer Abnahme des O2-Flusses und einer Verbesserung derH2O2-Bildungführt, die durch das hohe Membranpotential 26,27 begünstigt wird. </li>
	<li>Titrieren Sie mit Aliquots von 0,5 μmol/L Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) (siehe Materialtabelle), dem mitochondrialen Entkoppler, bis kein weiterer Anstieg desO2-Verbrauchs mehr beobachtet werden kann. Um das Experiment zu beenden, injizieren Sie 2 μl Antimycin A auf eine Endkonzentration von 5 μM und warten Sie auf die Stabilisierung des Flusses. HINWEIS: Eine Abnahme derH2O2-Produktionwird aufgrund der Membranpotentialdissipation nach der Injektion von FCCP beobachtet. Antimycin A hemmt den Komplex III und verhindert so den Elektronenfluss. Daher ist der mitochondrienabhängige O2-Verbrauch beeinträchtigt, was den Sauerstofffluss pro Masse verringert und den Elektronenverlust stimuliert, wodurch dieH2O2-Produktionum 26,27 erhöht wird.</li>
	<li>Gehen Sie in die Befehlsleiste, suchen Sie in der Software nach "multisensorisch", klicken Sie auf Control > Save file und Disconnect. HINWEIS: Die Zugabe anderer Substrate und Inhibitoren kann entsprechend der untersuchten Frage durchgeführt werden. Ein Beispiel ist in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. DieH2O2-Kalibrierungwird nach Beendigung des Experiments gemäß dem Protokoll28 des Herstellers durchgeführt.</li>
	<li>Öffnen Sie die gespeicherte Datei und wählen Sie die Spur "Sauerstofffluss pro Masse", um die experimentellen Sauerstoffverbrauchsergebnisse zu erhalten. Wählen Sie das Fenster zwischen den Injektionen manuell aus, indem Sie Umschalttaste + Linke Maustaste drücken.<ol>
<li>Gehen Sie zu Marks > Statistics, um die Ergebnisse für jede Injektion von Substrat / Inhibitoren / entkoppeltem Protokoll zu visualisieren. Führen Sie fürdie H 2O 2-Produktion den gleichen Vorgang mit der Spur "Amp-Slope" durch. HINWEIS: Vermeiden Sie bei der Auswahl des Fensters Artefakte von Volumeninjektionen, indem Sie ein Fenster wählen, in dem Sauerstoff (oderH2O2)stabiler und konstanter ist. Beispiele für ausgewählte Fenster werden in den repräsentativen Ergebnissen durch schwarze geschweifte Klammern dargestellt (Abbildung 2 und Abbildung 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mehrere Krankheiten oder Zustände, die Neuropathien begleiten, haben eine mitochondriale Dysfunktion als Risikofaktor. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven ist unerlässlich, um aufzuklären, wie sich die Mitochondrien bei diesen neurodegenerativen Zuständen verhalten. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist aufgrund der Schwierigkeit der Isolationsmethode und der Materialknappheit mühsam. Daher ist die Entwicklung von Gewebepermeabilisierungstechniken, die keine Isolierung der Mitocho...

Mitochondrien sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und erfüllen zahlreiche Zellfunktionen wie den Energiestoffwechsel (Glukose-, Aminosäure-, Lipid- und Nukleotidstoffwechselwege). Als primärer Ort der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind Mitochondrien in mehreren Zellsignalprozessen wie Apoptose von zentraler Bedeutung und beteiligen sich an der Synthese von Eisen-Schwefel (Fe-S) -Clustern, dem Import und der Reifung von mitochondrialen Proteinen sowie der Aufrechterhaltung ihres Genoms und ihrer Ribosomen 1,2,3. Das mitochondriale Membrandynamiknetzwerk wird durch Fusions- und Spaltungsprozesse gesteuert, und sie verfügen auch über Maschinen zur Qualitätskontrolle und Mitophagie 4,5,6.
Mitochondriale Dysfunktion ist mit dem Auftreten mehrerer pathologischer Zustände wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit verbunden7. Störungen der mitochondrialen Funktion werden bei neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie bei der Alzheimer-Krankheit 8,9, der Parkinson-Krankheit 10,11, der amyotrophen Lateralsklerose 12,13 und der Huntington-Krankheit 14,15 . Im peripheren Nervensystem wird ein Verlust der mitochondrialen Funktion in Axonen bei Immunneuropathien wie dem Guillain-Barré-Syndrom 16,17 beobachtet, und in Verbindung mit einer hohen mitochondrialen ROS-Produktion in Axonen führen diese Ereignisse zu einer MAP-Kinase-Aktivierung in Schwann-Zellen18. Dies zeigt, dass die mitochondriale Physiologie nicht nur für eine ortsspezifische Zelle, sondern für ein ganzes Gewebe unerlässlich sein kann. Bei der HIV-assoziierten distalen sensorischen Polyneuropathie (HIV-DSP) spielen Mitochondrien eine Rolle in dem Mechanismus, durch den das HIV-TAT-Protein (Transaktivator of Transkription) es HIV ermöglicht, sich effizient zu replizieren, sowie mehrere andere Rollen bei der HIV-Infektionspathogenese19, 20.
Die Beurteilung der mitochondrialen Physiologie des Ischiasnervs hat sich als wesentliches Ziel für die Untersuchung der Neuropathieherausgestellt 7,21,22. Bei der diabetischen Neuropathie deuten proteomische und metabolomische Analysen darauf hin, dass die meisten molekularen Veränderungen bei Diabetes die mitochondriale oxidative Phosphorylierung des Ischiasnervs und den Fettstoffwechselbeeinflussen 7. Diese Veränderungen scheinen auch frühe Anzeichen für einen durch Fettleibigkeit verursachten Diabeteszu sein 21. In einem Mausmodell der chemotherapieinduzierten schmerzhaften Neuropathie wird eine mitochondriale Beeinträchtigung des Ischiasnervs als Abnahme der oxidativen Phosphorylierung22 und eine Verringerung der Aktivitäten der mitochondrialen Komplexe, des Membranpotentials und des ATP-Gehalts23 nachgewiesen. Obwohl mehrere Gruppen mitochondriale Dysfunktion bei Neuropathien zitiert haben, beschränken sich diese Studien auf die Messungen der Aktivität in mitochondrialen Komplexen ohne Erhaltung der mitochondrialen Membranen, fehlende Bewertung der mitochondrialen Integrität oder Messungen des ATP-Gehalts als Parameter für die mitochondriale ATP-Produktion. Im Allgemeinen erfordert eine ordnungsgemäße Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion die Isolierung von Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation in einem Percoll/Saccharose-Gradienten. Die Isolierung von Mitochondrien kann aufgrund der großen Menge an benötigtem Gewebe und des Verlusts und der Störung der Mitochondrien auch ein limitierender Faktor für Ischiasnervengewebe sein.
Die vorliegende Studie zielt darauf ab, ein Protokoll zur Messung der mitochondrialen Physiologie wie des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion im Ischiasnerv bereitzustellen, wobei die mitochondrialen Membranen erhalten bleiben und keine Mitochondrien isoliert werden müssen. Dieses Protokoll wird aus Sauerstoffverbrauchsmessungen in permeabilisierten Muskelfasern24 durch hochauflösende Respirometrie (HRR) angepasst. Die Vorteile dieses Verfahrens sind die Möglichkeit, Mitochondrien in kleinen Gewebemengen wie dem Ischiasnerv zu bewerten und mitochondriale Parameter in situ zu bewerten, wodurch die mitochondriale Umgebung, Struktur und das bioenergetische Profil erhalten bleiben, um ein physiologisch vertrauenswürdiges Ergebnis zu erhalten. Die mitochondrialen Atmungszustände wurden mit Substraten und Inhibitoren nach der Permeabilisierung des Ischiasnervs bestimmt, um die mitochondriale Bioenergetik und den Cytochrom-c-Koeffizienten für die Integrität der mitochondrialen Membran richtig zu beurteilen und einen Leitfaden für Schritte der Bewertung des mitochondrialen Elektronentransportsystems (ETS) und der Berechnung wesentlicher Parameter zu geben. Diese Studie kann Werkzeuge zur Beantwortung von Fragen in pathophysiologischen Mechanismen liefern, an denen der Ischiasnervenstoffwechsel beteiligt ist, wie z.B. periphere Neuropathien.

<table><tbody><tr><td>Adenosin 5'-Triphosphat-Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5&prime;-diphosphat-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Reagenz</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>A12222</td><td>Amplex Red wird in DMSO gemäß Produktdatenblatt</td></tr><tr><td>hergestellt Antimycin A (von Streptomyces sp.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Hitzeschockfraktion, proteasefrei, fettsäurefrei, im Wesentlichen globulinfrei, pH 7, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Calciumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6763</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td> <td>(aus Pferdeherz; kleines Hämprotein)</td></tr><tr><td>DataLab Version 5.1.1.91</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich</td><td></td><td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td></tr><tr><td>Digitaler orbitaler Mikroplattenschüttler 120V</td><td>Thermo Fisher wissenschaftlicher</td><td>88882005</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HAM80075</td><td>10 μl, 25 μl und 50 μl</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoff Peroxidlösung 30% W/W</td><td>Merck</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>MES Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierzange, gebogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierzange, gerade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>O2K - Filterset Amplex Rot</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td>44321-01</td><td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondrien. Mitochondr Physiol Netzwerk 17.17.</td></tr><tr><td>O2K - Fluoreszenz LED2 - Modulkomponente Fluoreszenz-Sensor Grün</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich</td><td>44210-01</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td> <td>(aus Streptomyces diastatochromogenes; Mischung aus Oligomycinen A, B und C</td></tr><tr><td>OROBOROS Oxygraph-2k</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich</td><td>http://www.oroboros.at</td><td></td></tr><tr><td>Palmitoylcarnitin (Palmitoyl-DL-Carnitin-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4509</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase aus Meerrettich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, Polystyrol</td><td>MERCK</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Phosphokreatin Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1330</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAE0073</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinat zweibasisches Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der mitochondrialen funktion im ischiasnerv durch hochauflösende respirometrie

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven begleitet mehrere Krankheiten, die mit peripherer Neuropathie verbunden sind, die durch mehrere Ursachen ausgelöst werden können, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen, Erbkrankheiten und Tumoren. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven der Maus kann aufgrund der geringen Probengröße, einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien im Gewebe und des Vorhandenseins einer Myelinscheide eine Herausforderung darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik minimiert diese Herausforderungen, indem sie ein einzigartiges Permeabilisierungsprotokoll verwendet, das an das für Muskelfasern verwendete Protokoll angepasst ist, um die mitochondriale Funktion des Ischiasnervs zu beurteilen, anstatt die Mitochondrien vom Gewebe zu isolieren. Durch die Messung der fluorimetrischen reaktiven Speziesproduktion mit Amplex Red/Peroxidase und den Vergleich verschiedener mitochondrialer Substrate und Inhibitoren in saponin-permeabilisierten Nerven war es möglich, mitochondriale Atmungszustände, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivität von mitochondrialen Komplexen gleichzeitig nachzuweisen. Daher bietet die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der Beurteilung der mitochondrialen Funktion durch andere Techniken.

Der mitochondriale Sauerstoffverbrauch durch den permeabilisierten Ischiasnerv ist in Abbildung 2 dargestellt. Die rote Spur stellt denO2-Fluss pro Masseneinheit in pmol/s.mg dar. Nach der Erfassung eines basalen Sauerstoffverbrauchs mit endogenen Substraten (Routineatmung) wird Succinat (SUCC) injiziert, um die durch Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) angetriebene Atmung aufzuzeichnen, was zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs führt. In der Folge wird eine sättigende Konzen...

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Funktion innerhalb des Nervs durch Parzellierung der isolierten Mitochondrien, ein anspruchsvolles Verfahren in einem kleinen Gewebe, das eine begrenzte Anzahl von Mitochondrien enthält. Die Technik bietet die Möglichkeit, Mitochondrienfunktionen wie Sauerstoffverbrauch und ROS-Produktion gleichzeitig in einem konservierten Mitochondrien in situ zu analysieren. Mit mehreren Substraten, Inhibitoren und Entkoppler-Designprotokollen.Mehrere Krankheiten teilen sich die mitochondriale Funktion, insbesondere Neuropathien, die durch Typ-Zwei-Diabetes oder Chemotherapie induziert werden. Bei diesen Erkrankungen sind Beeinträchtigungen der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung das einzige Zeichen, das die Krankheitsentwicklung bestimmt. Diese Methode bietet Einblicke in die Neurobiologie, Biochemie und Pharmakologie, mit der Untersuchung von mitochondrialen Krankheitsmechanismen, der Suche nach Therapien wie mitochondrialen Boostern oder verbesserten neuropathischen Schmerzen.Kalibrieren Sie zunächst die Sauerstoffsensoren, indem Sie 2,1 Milliliter MR-Puffer in jede Kammer pipettieren. Schließen Sie es mit den Stopfen und saugen Sie Luft in die Kammer, bis sich eine Blase bildet. Im Kalibriermodus eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius umrühren, bis sich der Sauerstofffluss pro Masse stabilisiert hat.Mit der HRR-Software führen Sie eine Luftkalibrierung der polarographischen Sauerstoffsensoren gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Zur Gewebepräparation legen Sie den Ischiasnerv in eine Petrischale mit genügend TP-Puffer, um ihn zu bedecken. Halten Sie ein Ende des Nervs mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer anderen Pinzette die Nervenbündel horizontal heraus.Zuerst das angezeigte Gewebe in eine kleine Schale mit einem Milliliter TP-Puffer für die Gewebepermeabilisierung geben. Um mit der Permeabilisierung zu beginnen, übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine andere Schale, die einen Milliliter TP-Puffer enthält und 50 Mikrogramm pro Milliliter Saponin enthält. Legen Sie die Platte in einen Mikroplattenschüttler und lassen Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig rühren.Anschließend das Gewebe mit einer Pinzette in eine frische Schale mit einem Milliliter MR-Puffer geben und 10 Minuten lang vorsichtig umrühren lassen. Überführen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kalibrierte HRR-Kammer. Füllen Sie die HRR-Kammern mit 2,1 Millilitern MR-Puffer.Fügen Sie Amplex Red und Peroxidase zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren bzw. zwei Einheiten pro Milliliter hinzu. Dann fügen Sie den durchlässigen Ischiasnerv hinzu. Befestigen Sie die Fluoreszenzsensoren des Instruments.Schalten Sie dann die Lichter im Steuerungsbereich der Software aus und klicken Sie in der Software auf "An Oxygraph anschließen"Gehen Sie zu Protokollen bearbeiten" und geben Sie das Gewebegewicht ein. Gehen Sie zum Layout und wählen Sie die Option "Spezifischer Fluss pro Sample". Wählen Sie dann Parzellen aus, um gleichzeitig auf die Sauerstoffverbrauchsanzeige und bei Bedarf auf die Wasserstoffperoxidproduktion zuzugreifen.Warten Sie ca. 10 Minuten. Injizieren Sie zwei Impulse Wasserstoffperoxid, jeder auf eine Endkonzentration von 260 Mikromolar zur Kalibrierung der Kammer. Injizieren Sie 20 Mikroliter Succinat, ein substrat des mitochondrialen Komplexes II, um das mitochondriale Elektronentransportsystem zu aktivieren.Fügen Sie 20 Mikroliter ADP hinzu, um die ATP-Synthese zu aktivieren. Fügen Sie in der Folge fünf Mikroliter Cytochrom c als Indikator für die Integrität der Membran hinzu. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin, bis keine weitere Abnahme des Sauerstoffverbrauchs mehr beobachtet wird.Titrieren Sie mit Aliquots von 0,5 Mikromol pro Liter FCCP, dem mitochondrialen Entkoppler, bis kein weiterer Anstieg des Sauerstoffverbrauchs beobachtet wird. Um das Experiment zu beenden, injizieren Sie zwei Mikroliter Antimycin A, machen Sie eine endgültige Konzentration von fünf Millimolar und warten Sie, bis sich der Fluss stabilisiert hat. Wechseln Sie zur Befehlsleiste.Suchen Sie nach "multisensory" in der Software. Klicken Sie auf "Steuerung", drücken Sie "Datei speichern" und trennen Sie die Verbindung. Öffnen Sie die gespeicherte Datei und wählen Sie den Sauerstofffluss pro Massenschalen aus, um die experimentellen Sauerstoffverbrauchsergebnisse zu erhalten.Wählen Sie das Fenster zwischen den Injektionen manuell aus, indem Sie die Umschalttaste und die linke Maustaste drücken. Gehen Sie zu Markierungen und wählen Sie Statistiken aus, um die Ergebnisse für jede Injektion von Substraten, Inhibitoren und Entkopplungsprotokollen zu visualisieren. Für die Wasserstoffperoxidproduktion führen Sie das gleiche Verfahren mit der Ampere-Steigungsspur durch.Die Abnahme des Membranpotentials, die durch die ATP-Sythase-Aktivität gefördert wird, beschleunigte den Sauerstoffverbrauch. Die Zugabe von exogenem Cytochrom C förderte nur eine minimale Stimulation der Atmung und bescheinigte die Integrität der mitochondrialen äußeren Membran für dieses Präparat. Absolute Sauerstoffflüsse wurden aufgezeichnet und nur ein Anstieg der Atmung um 6,3% beobachtet, was auf eine gute Qualität der Gewebepräparation hinweist.Der Sauerstoffverbrauch und die ROS-Produktion wurden gleichzeitig in Gegenwart verschiedener Substrate gemessen, die Brennstoff für das Elektronentransportsystem lieferten. Die Zugabe von Pyruvat und Malat für den mitochondrialen Komplex I erhöhte die Atmung. Und die weitere Zugabe von Succinat für Komplex II erhöht auch den Sauerstoffverbrauch.Daher konnten andere Substrate getestet werden. Die ROS-Produktion stieg ebenfalls, was auf das Austreten von Sauerstoff aus dem Elektronentransportsystem hinweist. Die Zugabe von Adenosindiphosphat in der Sättigungskonzentration erhöhte den Sauerstoffverbrauch, was die ATP-Bildung vorantrieb, und verringerte die ROS-Produktion.Im Gegensatz dazu verringerte die Oligotitration den Sauerstoffverbrauch und erhöhte die ROS-Produktion. Dies deutete darauf hin, dass der permeablisierte Ischiasnerv die Standardrelation in der mitochondrialen Physiologie replizieren könnte. Die Zugabe von FCCP und Retinon, abgestimmt auf die erwarteten Sauerstoffflussänderungen, bestätigt, dass die mitochondriale Physiologie und das bioenergetische Profil im permeablisierten Ischiasnerv erhalten blieben.Der wichtigste Schritt besteht darin, den Gewebeabschnitt vorsichtig vorzubereiten und sicherzustellen, dass alle Kammeröffnungen ordnungsgemäß gereinigt werden. Veränderungen der Mitochondrienfunktion können auf Funktionsstörungen oder eine niedrigere mitochondriale Zahl zurückzuführen sein. daher werden die zitierte Synthaseaktivität und die Bestätigung des mitochondrialen DNA-Gehalts durch PCR empfohlen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Die Beurteilung der oxidativen Phosphorylierung mit hochauflösenden Respirometern ist zu einem integralen Bestandteil der Funktionsanalyse von Mitochondrien und zellulärem Energiestoffwechsel geworden. Hier stellen wir Protokolle für die Analyse des zellulären Energiestoffwechsels mit kammer- und mikroplattenbasierten hochauflösenden Respirometern vor und diskutieren die wichtigsten Vorteile jedes Geräts.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.

Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Die Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik unter physiologisch relevanten Substratkonzentrationen in Immunzellen sind begrenzt. Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das hochauflösende Fluorespirometrie verwendet, um Veränderungen in der Reaktion des mitochondrialen Membranpotentials auf den Energiebedarf in menschlichen T-Zellen, Monozyten und peripheren mononukleären Zellen zu bewerten.

Hochauflösende Fluorespirometrie zur Beurteilung dynamischer Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials in menschlichen Immunzellen

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

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Lernen Sie hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung mitochondrialer Funktion im Ischiasnerv. Diese Methode ermöglicht die simultane Messung von Sauerstoffverbrauch und ROS-Produktion in situ für neurobiologische Forschung.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

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