Untersuchung der lindernden Wirkung der Verabreichung von Bacillus cereus auf Colitis durch Modulation der Darmmikrobiota

Dieses Protokoll ermöglicht es, die bidirektionale regulierende Wirkung einer probiotischen Supplementierung auf die Gesundheit und stabile und reproduzierbare Ergebnisse zu bewerten. Ein alternatives DSS-induziertes Colitis-Modell wurde mit pseudokeimfreien Mäusen etabliert, um einige Laboreinschränkungen bei der Verwendung von keimfreien Mäusen als Rezeptoren für Probiotika zu vermeiden. Um die positiven Wirkungen von Probiotika in dieser Technik zu erforschen, ist dies ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung neuartiger Behandlungsstrategien zur Linderung der Symptome chronisch entzündlicher Erkrankungen.

Bereiten Sie zunächst einen Antibiotika-Cocktail vor, indem Sie Ampicillin, Neomycinsulfat, Metronidazol und Vancomycin in Trinkwasser auflösen. Nach vollständiger Auflösung lagern Sie die Lösungen bei vier Grad Celsius. Geben Sie die antibiotischen Cocktaillösungen in eine Wasserflasche.

Achten Sie darauf, braune Flaschen zu verwenden oder die Flaschen mit Alufolie einzuwickeln, um die Antibiotikalösungen vor Licht zu schützen. Stellen Sie die Flasche auf den Mäusekäfig. Um eine 2,5%ige Dextransulfat-Natriumlösung herzustellen, lösen Sie 2,5 Gramm DSS in 100 Millilitern destilliertem Wasser.

Ersetzen Sie das Trinkwasser durch die 2,5%ige DSS-Lösung in der Gruppe der Colitis-Modellmäuse. Um die positive Wirkung von B cereus auf die Linderung von Colitis zu bewerten, ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip den folgenden drei Gruppen zu: der Kontrollgruppe, dem DSS-induzierten Colitis-Modell und der probiotischen B-cereus-Supplementierung für DSS-induzierte Mäuse. Um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der probiotischen Wirkungen von B cereus auf DSS-induzierte Kolitis zu untersuchen, werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in die folgenden drei Gruppen eingeteilt: ABX/Kontrolle, ABX/DSS und ABX/B cereus plus DSS.

Notieren Sie das Körpergewicht der Mäuse als Ausgangsgewicht nach der Verabreichung des Antibiotika-Cocktails. Behandeln Sie das Männchen C 57 BL sofort sechs Mäuse sieben Tage lang mit 2,5%iger DSS-Lösung in Trinkwasser. Bereiten Sie acht 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor, die mit 900 Mikrolitern steriler normaler Kochsalzlösung gefüllt sind.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter logarithmisches Wachstum B cereus und lösen Sie es in 900 Mikrolitern steriler normaler Kochsalzlösung auf. B cereus mit Röhrchen seriell verdünnen. 40 Mikroliter jeder Verdünnung auf die jeweilige LB-Agarplatte auffüllen, die mit dem Verdünnungsverhältnis beschriftet ist.

Wiederholen Sie dies dreimal für jedes Verdünnungsverhältnis. Kultivieren Sie die Platten 16 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit konstanter Temperatur. Wählen Sie die Platten mit ca. 20 bis 70 Völkern für die Zählung aus.

Nach der Quantifizierung von B cereus wird ein Milliliter B cereus-Medium, das einmal 10 bis zur neunten KBE enthält, entnommen und 10 Minuten lang bei 8.000 g zentrifugiert. Anschließend werden die Bakterienzellen zweimal mit sterilem Wasser durch Zentrifieren bei 8.000 g für 10 Minuten gewaschen und der Überstand entfernt. Das konzentrierte B cereus wird mit steriler normaler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von zweimal 10 bis acht KBE je 200 Mikroliter verdünnt.

Pipettieren Sie die Verdünnung wiederholt auf und ab, um eine dispergierte B cereus-Suspension zu erhalten. Wischen Sie die Außenseite der Sondennadel mit 70%igem Ethanol ab und halten Sie die richtige Dosierung aufrecht. Um die Mäuse festzuhalten, nehmen Sie sie am Schwanz und fassen Sie die lose Haut des Rückens fest, wobei das Ende des Schwanzes zwischen den letzten beiden Fingern des Hundeführers befestigt ist.

Halten Sie die Mäuse in einer vertikalen Position. Führen Sie dann die Sondennadel vorsichtig und sanft durch den Mund in die Speiseröhre ein. Verabreichen Sie die B cereus-Lösung, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein.

Messen Sie täglich das Körpergewicht der Mäuse und sammeln Sie die Kotproben sofort in einem sterilisierten Zentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie das okkulte Blut im Stuhl mit einem Testpapier für okkultes Blut im Stuhl. Sammeln Sie 10 Milligramm Stuhlprobe auf einem Applikatorstäbchen.

Legen Sie die Probe auf die Testkarte und tragen Sie einen dünnen Abstrich auf die Karte auf. Öffnen Sie die hintere Lasche und tragen Sie den Entwickler auf den Abstrich auf. Fixieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch und öffnen Sie die Bauchhöhle.

Trennen Sie den gesamten Dickdarm operativ ab und messen Sie die Länge mit einem Lineal. Waschen Sie dann den Dickdarm vorsichtig mit einer Fünf-Milliliter-Spritze, die mit vorgekühltem PBS gefüllt ist. Entwachse und hydratisiere die Dickdarmabschnitte.

Als nächstes färben Sie die Dickdarmabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin. Lassen Sie zwei unabhängige Experimentatoren die histologischen Werte der Probe unter einem Lichtmikroskop bewerten, die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zeigte, dass das Dickdarmgewebe der Colitis-Modellmäuse einen Kryptenverlust, eine Schädigung der Becherzellen, eine Infiltration der entzündlichen Zellen und den Verlust von Epithel aufwies. Die Behandlung mit B cereus verbesserte die DSS-induzierte histopathologische Schädigung.

Die histopathologischen Scores von Colitis-Mäusen waren signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Allerdings waren die histopathologischen Scores in der B-cereus-Gruppe signifikant niedriger als bei den Colitis-Mäusen. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt, wobei der Körpergewichtsverlust, die DAI-Werte und die histopathologischen Werte höher waren und die Dickdarmlänge in der ABX/DSS-Gruppe im Vergleich zu Mäusen in der ABX/Kontrollgruppe kürzer war.

Der Körpergewichtsverlust, die Dickdarmlänge, die DAI-Werte und die histopathologischen Werte unterschieden sich statistisch nicht zwischen den ABX/DSS- und ABX/B-cereus- und DSS-Gruppen. Die vorliegenden Ergebnisse deuten indirekt darauf hin, dass die Darmmikrobiota eine Schlüsselrolle bei den positiven Effekten von B cereus auf Colitis spielt. Einer der wichtigsten Schritte ist die Verwendung von Bacillus cereus nach der Sondensonde-Methode, um die Colitis-Modellierung bei Mäusen zu konstruieren.

Die Behandlung von Bacillus cereus eliminierte die DSS-induzierte Kolitis, was zu einer Grundlage für die Folgestudie von Probiotika zur Behandlung von Colitis führte.