Name: In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Lernen Sie die kombinierte in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion von mRNA und Protein in neuronalen Populationen.

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Diese Arbeit wurde von der Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), der Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) und der Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009) unterstützt.

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Nantong genehmigt (Nr. S20191210-402).
1. Entnahme von Zebrafisch-Embryonen
<ol><li>In der Nacht vor der Entnahme der Eier ein Zebrafischpaar in Zuchtbecken aufstellen, einen transgenen Zebrafisch und einen AB-Wildtyp-Zebrafisch (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB Wildtyp oder Tg (hb9:egfp) X AB Wildtyp) (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine diagonale Trennwand aus Kunststoff, um den Mann und die Frau zu trennen, um einen physischen Zugang auszuschließen. Setzen Sie am nächsten Tag den oberen Teil des Zuchtbeckens in einen sauberen unteren Teil ein, der mit frischem Wasser gefüllt ist, und entfernen Sie die Trennwand des Zuchtbeckens. Lassen Sie die Fische 10-20 Minuten lang paaren und sammeln Sie die Eier ein, nachdem sie auf den Boden des Zuchtbeckens gesunken sind.</li>
	<li>Die Embryonen werden in E3-Embryonenmedium (siehe Materialtabelle) kultiviert, das Methylenblau (1 ml 0,05 % Methylenblau in 1 l E3-Embryonenmedium) bei 28,5 °C enthält.</li>
	<li>Behandeln Sie die Embryonen 24 h nach der Befruchtung (hpf) mit Phenylthioharnstoff (PTU, siehe Materialtabelle), um die Bildung von Pigmenten zu verhindern. HINWEIS: Tiere beiderlei Geschlechts werden in Versuchen verwendet.</li>
</ol>2. In-situ-Hybridisierung
Anmerkungen: Das für die Schritte 2.1-2.11 verwendete Wasser ist mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Fixieren Sie ~10 Embryonen mit 0,5-1 ml frischem 4%igem Paraformaldehyd (PFA, siehe Materialtabelle) in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen bei 4 °C über Nacht für 12-14 h. ANMERKUNG: Das Protokoll für die In-situ-Hybridisierung wurde gegenüber der zuvor veröffentlichten Literaturleicht modifiziert 12. PFA muss innerhalb einer Woche nach der Anwendung frisch zubereitet und bei 4 °C oder einen Monat bei -20 °C gelagert werden. Alle folgenden Schritte der In-situ-Hybridisierung wurden mit 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen durchgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut nur von Embryonen zu entfernen, die älter als 48 hpf sind. HINWEIS: Die Haut wird entfernt, um das Eindringen von RNA-Sonden in die Rumpfregion von Embryonen zu erleichtern, die älter als 48 hpf sind.</li>
	<li>Die Embryonen werden nach und nach dehydriert, indem sie mit 25%, 50% und 75% Methanol in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 nacheinander (PBST, siehe Materialtabelle) für jeweils 5 min bei Raumtemperatur gewaschen werden. Waschen Sie die Embryonen dann 5 Minuten lang in 100% Methanol bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Embryonen in 100%igem Methanol bei -20 °C für mindestens 12-14 h über Nacht. HINWEIS: Dehydrierte Embryonen können 6 Monate lang in 100% Methanol bei -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Rehydrieren Sie die Embryonen nach und nach, indem Sie sie nacheinander 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 75 %, 50 % und 25 % Methanol in PBST waschen. Waschen Sie den Embryo dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verdauen Sie die Embryonen mit 10 μg/ml Proteinase K (siehe Materialtabelle) in PBST bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen 5 Minuten lang mit PBST. Führen Sie diesen Waschschritt dreimal durch.</li>
	<li>Fixieren Sie die gewaschenen Embryonen in 4% PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. HINWEIS: Dieser Schritt stoppt die Verdauung, da PFA die Proteinase K inaktiviert. Stellen Sie sicher, dass die Probe vorsichtig gemischt wird, um alle Embryonen PFA auszusetzen. Die Röhrchen können auf die Seite gelegt werden, um die Embryonen gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. Diese PFA muss nicht frisch sein (sie kann bis zu 2 Wochen gekühlt werden).</li>
	<li>Waschen Sie den Embryo dreimal mit PBST und inkubieren Sie ihn bei jeder Wäsche 5 Minuten lang.</li>
	<li>Führen Sie eine Vorhybridisierung der Embryonen durch, indem Sie sie mit einer Prähybridisierungslösung (preHYB, siehe Materialtabelle) bei 65 °C für 5 min inkubieren. Ersetzen Sie preHYB durch eine Hybridisierungslösung (HYB, siehe Materialtabelle) und prähybridisieren Sie für mindestens 4 h in HYB. Anmerkungen: Bevor Sie mit der Vorhybridisierung fortfahren, heizen Sie die Lösungen auf 65 °C vor. Formamid (siehe Materialtabelle) wird verwendet, um die Form und Struktur des Gewebes zu erhalten. Formamid verhindert auch die Bindung von nicht-homologen Fragmenten bei niedrigen Temperaturen.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Sonde (Insm1a oder 5-HT2C) 5 Minuten lang in HYB bei 95 °C, bevor Sie sie zu den Embryonen hinzufügen. Verwenden Sie die Sonde bei 1 μg/ml HYB. Entfernen Sie so viel preHYB wie möglich, ohne dass die Embryonen mit der Luft in Berührung kommen, und geben Sie die vorgewärmte Sonde in HYB in das Röhrchen mit den Embryonen. HINWEIS: Eine markierte RNA-Sonde kann verwendet werden, um mit einer mRNA-Zielsequenz in den Embryonen zu hybridisieren. Daher kann die Sonde verwendet werden, um die Expression eines Gens von Interesse und die Position der mRNA zu bestimmen.</li>
	<li>Lassen Sie die Sonde über Nacht (12-14 h) bei 50-70 °C hybridisieren. Anmerkungen: Die Hybridisierungstemperatur ist für verschiedene Sonden unterschiedlich.</li>
	<li>Am nächsten Tag wird die Sondenlösung mit einer Pipette abgesaugt und in einem Röhrchen bei -20 °C aufbewahrt, damit sie viele Male wiederverwendet werden kann.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen wie folgt:<ol><li>Waschen Sie die Embryonen 15 Minuten lang mit 100% HYB bei 65 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Embryonen nacheinander mit 75%, 50% und 25% HYB in 2x Standard-Kochsalzcitrat mit 0,1% Tween-20 (SSCT, siehe Materialtabelle) für jeweils 15 min bei 65 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Embryonen für 15 min in 2x SSCT bei 65 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Embryonen 15 min lang in 0,2x SSCT bei 65 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in Maleinsäurepuffer mit 0,02 % Tween-20 (MABT, siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Blockieren Sie die hybridisierten und gewaschenen Embryonen für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 2%iger Blocklösung-1 (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Blockierlösung-1 durch Antidigoxigenin AP (Verdünnung 1:4.000, siehe Materialtabelle) in einer frischen 2%igen Blocklösung-1 und schütteln Sie sie über Nacht 12-14 h bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen viermal für 30 Minuten in MABT bei Raumtemperatur. Anmerkungen: Nehmen Sie den BM purple (siehe Materialtabelle) während des dritten Waschgangs aus dem Kühlschrank und schütteln Sie ihn gelegentlich während der folgenden Wäschen.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pipette, um so viel NTMT wie möglich aus den Embryonen zu entfernen. Ersetzen Sie die Embryonen durch das violette AP-Substrat von BM und färben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur im Dunkeln. Überwachen Sie die Farbwechsel alle 30 Minuten, um den Färbegrad zu kontrollieren. Anmerkungen: Die spezifische Färbezeit ist unterschiedlich und muss je nach Sonde angepasst werden. Die Inkubation der Embryonen bei 37 °C kann die Reaktion beschleunigen. Die Inkubation der Embryonen bei 4 °C kann die Reaktionszeit verlängern und kann über Nacht erfolgen.</li>
	<li>Sobald es sich im gewünschten Ausmaß entwickelt hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie es zweimal kurz mit NTMT spülen. Nach der In-situ-Hybridisierung werden die Embryonen 20 Minuten lang dreimal mit PBST gespült.</li>
</ol>3. Einbetten
<ol><li>Tauchen Sie die Embryonen in 5%ige Saccharose in 1x PBS (siehe Materialtabelle) über Nacht für 12-14 h bei 4 °C.</li>
	<li>Wechseln Sie die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 1x PBS auf 15%ige Saccharose und inkubieren Sie sie über Nacht für 12-16 h bei 4 °C.</li>
	<li>Wechseln Sie die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 1x PBS auf 30%ige Saccharose und inkubieren Sie sie 1-2 Tage bei 4 °C. HINWEIS: Inkubieren Sie in dieser Lösung, bis die Embryonen auf den Boden des Röhrchens sinken.</li>
	<li>Füllen Sie einen Kryomold mit einem Medium für die optimale Schneidtemperatur (OCT) (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die Embryonen in 30%iger Saccharose mit OCT-Medium in das Kryomold. Rühren Sie sie um, um die Saccharose aus den Embryonen zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen in ein neues Kryomold für Gewebe und füllen Sie es vorsichtig mit OCT-Medium, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.</li>
	<li>Tauchen Sie jeden Embryo ein, schieben Sie ihn auf den Boden der Kryoform und platzieren Sie jeden Embryo in der gewünschten Ausrichtung (entweder dorsal-ventral oder lateral). Halten Sie die Embryonen in einer geraden Linie. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, nur einen Embryo in jeden Kryomold zu setzen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie die eingebetteten Embryonen in Kryoformen in ein Trockeneis-Ethanolbad.</li>
	<li>Bei -80 °C mindestens über Nacht 12-14 h lagern. HINWEIS: Die Kryoformen können mindestens einen Monat lang bei -80 °C aufbewahrt werden.</li>
</ol>4. Kryosektion
<ol><li>Stellen Sie die Kryoschnitte mit einem Kryostaten auf -20 °C ein.</li>
	<li>Entfernen Sie den Probenblock aus dem Kryomast und legen Sie ihn in den Kryostaten. Legen Sie das OCT-Medium auf den Boden des gekühlten Futters und legen Sie den Block darauf.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Probenblock parallel zur Rasierklinge steht. Schneiden Sie überschüssiges OCT-Medium vorsichtig um die Probe herum ab.</li>
	<li>Mit einem Kryostaten in 12-20 μm dicke Abschnitte schneiden. Übertragen Sie die Abschnitte schnell auf Glasobjektträger, so dass jeder Objektträger 3-4 Abschnitte hat. Lassen Sie die Proben Raumtemperatur erreichen und lagern Sie die Abschnitte in einem verschlossenen Objektträgerkasten bei -80 °C für die spätere Verwendung.</li>
</ol>5. Immunfärbung
HINWEIS: Die GFP-Färbung wird an den Schnitten durchgeführt.
<ol><li>Waschen Sie die Objektträger, die die Abschnitte enthalten, 5 Minuten lang mit PBS.</li>
	<li>Citratpuffer in der Mikrowelle zum Kochen bringen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in den Puffer und erhitzen Sie sie weiter, um die Lösung etwa 20 Minuten lang nahe dem Sieden zu halten. HINWEIS: Dieser Schritt hilft bei der Antigengewinnung. Das Gewebe bleibt auch bei hohen Temperaturen intakt, was die Färbequalität verbessert, indem es Faltungen, Beschädigungen oder Ablösungen des Gewebes verhindert.</li>
	<li>Lassen Sie die Proben langsam auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt beginnen. Lassen Sie die überschüssige Lösung abtropfen, trocknen Sie den Bereich um jeden Abschnitt vorsichtig mit einem Stück Taschentuch ab und zeichnen Sie mit einem wasserabweisenden Stift (siehe Materialtabelle) einen Kreis um den Abschnitt, um eine hydrophobe Barriere zu bilden. Achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht auszutrocknen.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.</li>
	<li>2 h in Blocklösung-2 (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur blockieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung (monoklonales α-GFP der Maus, 1:250, siehe Materialtabelle) pro Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger in einer immunhistochemischen Nassbox bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.</li>
	<li>Überschüssiges PBS ablassen. Inkubieren Sie die Objektträger mit dem entsprechenden Sekundärantikörper (1:400, siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur in PBS.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.</li>
	<li>Lassen Sie das überschüssige PBS ab, pipettieren Sie das Eindeckmedium auf den Objektträger und montieren Sie es mit einem Objektträger-Deckglas.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
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<li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
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<li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575(2020).</li>
<li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos+and+larvae+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Garbage+in%2C+garbage+out%3A+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll schlägt eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie vor, ein wichtiger Schritt in den Kolokalisationsexperimenten an Zebrafischembryonen. Diese Methode dient als einfache und effiziente Möglichkeit, gleichzeitig eine mRNA und ein Protein zu analysieren. In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung wurden an Zebrafischembryonen durchgeführt. Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Protokollen14,15,16<...

Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Entwicklungs- und Genetikstudien 1,2. Zebrafisch und Mensch haben eine hohe genetische Homologie (70 % der Gene werden mit dem menschlichen Genom geteilt), was die Verwendung als Modell für menschliche Krankheiten ermöglicht3. Im Zebrafisch ist es durchaus üblich, die Expressionsmuster zweier Gene und ihre räumliche Beziehung zu erkennen. Die Immunhistochemie wurde erstmals 1941 zum Nachweis von Krankheitserregern in infizierten Geweben durch Anwendung von FITC-markierten Antikörpern eingesetzt4. Das Zielprotein im Gewebeschnitt wird zunächst mit einem Primärantikörper markiert und der Schnitt wird dann mit einem Sekundärantikörper gegen die Wirtsspezies Immunglobulin des Primärantikörpers markiert. Die Antikörperfärbung ist ein robuster Ansatz zum Nachweis der Lokalisation von Proteinen, der eine hohe optische Auflösung auf intrazellulärer Ebene bietet. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Antikörper im Zebrafisch sehr begrenzt. Eine aktuelle Studie zeigt, dass etwa 112.000 Antikörper für Mäuse kommerziell verfügbar sind. Allerdings haben sich nur sehr wenige Antikörper im Zebrafisch als zuverlässig erwiesen5.
Stattdessen wurde im Zebrafisch die In-situ-Hybridisierung häufig für die Analyse von Genexpressionsmustern eingesetzt. Diese Methode wurde erstmals in den 1980er Jahren zur Bestimmung der Genexpression in Drosophila-Embryonen verwendet6,7, und seitdem wurde diese Technologie kontinuierlich weiterentwickelt und verbessert. Zunächst wurden radioaktiv markierte DNA-Sonden verwendet, um mRNA-Transkripte nachzuweisen; Die räumliche Auflösung war jedoch relativ gering, und es gab potenzielle Gesundheitsrisiken, die durch die Radioaktivität verursacht wurden. Anschließend stützt sich die In-situ-Hybridisierung auf die mit Digoxigenin (DIG) oder Fluorescein (Fluo) markierten RNA-Sonden, die mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert oder durch fluoreszierende Tyramid-Signalamplifikation (TSA) detektiert werden8,9. Obwohl TSA zum Nachweis von zwei oder drei Genen verwendet wurde, sind die DIG-Markierung von RNA-Sonden und antiDIG AP-konjugierten Antikörpern immer noch hochempfindliche, stabile und weit verbreitete Ansätze für die In-situ-Hybridisierung. Daher sind kommerzialisierte Antikörper in Kombination mit DIG-markierten in situ Sonden nützlich, um Einblicke in die Proteinlokalisierung und -expression eines Gens zu erhalten.
Whole-Mount-Embryonen können aufgrund der geringen optischen Auflösung die räumliche Beziehung zwischen den Genen nicht aufdecken, obwohl Zebrafischembryonen klein und durchsichtig sind10. Daher ist es notwendig, die Expressionsmuster von Genen auf intrazellulärer Ebene zu analysieren. Die Kryosektion ist bei Zebrafischen weit verbreitet, da sie einfach durchzuführen ist und das Antigen effektiv erhalten kann. Daher bietet die In-situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunhistochemie in Zebrafisch-Kryoschnitten eine leistungsfähige Möglichkeit, die Expressionsmuster zweier Gene zu analysieren. Eine Kombination aus in situ Hybridisierung und Immunhistochemie wurde auf Zebrafischeangewendet 11. Die Proteinase-K-Behandlung wurde jedoch verwendet, um die Sondenpenetration auf Kosten der Antigenintegrität zu verbessern. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwendet dieses Protokoll Erhitzung, um den Antigenabruf zu induzieren. Dieses Protokoll gilt nicht nur für Embryonen verschiedener Stadien und Gewebeabschnitte unterschiedlicher Dicke (14 μm Kopfabschnitte und 20 μm Rückenmarksabschnitte), sondern wurde auch anhand von Genen verifiziert, die in zwei Organen, einschließlich des Kopfes und des Rückenmarks, exprimiert werden.
In diesem Artikel wird beschrieben, wie In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung in Zebrafischembryonen in Kryoschnitten kombiniert werden können. Die Vielseitigkeit dieses Protokolls wird durch die Verwendung einer Reihe von in situ Hybridisierungs- und Immunhistochemie-Kombinationen demonstriert, einschließlich in situ Hybridisierungssonden für zwei verschiedene Neuronen. Diese Methode eignet sich zum Nachweis von mRNA und Proteinen in verschiedenen Regionen und Embryonen unterschiedlichen Alters sowie der Expressionsmuster zweier Gene.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin AP Fab-Fragmente</td><td></td> Roche <td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB3580</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungslösung-1</td><td>hergestellt im</td><td>Labor N/A</td><td>Das Blockierungsreagenz in 1X MAB auf eine Endkonzentration von 10 % (wt/vol) auflösen. Autoklavieren und lagern bei -20 &#176; C vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Blockierungslösung-2</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% Ziegenserum in 1x PBS</td></tr><tr><td>BM lila</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Citratpuffer</td><td>Leagene</td><td>IH0305</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Kryoform für Gewebe, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>Kopf Biotechnologie</td><td>H4566</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Sangon Biotech</td><td>B501005</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera, Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>NI-SSR 931479</td><td></td></tr><tr><td>E3 Embryomedium</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>J& K Scientific</td><td>542858</td><td></td></tr><tr><td>HYB</td><td>made in lab</td><td>N/A</td><td>preHYB plus 50 & micro; g/mL Heparin-Natriumsalz, 100 &micro; g/mL Ribonukleinsäure Diethylaminoethanol Salz</td></tr><tr><td>Immunhistochemische Nassbox</td><td>Mkbio</td><td>MH10002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Leica Klingen mit niedrigem Profil</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>MABT (1x)</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, 0,02 % Tween-20, pH 7,5</td></tr><tr><td>Maleinsäure</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J& K Scientific</td><td>116481</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Macklin</td><td>M859248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NTMT</td><td>made in lab</td><td>N/A</td><td>0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1% Tween-20</td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP</td><td>pen Enzo Life Sciences</td><td>ADI-950-233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4%</td><td>Abbexa</td><td>abx082483</td><td>hergestellt im Labor in 1x PBS</td></tr><tr><td>PBST (1x)</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>1x PBS plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Phenylthioharnstoff</td><td>Merck</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>preHYB</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>50 % Formamid, 5x SSC, 9,2 mM Zitronensäure (pH 6,0), 0,1 % Tween-20</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Ribonukleinsäure, Diethylaminoethanolsalz</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie 1,5 mL Röhrchen</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>SSCT (0,2x)</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>0,2x SSC plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (1x)</td><td>hergestellt im Labor</td><td>N/A</td><td>1x SSC plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch</td><td>Labortierzentrum der Universität Nantong</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridisierung kombiniert mit immunhistochemie in kryogeschnittenen zebrafischembryonen

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Als Wirbeltier ist der Zebrafisch in biologischen Studien weit verbreitet. Zebrafisch und Mensch teilen eine hohe genetische Homologie, die es ermöglicht, sie als Modell für menschliche Krankheiten zu verwenden. Die Genfunktionsstudie basiert auf der Detektion von Genexpressionsmustern. Obwohl die Immunhistochemie eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinexpression bietet, schränkt die begrenzte Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper im Zebrafisch die Anwendung der Cofärbung ein. Die In-situ-Hybridisierung wird häufig in Zebrafischembryonen eingesetzt, um die mRNA-Expression nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für Zebrafisch-Embryonenschnitte erhält. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Die Immunhistochemie und die Bildgebung eines einzelnen Kryoschnitts wurden nach in situ Hybridisierung durchgeführt. Das Protokoll ist hilfreich, um das Expressionsmuster zweier Gene zu entschlüsseln, zuerst durch In-situ-Transkriptdetektion und dann durch Immunhistochemie gegen ein Protein im selben Abschnitt.

Mit diesem Protokoll kann das Expressionsmuster einer mRNA und eines Proteins gleichzeitig untersucht werden. Abbildung 1 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf. Der 5-HT2C-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT-Rezeptors, der an den Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) gebunden ist. Es ist im zentralen Nervensystem (ZNS) weit verbreitet und kann eine Vielzahl von Gehirnfunktionen wie Appetit, Stimmung, Angst und Fortpflanzungsverhalten erheblich regulieren13</s...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Dieses Protokoll verwendet eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie und dient als einfache und effiziente Möglichkeit, eine mRNA und ein Protein gleichzeitig zu analysieren. Dieses Protokoll gilt für Embryonen in verschiedenen Stadien, Gewebeschnitte unterschiedlicher Dicke und verschiedene Organe. Zu Beginn fixieren Sie etwa 10 Embryonen mit 0,5 bis 1 Milliliter frischem 4%-Paraformaldehyd in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen bei vier Grad Celsius über Nacht für 12 bis 14 Stunden.Die Embryonen werden nach und nach dehydriert, indem sie mit 25, 50 und 75 % Methanol in PBST nacheinander für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur gewaschen werden. Waschen Sie die Embryonen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 100%igem Methanol. Inkubieren Sie die Embryonen in 100%igem Methanol bei minus 20 Grad Celsius mindestens über Nacht, 12 bis 14 Stunden lang.Rehydrieren Sie die Embryonen nach und nach, indem Sie sie nacheinander fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 75, 50 und 25 % Methanol in PBST waschen. Waschen Sie den Embryo erneut dreimal mit PBST für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur. Verdauen Sie die Embryonen mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K in PBST bei Raumtemperatur und waschen Sie die Embryonen fünf Minuten lang dreimal mit PBST.Anschließend werden die gewaschenen Embryonen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%Paraformaldehyd fixiert. Waschen Sie den Embryo erneut dreimal mit PBST, während Sie bei jeder Wäsche fünf Minuten lang inkubieren. Um die Embryonen vorzuhybridisieren, inkubieren Sie sie fünf Minuten lang in einer Vorhybridisierungslösung bei 65 Grad Celsius.Ersetzen Sie dann die Vorhybridisierungslösung durch die Hybridisierungslösung und hybridisieren Sie mindestens vier Stunden lang vor. Erhitzen Sie die Sonde fünf Minuten lang in der Hybridisierungslösung bei 95 Grad Celsius, bevor Sie sie zu den Embryonen hinzufügen. Entfernen Sie so viel Vorhybridisierungslösung wie möglich, ohne die Embryonen mit der Luft in Berührung kommen zu lassen.In das Röhrchen, in dem sich die Embryonen befinden, wird die vorgewärmte Sonde in die Hybridisierungslösung gegeben und die Sonde über Nacht für 12 bis 14 Stunden bei 50 bis 70 Grad Celsius hybridisieren lassen. Am nächsten Tag wird die Sondenlösung mit einer Pipette abgesaugt und in einem Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt, damit sie viele Male wiederverwendet werden kann. Waschen Sie die Embryonen mit 100%iger Hybridisierungslösung, gefolgt von sequenziellem Waschen mit 75-, 50- und 25%iger Hybridisierungslösung in der doppelten Konzentration von SSCT für 15 Minuten bei 65 Grad Celsius.Waschen Sie die Embryonen dann 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius in der doppelten und 0,2-fachen Konzentration von SSCT. Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in MABT bei Raumtemperatur. Blockieren Sie die hybridisierten und gewaschenen Embryonen mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 2%iger Blocklösung-1.Ersetzen Sie die Blockierlösung-1 durch Antidigoxigenin-Alkalische Phosphatase in einer frischen 2%igen Blockierungslösung-1 und schütteln Sie sie über Nacht 12 bis 14 Stunden bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Embryonen dann viermal in MABT für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Embryonen erneut zweimal in NTMT und entfernen Sie mit einer Pipette so viel NTMT wie möglich aus den Embryonen.Ersetzen Sie die Embryonen durch das violette alkalische Phosphatase-Substrat BM und färben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sobald sich der Fleck gebildet hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zweimal kurz mit NTMT spülen. Nach der In-situ-Hybridisierung werden die Embryonen 20 Minuten lang dreimal mit PBST gespült.Tauchen Sie die Embryonen über Nacht für 12 bis 14 Stunden bei vier Grad Celsius in 5%ige Saccharose in PBS. Wechseln Sie dann die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 15%ige Saccharose in PBS und inkubieren Sie sie über Nacht für 12 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius. Wechseln Sie erneut die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in PBS auf 30%ige Saccharose und inkubieren Sie sie ein bis zwei Tage lang bei vier Grad Celsius.Übertragen Sie die Embryonen in ein neues Kryomold für Gewebe und füllen Sie es vorsichtig mit einem Medium mit optimaler Schnitttemperatur, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Als nächstes schneiden Sie die Proben mit einem Kryostaten in 12 bis 20 Mikrometer dicke Abschnitte und übertragen die Schnitte schnell auf Objektträger. Lassen Sie die Proben Raumtemperatur erreichen und lagern Sie die Schnitte in einem verschlossenen Objektträgerkasten bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung.Waschen Sie die Objektträger, die die Abschnitte enthalten, fünf Minuten lang mit PBS. Legen Sie dann die Objektträger in den Puffer und erhitzen Sie die Lösung etwa 20 Minuten lang, um sie nahe der Siedetemperatur zu halten. Lassen Sie die überschüssige Lösung ab und trocknen Sie den Bereich um jeden Abschnitt vorsichtig mit einem Stück Taschentuch ab.Zeichnen Sie dann mit einem wasserabweisenden Stift einen Kreis um den Abschnitt, um eine hydrophobe Barriere zu bilden, und blockieren Sie den Abschnitt zwei Stunden lang in Sperrlösung-2 bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung pro Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger in einer immunhistochemischen Nassbox bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS, während Sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang inkubieren, und lassen Sie das überschüssige PBS abtropfen.Anschließend werden die Objektträger mit dem entsprechenden Sekundärantikörper eine Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS inkubiert. Waschen Sie die Objektträger erneut dreimal mit PBS, während Sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang inkubieren, und lassen Sie das überschüssige PBS ab. Anschließend wird das Eindeckmedium auf den Objektträger pipettiert und mit einem Objektträgerdeckglas montiert.Die Expression des 5-HT2C-Rezeptors im Zentralnervensystem wurde in der transgenen foxP2 egfp-caax-Linie nachgewiesen. Die simultane Expression von 5-HT2C wurde in der transgenen Linie zusammen mit foxP2-Neuronen beobachtet, die durch ein fluoresceingrün fluoreszierendes Protein markiert wurden. Die Expression von insm1a, einem Zinkfinger-Transkriptionsfaktor im Rückenmark und in den Motoneuronen des Zebrafisches, wurde in der transgenen Linie nachgewiesen.Die simultane Expression von insm1a wurde in der transgenen Linie zusammen mit hb9-Neuronen beobachtet, die durch fluorescein grün fluoreszierendes Protein markiert wurden. Zebrafische müssen mit frisch zubereitetem Paraformaldehyd fixiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.

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Es sind Techniken beschrieben Phospho-Epitope in ganz Zebrafischembryonen zu Immunfärbung und dann leiten zweifarbige Leuchtstoff konfokalen Lokalisierung in zellularen Strukturen so klein wie primäre Zilien. Die Techniken zur Fixierung und Bildgebung können die Position und die Kinetik des Erscheinens oder Aktivierung spezifischer Proteine ​​definieren.

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Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Gen-Editing-Technologien haben es Forschern ermöglicht, Zebrafischmutanten zu generieren, um die Genfunktion relativ einfach zu untersuchen. Hier bieten wir einen Leitfaden zur parallelen Embryo-Genotypisierung und Quantifizierung von In-situ-Hybridisierungssignalen in Zebrafischen. Dieser unvoreingenommene Ansatz bietet eine höhere Genauigkeit bei phäotypischen Analysen auf der Grundlage der In-situ-Hybridisierung.

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Der Zebrafisch ist ein wichtiges Modell für das Verständnis der Nierenentwicklung. Hier wird ein In-situ-Hybridisierungsprotokoll optimiert, um die Genexpression in Zebrafischlarven und Juvenilen während der Mesonephrosentwicklung nachzuweisen.

In situ Hybridisierung in Zebrafischlarven und Jungfischen während der Mesonephrosentwicklung

Lernen Sie die kombinierte in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion von mRNA und Protein in neuronalen Populationen.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

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