Name: Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Organ-on-a-Chip-Technologie mit menschlichen Darmorganoiden kombiniert wird, um die intestinale Physiologie zu modellieren. Diese Methode ermöglicht präzise Vorhersagen von Pharmakokinetik und Arzneimittelinteraktionen.

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Wir danken Professor Mark Donowitz für die Bereitstellung der aus der Darmbiopsie gewonnenen Organoide und Brett Clair für die Entwicklung der wissenschaftlichen Illustrationen des Chip-, tragbaren und Kulturmoduls. Der Rest der wissenschaftlichen Illustrationen wurde mit dem BioRender erstellt.

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</ol>

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi und Magdalena Kasendra sind aktuelle oder ehemalige Mitarbeiter von Emulate Inc. und können Eigenkapital halten. Emulate Inc. ist das Unternehmen, das die Organchip-Geräte herstellt und Patente veröffentlicht hat, die für die in diesem Artikel genannte Arbeit relevant sind.

Die Kombination von Organ-on-a-Chip-Technologie und Darmorganoiden verspricht eine genaue Modellierung der menschlichen Darmphysiologie und Pathophysiologie. Hier stellen wir ein einfaches und robustes Schritt-für-Schritt-Protokoll (in Abbildung 1 dargestellt) für die Etablierung des Darmchips bereit, der biopsiebasierte Dünndarm- oder Kolonepithel- und intestinale mikrovaskuläre Endothelzellen enthält, die in einem mikrofluidischen Gerät kokultiviert werden. Diese chipbasierte Simulation de...

Der menschliche Darm ist ein komplexes und multitaskingfähiges Organ, das sich selbst regenerieren kann. Es ist in den Dünn- und Dickdarm unterteilt. Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht darin, die aus dem Magen kommende Nahrung weiter zu verdauen, alle Nährstoffe aufzunehmen und die Rückstände an den Dickdarm weiterzugeben, der das Wasser und die Elektrolyte zurückgewinnt. Der Dünndarm ist weiter in mehrere anatomisch unterschiedliche Regionen unterteilt: Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum, von denen jede angepasst ist, um bestimmte Funktionen zu erfüllen. Zum Beispiel hilft der Zwölffingerdarm, den Speisebrei (Mageninhalt) abzubauen, um die richtige Aufnahme von Nährstoffen mit Proteinen, Kohlenhydraten, Vitaminen und Mineralien im Jejunum zu ermöglichen. Dieser proximale Teil des Dünndarms ist auch der Hauptort der intestinalen Arzneimittelabsorption und des Metabolismus und zeichnet sich durch die höhere Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen (z. B. CYP3A4) im Vergleich zu ihrer Expression im Ileum und Dickdarm1 aus. Zusätzlich zu seiner Hauptrolle bei der Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen ist der Darm auch eine wirksame Barriere gegen potenziell schädliche luminale Inhaltsstoffe wie pathogene Mikroorganismen, mikrobielle Metaboliten, diätetische Antigene und Toxine 2,3. Es ist bemerkenswert, dass der menschliche Dickdarm von einer großen Anzahl von Mikroorganismen bewohnt wird, die weit über die der gesamten Zellen im menschlichen Körper hinausgehen, die viele Vorteile für Ernährung, Stoffwechsel und Immunität bieten. Daher ist die Aufrechterhaltung der Integrität der Schleimhautbarriere, die von Darmepithelzellen gebildet wird, entscheidend für die symbiotische Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und den Wirtszellen, indem sie physisch getrennt werden, um eine unnötige Aktivierung von Immunzellen zu vermeiden2. Darüber hinaus spielt der programmierte Darmzelltod eine wesentliche Rolle als Selbstschutzmechanismus, der verhindert, dass infizierte Zellen persistieren oder sich vermehren - wodurch potenzielle Krankheitserregerverbreitet werden 3 -, während die kontinuierliche Selbsterneuerung des Darmepithels alle vier bis sieben Tage den Zellverlust kompensiert und die Barriereintegrität und Gewebehomöostase sicherstellt. Beeinträchtigungen der beschriebenen Darmfunktionen, einschließlich Nährstoffaufnahme, Barriereintegrität oder Ungleichgewicht beim Tod und der Selbsterneuerung von Darmzellen, können zur Entwicklung einer Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen führen, einschließlich Unterernährung und entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)2,3.
Zuvor wurden Tiermodelle und transformierte Krebs-abgeleitete Darmzelllinien verwendet, um die physiologischen und pathophysiologischen Funktionen des menschlichen Darmgewebes zu untersuchen. Immer deutlichere Bedenken hinsichtlich der Übertragbarkeit von Tierversuchen auf den Menschen, die durch das Vorhandensein erheblicher Unterschiede zwischen den beiden Arten verursacht werden, unterstrichen jedoch die Notwendigkeit humanrelevanter Alternativmethoden4. Zu den häufig verwendeten In-vitro-Darmzelllinien gehören T84-, Caco-2- und HT29-Zellen. Während sie bestimmte Aspekte der Darmbarrierefunktion und des Membrantransports nachahmen, sind sie durch eine veränderte Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen5, Oberflächenrezeptoren und Transportern4 gekennzeichnet. Darüber hinaus fehlt es ihnen an Spezifität des Darmsegments und sie können die Komplexität des Darmepithels nicht rekapitulieren, wobei jedes Modell nur einen der fünf im Darm vorhandenen Epithelzelltypen enthält6.
Kürzlich wurden humane Darmorganoidkulturen, die aus frischen Biopsien des Dünndarms und des Dickdarms7,8 oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)9 hergestellt wurden, als alternative experimentelle Modelle mit dem Potenzial eingeführt, Tierversuche in Zukunft zu ergänzen, zu reduzieren und vielleicht zu ersetzen. Während iPS-Zellen auf nicht-invasive Weise erhalten werden können, erfordert die Etablierung von Organoiden aus iPS-Zellen die Verwendung komplexer und langwieriger Protokolle (mit mehreren experimentellen Schritten) und erzeugt Kulturen, die menschlichem fötalem Gewebe ähneln. Im Gegensatz dazu sind Biopsie-abgeleitete Organoide hochgradig skalierbar, da sie die inhärente Erneuerungskapazität von Darmgewebe nutzen können und auf unbestimmte Zeit in vitro durchgangen und vermehrt werden können. Wichtig ist, dass Biopsie-abgeleitete Organoide die krankheits- und darmregionenspezifischen Eigenschaften des primären Gewebes, aus dem sie entwickelt wurden, beibehalten und die zelluläre Vielfalt des Darmepithels nachahmen. Organoide können als patientenspezifische Avatare in vitro verwendet werden, um die Biologie und Pathogenese verschiedener Magen-Darm-Erkrankungen zu entschlüsseln und ihr therapeutisches Management zu verbessern. Obwohl Darmorganoide einen beeindruckenden Grad an physiologischer Funktionalität erreicht haben, können sie die Komplexität der nativen Organe aufgrund ihres Mangels an kritischen Stromakomponenten - einschließlich Blutgefäßen, Bindegewebe, peripheren Nerven und Immunzellen - sowie der mechanischen Stimulation immer noch nicht reproduzieren. Es ist bekannt, dass mechanische Parameter wie Strömung, Scherspannung, Dehnung und Druck die Morphogenese und Homöostase des Gewebes in vivo beeinflussen und in vitro 10,11,12,13 die Reifung von Zellen verbessern. Ein weiterer wichtiger Nachteil von Organoidsystemen ist die Unzugänglichkeit des Lumens und damit der apikalen Seite des Epithels. Dies stellt eine Herausforderung für die Untersuchung verschiedener Mechanismen dar, die mit der polarisierten Expression von Ionen- und Arzneimitteltransportern, Wirt-Mikrobiom-Interaktionen und pharmazeutischen Toxizitätstests verbunden sind. Schließlich leiden Organoidkulturen aufgrund der stochastischen Natur des In-vitro-Selbstorganisationsprozesses und der Wahl des Zellschicksals unter erhebliche Variabilität in Größe, Morphologie und Funktion. Um das volle Potenzial von Darmorganoiden in der Krankheitsmodellierung, im Arzneimittelscreening und in der regenerativen Medizin auszuschöpfen, ist es daher notwendig, neue Strategien zu erforschen, die die Variabilität in der Organoidentwicklung reduzieren, den Zugang zum luminalen Kompartiment verbessern und fehlende Zell-Zell-Interaktionen einbeziehen.
Die Organ-on-a-Chip-Technologie hat viele Techniken zur Integration mechanischer Kräfte und des Flüssigkeitsflusses in Darmzellkulturen in vitro eingeführt. Da jedoch die meisten der ersten Proof-of-Concept-Studien Krebszelllinien verwendet haben, die keine ausreichende zelluläre Vielfalt aufwiesen, wurde die Relevanz dieser Systeme in Frage gestellt. Vor kurzem haben wir intestinale Organoide und Organ-on-a-Chip-Technologie synergetisch kombiniert, um die besten Eigenschaften jedes Ansatzes in ein In-vitro-System zu integrieren 14,15,16. Der resultierende Darm-Chip rekapituliert die multizelluläre Architektur des Darmepithels, das Vorhandensein einer epithelial-endothelialen Gewebeschnittstelle und die mechanischen Kräfte des Flüssigkeitsflusses und der Dehnung, was die Emulation von Funktionen auf Organebene in vitro ermöglicht. Darüber hinaus erhöht die Verwendung von aus Primärgewebe gewonnenen Organoiden (die aus verschiedenen Regionen des menschlichen Darms entnommen werden können) als Ausgangsmaterial die Vielseitigkeit dieses Modells, da Chips, die den menschlichen Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den Dickdarm darstellen, nach ähnlichen Aussaat- und Kulturverfahren etabliert werden können. Wichtig ist, dass Darm-Chips eine Echtzeit-Bewertung von: der Integrität der Darmbarriere ermöglichen; Aktivität der Bürstengrenze und der Arzneimittelstoffwechselenzyme; Erzeugung von Mucinen; Sekretion von Zytokinen; und Interaktion von Darmzellen mit pathogenen und kommensalen Mikroorganismen, wie in den zuvor veröffentlichten Berichten gezeigt. Insbesondere als Darmchips mit Organoiden aus dem Gewebe verschiedener Individuen hergestellt wurden, erfassten diese Modelle die erwartete Variabilität zwischen den Spendern in den funktionellen Reaktionen auf verschiedene Medikamente und Behandlungen. Insgesamt öffnet die Verschmelzung von Organoiden mit der Organ-on-a-Chip-Technologie die Tür zu fortschrittlicheren, personalisierten, in vivo relevanten Modellen, die die physiologische Relevanz und Genauigkeit der In-vitro-Befunde sowie deren Extrapolation auf den Menschen verbessern könnten. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung des Darmchips und seiner Anwendung in den Studien der physiologischen Funktionen der beiden Darmsegmente Zwölffingerdarm und Dickdarm vorgestellt. Zunächst werden die Methoden zur Beurteilung der Aktivität des arzneimittelmetabolisierenden Enzyms CYP3A4 im Zwölffingerdarmchip sowie dessen Induktion durch prototypische Verbindungen wie Rifampicin und Vitamin D3 beschrieben. Zweitens sind die Schritte, die erforderlich sind, um den "undichten Darm" im Dickdarmchip zu modellieren, im Protokoll beschrieben, wobei die Störung der Epithelbarriere unter Verwendung von charakteristischen Zytokinen durchgeführt wird, die an der Pathogenese der IBD beteiligt sind. Kurz gesagt, Organoide, die aus menschlichen Biopsien gewonnen werden, werden in vitro vermehrt, einer enzymatischen Verdauung unterzogen und in den oberen Kanal des Chips eingeführt. Bei kontinuierlicher Perfusion mit wachstumsfaktorangereicherten Medien entwickeln sie sich zu einer konfluierenden epithelialen Monoschicht mit 3D-Architektur und einer leicht zugänglichen apikalen Zelloberfläche. Das untere, "vaskuläre" Chipkompartiment ist mit mikrovaskulären Endothelzellen bestückt, die aus dem Dünn- oder Dickdarm isoliert sind. Epithel und Endothel sind durch eine poröse dehnbare Membran getrennt, die die parakrinen Wechselwirkungen zwischen den beiden Geweben erleichtert und bei zyklischen Verformungen peristaltisähnliche Bewegungen des menschlichen Darms nachahmt. Die Kokultur wird unter den dynamischen Strömungsbedingungen gehalten, die durch luminale und vaskuläre Perfusion mit geeigneten Zellkulturmedien erzeugt werden. Schließlich beschreiben wir zahlreiche Arten von Assays und Endpunktanalysen, die direkt auf dem Chip oder aus entnommenen Zellkulturabwässern durchgeführt werden können.

<table><tbody><tr><td>Dünndarm Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Darms</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0,5 Zellen M/ml ; kryokonservierter</td></tr><tr><td>Dickdarm Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Darms</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0,5 Zellen M/ml ; kryokonservierte</td></tr><tr><td>biopsieabgeleitete menschliche Duodenal-Organoide</td><td>John Hopkin's University</td><td>-</td><td>Die Organoide wurden von Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329) zur Verfügung gestellt.</td></tr><tr><td>Aus Biopsien gewonnene menschliche Dickdarm-Organoide</td><td>John Hopkin's</td> <td>University-Die</td> <td>Organoide wurden von Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329) zur Verfügung gestellt.</td></tr><tr><td>Zo&euml; CM-1 & Handel; &nbsp; Kulturmodul</td><td>emulieren&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Kulturmodul</td></tr><tr><td>Orb-HM1&trade; &nbsp; Emulation von Hub-Modulen</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>5% CO2, Vakuumdehnung und Stromversorgung</td></tr><tr><td>Chip-S1&trade; Dehnbare</td><td>Chip-Emulation&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Organ-Chip-Pod</td></tr><tr><td>& Handel; Portable Module</td><td>emulieren&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>Tragbares Modul</td></tr><tr><td>UV-Lichtkasten-Emulate</td><td>&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Chip Cradle</td><td>Emulate&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>1 pro quadratische Kulturschale</td></tr><tr><td>Steriflip&reg;-HV Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0,45&nbsp; &mu; M&nbsp; PVDF-Filter</td></tr><tr><td>Quadratische Zellkulturschale (120 x 120 mm)</td><td>VWR</td><td>82051-068-Handheld</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vakuum&nbsp; Aspirator</td><td>Corning</td><td>4930</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>Aspirieren&nbsp; Pipetten</td><td>Corning / Falcon</td><td>357558</td><td>2 mL,&nbsp; Polystyrol, einzelnbsp; verpackte</td></tr><tr><td>Aspirationsspitzen</td><td>&nbsp;-</td><td></td><td>Steril (autoklaviert)</td></tr><tr><td>Serologisch&nbsp; Pipetten</td><td></td><td>&nbsp;-</td><td>2 mL, 5 mL,&nbsp; 10 ml,&nbsp; und&nbsp; 25 ml&nbsp; Endotoxinarm, sterile</td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td>P20, P200, &nbsp; P1000&nbsp; und Standard-Mehrkanalpipetten</td></tr><tr><td>&nbsp; Tipps&nbsp;</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp; und&nbsp; P1000.</td></tr><tr><td>Konische Rohre&nbsp;( Eiweiß&nbsp; LoBind&reg; Röhren)</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216; &nbsp; 0030122240</td><td>15 mL, 50 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Rohre&reg; &nbsp; lo-bind</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>1,5 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>96 Wells schwarz wandige Platte</td><td></td> <td>-</td> <td>für die Analyse der epithelialen Permeabilität</td></tr><tr><td>Mikroskop (mit Kamera)</td> <td>-</td><td></td> <td>Für Hellfeldmikroskop Bildgebung</td></tr><tr><td>Wasserbad (oder Kügelchen)</td> <td>-</td><td></td> <td>Auf 37° einstellen C</td></tr><tr><td>Vakuum-Einrichtung</td><td>&nbsp;-</td><td>-</td><td>Minimum&nbsp; Druck: -70 kPa</td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Biotium</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td>Zellkulturkolben</td></tr><tr><td>Emulate Reagenz-1&nbsp;( ER-1)</td><td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>Chip-Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>Reagenz emulieren-2&nbsp;( ER-2)</td><td>Emulate Inc.</td><td>-</td><td>Chip-Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS&nbsp; (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>Wasser in Zellkulturqualität</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma</td><td>93595</td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>TryplE&nbsp; Express</td><td>ThermoFisher&nbsp; Wissenschaftliche</td><td>12604013</td><td>Organoide&nbsp; Dissoziation&nbsp; und Endothelzellen&nbsp; Ablösung&nbsp; Lösung</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher&nbsp; Wissenschaftliche</td><td>12634028</td><td>Medium</td></tr><tr><td>IntestiCult&Handel; Organoides Wachstumsmedium (Mensch)</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>06010</td><td>Organoides Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Endothelzellwachstumsmedium MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>Endothelmedium</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Primocin&trade; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td><td>antimikrobielles Mittel</td></tr><tr><td>Attachment Factor&trade;</td><td>Cell Systems</td><td>4Z0-210</td><td>Beschichtungslösung für Kolben</td></tr><tr><td>Matrigel - Wachstumsfaktor reduziert</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Solubilisierte Basalmembranmatrix</td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>ECM-Komponente</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>ECM-Komponente</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>72304</td><td>Organoid-Medienergänzung</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>Organoid-Medienergänzungsmittel</td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Basement Mebran Matrix Dissoziationslösung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td>30%, steril</td></tr><tr><td>Wasser in Zellkulturqualität</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td>steril, Wasser</td></tr><tr><td>DMSO Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>3KDa Dextran Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 mg Pulver</td></tr><tr><td>Rifampicin (RIF)</td><td>Sigma</td><td>Cat# R3501</td><td>CYP-Induktor</td></tr><tr><td>Testosteronhydrat</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>CYP-Substrat</td></tr><tr><td>1,25-Dihyroxy Vitamin D3 (VD3)</td><td>Sigma</td><td>Cat# D1530</td><td>CYP-Induktor</td></tr><tr><td>Acetonitril mit 0,1% (v/v) Ameisensäure</td><td>Sigma</td><td>159002</td><td>LCMS-Stop-Lösung</td></tr><tr><td>IFN&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum (NDS)</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludin</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>33-1500</td><td>Tight Junctions Marker</td></tr><tr><td>Anti-Claudin 4</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>36-4800</td><td>Tight Junctions Marker</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>epithelial Adherens Junctions</td></tr><tr><td>Marker Anti-VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>endothelial adhärente Verbindungen</td></tr><tr><td>Marker Anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td><td>Thermo Fischer</td><td>339194</td><td>Tight Junctions Marker</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>62248</td><td>Kernfärbung</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183020</td><td>RNA Lyse-, Isolierungs- und Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>SuperScript&trade; IV VILO & Handel; Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>reverse Transkriptase-Kit</td></tr><tr><td>TaqMan&trade; Fast Advanced Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444557</td><td>qPCR Reagenz</td></tr><tr><td>QuantStudio&trade; 5 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28573</td><td>Real-time PCR cycler</td></tr><tr><td>18S Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Eukaryotic 18S rRNA</td></tr><tr><td>CYP3A4 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00604506_m1</td><td>Cytochrom&nbsp; Familie 3 Unterfamilie A Mitglied 4</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23236</td><td>Proteinquantifizierungskit</td></tr><tr><td>MSD Tris Lysepuffer</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R60TX-3</td><td>Proteinlysepuffer</td></tr><tr><td>Gespaltenes/Gesamt Caspase-3 Ganzzell-Lysat Kit</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15140D</td><td>Caspase 3 Nachweiskit</td></tr><tr><td>V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>K15198D</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td><td>Mesoskala Diagnostik</td><td>K15053D</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td></td> Zeiss-Konfokalmikroskop <td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td><td>Zeiss-20X</td><td></td> <td>Fernobjektive</td></tr><tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td><td>Zeiss-Hellfeldmikroskop</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td><td>Zeiss-10X</td><td></td> <td>Objektive</td></tr></tbody></table>

kombination von menschlichen organoiden und organ-on-a-chip-technologie zur modellierung der intestinalen regionsspezifischen funktionalität

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

Die Darmschleimhaut ist eine komplexe physikalische und biochemische Barriere, die eine Vielzahl wichtiger Funktionen erfüllt. Es ermöglicht den Transport, die Aufnahme und den Stoffwechsel von Nährstoffen und Xenobiotika und erleichtert gleichzeitig eine symbiotische Beziehung mit der Mikrobiota und begrenzt die Invasion von Mikroorganismen. Die funktionelle Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen und ihrer physikalischen und biochemischen Umgebung ist für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Homöostase des Darmgewebes von entscheidender Bedeutung. Die Modellierung dieser komplexen Wechselwirkungen und der integrierten Darmphysiologie in vitro ist ein gewaltiges Ziel mit dem Potenzial, die Art und Weise, wie neue therapeutische Ziele und Arzneimittelkandidaten entdeckt und entwickelt werden, zu verändern.
Organoide und Organ-on-a-Chip-Technologien wurden kürzlich kombiniert, um humanrelevante Darmchips zu erzeugen, die geeignet sind, die funktionellen Aspekte der Darmphysiologie und Pathophysiologie in vitro zu untersuchen. Organoide, die aus den Biopsien des Dünndarms (Zwölffingerdarm) und des Dickdarms gewonnen werden, werden in das obere Kompartiment eines Organchips gesät und dehnen sich dann erfolgreich als Monoschichten aus, während die unterschiedlichen zellulären, molekularen und funktionellen Merkmale jeder Darmregion erhalten bleiben. Gewebespezifische mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Darms werden in das untere Kompartiment des Organchips integriert, um die epithelial-endotheliale Schnittstelle nachzubilden. Diese neuartige Plattform erleichtert die luminale Exposition gegenüber Nährstoffen, Medikamenten und Mikroorganismen und ermöglicht Untersuchungen des Darmtransports, der Permeabilität und der Wirt-Mikroben-Interaktionen.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von Darmchips, die den menschlichen Zwölffingerdarm (Zwölffingerdarmchip) und Dickdarm (Dickdarmchip) darstellen, und deren anschließende Kultur unter kontinuierlicher Strömung und peristaltisartigen Verformungen bereitgestellt. Wir demonstrieren Methoden zur Beurteilung des Arzneimittelstoffwechsels und der CYP3A4-Induktion im Zwölffingerdarmchip anhand prototypischer Induktoren und Substrate. Schließlich bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die In-vitro-Modellierung von Interferon-gamma (IFNγ)-vermittelter Barrierestörung (Leaky-Gut-Syndrom) in einem Dickdarmchip an, einschließlich Methoden zur Bewertung der Veränderung der parazellulären Permeabilität, Veränderungen der Zytokinsekretion und transkriptomischer Profilierung der Zellen innerhalb des Chips.

Abbildung 1D fasst die Zeitleiste der Darmchipkultur zusammen und veranschaulicht die intestinalen Endothelzellen und Organoide vor und nach der Aussaat auf dem Chip. Darüber hinaus zeigt es die deutlichen morphologischen Unterschiede zwischen dem Zwölffingerdarm und den Dickdarmchips, die durch das Vorhandensein der zottenartigen Formationen im Zwölffingerdarmchip hervorgehoben werden und repräsentativ für die Dünndarmarchitektur sind.
Abbild...

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Dieses Protokoll zeigt, wie Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chip-Technologie verwendet werden können, um einen physiologisch relevanten Darmchip zu erzeugen, der dann zur Vorhersage von Pharmakokinetik und Arzneimittelwechselwirkung und zur Untersuchung der intestinalen Epithelbarrieredysfunktion verwendet werden kann. Die Vereinigung von Organoiden in der Organ-on-a-Chip-Technologie ermöglicht es uns, die Komplexität des Darmepithels zu reproduzieren. Darüber hinaus ermöglicht es eine bessere experimentelle Kontrolle der mechanischen Hinweise, der Strömungsverteilung und der biochemischen Gradienten.Diese Methode emuliert die komplexe Physiologie des menschlichen Darms und ermöglicht ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Grundlagen normaler und pathologischer Darmfunktionen. Dies hilft, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie potenzielle Arzneimittelkandidaten besser vorherzusagen, um entzündliche Schäden zu verhindern. Seeding ist ein kritischer Schritt im Protokoll.Eine übermäßige Fragmentierung oder ungenaue Aussaatdichte der intestinalen Organoidfragmente kann die Entwicklung und Differenzierung der Epithelbarriere beeinträchtigen. Um zu beginnen, saugen Sie das Medium aus der statischen Organoidkultur ab. Gewinnen Sie Medien aus genügend Vertiefungen zurück, um eine endgültige Seeding-Dichte von acht Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen.Fügen Sie 500 Mikroliter eiskalte BMM-Dissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu und befestigen Sie das gelöste BMM von der Bohrlochoberfläche. Sammeln Sie die Suspension in ein 15 Milliliter proteinarmes Binderöhrchen und legen Sie es auf Eis. Schütteln Sie die Tube vorsichtig alle 15 Minuten für eine Stunde.Zentrifugieren Sie bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um ein organoides Pellet zu erhalten. Wenn eine transparente Gelschicht über dem Pellet beobachtet wird, saugen Sie die Lösung aus dem Röhrchen ab. Resuspendieren Sie das Pellet und fügen Sie eine gleiche Menge BMM-Dissoziationslösung hinzu.Auf Eis 10 Minuten inkubieren und zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine gelösten BMM-Rückstände mehr vorhanden sind. Dann den Überstand verwerfen und das Pellet in zwei Milliliter Organoid-Aufschlusslösung resuspendieren.Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Minuten und fügen Sie acht Milliliter fortgeschrittenes DMEM F12 hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem organoidem Wachstumsmedium, um acht Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Aliquot 360 Mikroliter in sterilen 1,5 Milliliter proteinarmen Binderöhrchen.Als nächstes entfernen Sie das Medium aus dem oberen Kanal der beschichteten Chips und fügen 30 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie die Chips über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Organoidfragmente an der Membran zu haften. Fügen Sie drei Milliliter voräquilibriertes vollständiges organoides Wachstumsmedium in das obere Einlassreservoir und drei Milliliter voräquilibriertes Endothelzellwachstumsmedium in das untere Einlassreservoir hinzu.Geben Sie 300 Mikroliter des gleichen Mediums in die jeweiligen oberen und unteren Auslassbehälter. Bringen Sie das Fach mit den tragbaren Modulen in das Kulturmodul. Führen Sie auf dem Kulturmodul wiederholt den Prime-Zyklus durch, bis sich genügend Tröpfchen für eine erfolgreiche Verbindung der Chips bilden.Schieben Sie dann den Chipträger in das tragbare Modul. Starten Sie dann den zweistündigen Regelzyklus, um die Kulturmedien im tragbaren Modul und Chip unter Druck zu setzen, wonach die programmierten Bedingungen wieder aufgenommen werden. Ändern Sie als Nächstes die Stretch-Einstellungen und starten Sie das Kulturmodul.Nach 24 Stunden wiederholen Sie den Zyklus mit 10% Dehnung und der gleichen Frequenz. Zur Herstellung von Dosiermedien oder Vehikelkontrollen werden die CYP-Induktor-Stammlösungen oder DMSO in vollständigem Organoid-Wachstumsmedium und Endothelzellwachstumsmedium verdünnt. Pausieren Sie das Kulturmodul und bringen Sie die Schalen zur Biosicherheitswerkbank.Ersetzen Sie die Medien in allen Ein- und Auslassbehältern durch zwei Milliliter Dosiermedien mit Induktoren oder Fahrzeugsteuerung. Bringen Sie die tragbaren Module zurück zum Kulturmodul und starten Sie den Durchfluss mit 30 Mikrolitern pro Stunde neu. Ersetzen Sie das Medium alle 24 Stunden durch eine frisch zubereitete Induzierlösung und setzen Sie die Kultur für 48 bis 72 Stunden fort.Bringen Sie dann die Schalen zur Biosicherheitswerkbank und saugen Sie das Dosiermedium aus allen Behältern ab. Waschen und ersetzen Sie das obere Einlassreservoir durch warmes, fortschrittliches DMEM F12-Medium und das untere Reservoir durch ein Endothelzellwachstumsmedium. Ersetzen Sie das Waschmedium durch einen Milliliter Sondensubstratlösung.Perfundiert die Chips fünf Minuten lang mit einer hohen Durchflussrate von 1.000 Mikrolitern pro Stunde und saugen Sie sowohl die oberen als auch die unteren Auslassbehälter ab. Die Chips werden in das Kulturmodul zurückgeführt und eine Stunde lang unter einem konstanten Fluss von 300 Mikrolitern pro Stunde inkubiert. Stoppen Sie nach einer Stunde Behandlung den Fluss und bringen Sie die Schalen zum Biosicherheitswerkbänke.Sammeln Sie 100 Mikroliter Abwasser aus dem oberen Auslassbehälter und geben Sie es in ein Röhrchen mit 200 Mikrolitern Stopplösung. Stellen Sie die Röhrchen sofort auf Trockeneis und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie beide Kanäle mit 200 Mikrolitern sterilem DPBS.Blockieren Sie dann den unteren Kanalauslass mit einer 200 Mikroliter Filterpipettenspitze. 50 Mikroliter der Dissoziationslösung durch den Bodenkanal perfundiert und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sorgen Sie für eine vollständige Ablösung der Endothelzellen und entfernen Sie die Dissoziationslösung durch Pipettieren aus dem Kanal.Wiederholen Sie die Wäsche. Als nächstes blockieren Sie den oberen Kanalauslass und perfusionieren 75 Mikroliter Proteinlysepuffer. Lassen Sie die Pipettenspitze eingesetzt und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Sammeln Sie die Zelllysate in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie fünf- bis 10-mal pipettieren. Wiederholen Sie die Perfusion und Entnahme, um eine vollständige Ablösung der Zellen zu erhalten, und lagern Sie die Lysate bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Für die RNA-Lyse folgen Sie dem gleichen Verfahren, während Sie 150 Mikroliter RNA-Lysepuffer verwenden.Zuerst wird eine Interferon-Gamma-Dosierlösung hergestellt, indem die Stammlösungen in entgastem Endothelzellwachstumsmedium verdünnt werden. Im Biosicherheitswerkschrank das Medium aus den unteren Kanaleinlassbehältern entnehmen und täglich durch drei Milliliter der Dosierlösung ersetzen. Dann legen Sie die Schalen in das Kulturmodul und perfundiert die Chips mit einer hohen Durchflussrate von 1.000 Mikrolitern pro Stunde für fünf Minuten.Stellen Sie die Durchflussrate auf 60 Mikroliter pro Stunde um und setzen Sie die fluidische Kultur fort. Fügen Sie 100 Mikroliter DPBS pro Vertiefung in eine 96-Well-schwarze Wandplatte ein. Mit einer Mehrkanalpipette werden 50 Mikroliter des Abwassers aus allen Lagerstätten in die jeweiligen Brunnen gegeben.Um eine Standardkurve zu erstellen, führen Sie eine dreifache Verdünnung des Mediums durch, das 100 Mikrogramm pro Milliliter drei Kilodalton Dextran-Kaskadenblau in DPBS enthält. Führen Sie dann serielle Wahnvorstellungen mit einer dreifachen Verdünnung des Wachstumsmediums der Endothelzellen in DPBS durch. Ausgeprägte morphologische Merkmale des Zwölffingerdarms und des Dickdarms wurden durch das Vorhandensein der zottenartigen Formationen im Zwölffingerdarmchip hervorgehoben, die die Architektur des Dünndarms darstellen.In dem Zwölffingerdarmchip, der den Cytochrom-P450-Induktoren Rifampicin und Vitamin D3 ausgesetzt war, gab es eine erhöhte mRNA-Genexpression für das Arzneimittelmetabolisierungsenzym Cytochrom P450 3A4 und eine erhöhte katalytische Aktivität des Cytochrom-P450-Enzyms, was auf geeignete Induktionsreaktionen bei allen drei Organoidspendern hinweist. Bei der Behandlung der epithelialen Monoschicht des Dickdarmchips mit Interferon gamma wurden eine kompromittierte Zellmorphologie und ein Verlust des säulenförmigen Epithels beobachtet. Auch die Behandlung mit Interferon gamma führte im Vergleich zur Vehikelkontrolle zu einem erhöhten zytoplasmatischen Signal von Tight und Adhärent Junction Proteinen, was die Verschiebung der Tight Junction-Marker ZO-1 und Claudin 4 und die Internalisierung von Occludin und E-Cadherin zeigte.Ein signifikanter Anstieg der epithelialen parazellulären Permeabilität wurde nach 48 Stunden Interferon-Gamma-Stimulation auf Dickdarmchips beobachtet. In ähnlicher Weise induziert Interferon gamma die Aktivierung der Apoptose, die durch eine Erhöhung des intrazellulären Inhalts der gespaltenen Caspase 3 angezeigt wird. Interferon gamma induzierte eine polarisierte Sekretion von entzündungsfördernden Molekülen im Dickdarmchip, wie die basolaterale Sekretion von VCAM-1 und Interleukin-6 und die apikale Sekretion von ICAM-1 und Serum-Amyloid-Protein A zeigen.Für eine erfolgreiche Darmchip-Kultur sollte man undifferenzierte Organoide verwenden und die Fragmentierungs- und Seeding-Dichte-Anweisungen befolgen.Nach erfolgreicher Etablierung des Darmchips können wir die intestinale Resorption, den Transport und den Stoffwechsel, den Nährstoffgehalt und die Darmhormonsekretion, die Wechselwirkungen zwischen Wirtsmikrobenpathogenen, die Arzneimittelsicherheit und -wirksamkeit, patientenspezifische Krankheitsmechanismen und das Ansprechen auf Therapien untersuchen.

combining-human-organoids-organ-on-chip-technology-to-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

neuroHuMiX ist ein fortschrittliches Gut-on-a-Chip-Modell zur Untersuchung der Interaktionen von bakteriellen, epithelialen und neuronalen Zellen unter proximalen und repräsentativen Co-Kulturbedingungen. Dieses Modell ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die der Kommunikation zwischen dem Darmmikrobiom und dem Nervensystem zugrunde liegen.

Ein Gut-on-a-Chip-Modell zur Untersuchung der Achse Darmmikrobiom und Nervensystem

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC), das für mechanistische Studien zur Krankheitspathogenese verwendet werden kann. Es verfügt über einen mikrofluidischen Chip, der mit Darmenteroiden besät ist, die aus dem menschlichen Neugeborenendarm, Endothelzellen und dem Darmmikrobiom eines Neugeborenen mit schwerem NEC stammen.

Mikrofluidisches Modell der nekrotisierenden Enterokolitis unter Einbeziehung menschlicher neonataler Darmenteroide und eines dysbiotischen Mikrobioms

Die Integration von caninen Darmorganoiden und einem mikrofluidischen Gut-on-a-Chip-System bietet relevante translationale Modelle für menschliche Darmerkrankungen. Die vorgestellten Protokolle ermöglichen eine 3D-Morphogenese und eine dynamische In-vitro-Modellierung des Darms und helfen so bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen für Darmerkrankungen bei Hunden und Menschen mit One Health.

Dreidimensionale Morphogenese im Darm-on-a-Chip von Hunden unter Verwendung von Darmorganoiden, die von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen stammen

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Das Protokoll kombiniert die Technologie der menschlichen Darmorganoide mit der Transkriptomanalyse einzelner Zellen, um einen wichtigen Einblick in die bisher unerforschte Darmbiologie zu erhalten.

Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

Menschliche Darmorganoide müssen innerviert werden, um die Struktur und Funktion des nativen menschlichen Darms besser rekapitulieren zu können. Hier stellen wir eine Methode vor, um ein enterisches Nervensystem in diese Konstrukte einzubauen.

Innervation menschlicher Darmorganoide

Erfahren Sie, wie Organ-on-a-Chip-Technologie mit menschlichen Darmorganoiden kombiniert wird, um die intestinale Physiologie zu modellieren. Diese Methode ermöglicht präzise Vorhersagen von Pharmakokinetik und Arzneimittelinteraktionen.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität (Video) | JoVE Journal

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

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