Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Wir beschreiben unser Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und eine robuste Methode, um sie in die Skelettmuskellinie zu differenzieren. Diese Technik ermöglicht es uns, mesenchymale Stammzellen mit hoher Lebensfähigkeit und Wärme zu isolieren, mit wenig bis gar keiner Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs und die myogene Differenzierung bei diesen Krankheiten effizient zu induzieren. Kordeltorsion und Schleimhautkonsistenz erschweren die Handhabung der Schnur.

Wir zeigen, wie man die Schnur verarbeitet, um das Wharton-Gelee nicht abzukratzen und Endothelzellen aus der Population auszuschließen. Nachdem Sie das Nabelschnurgewebe zur Lieferzeit gesammelt haben, geben Sie das Nabelschnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 Quadratzentimeter große mit Gewebekultur behandelte Schale und waschen Sie das Gewebe gründlich mit frischem PBS. Um die Nabelschnurtorsion und die Schleimhautoberfläche zu pflegen, stecken Sie das Gewebe mit einer Pinzette in einer Hand fest.

Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seines Längszugangs, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und Venen. Entfernen Sie mit einem Skalpell die Blutgefäße, indem Sie sie in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen und das Nabelschnurgewebe in PBS spülen, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen.

Zerkleinern Sie jede Hälfte des Nabelschnurgewebes in 0,5 Kubikzentimeter große Fragmente. Legen Sie die Fragmente mit der leuchtenden Oberfläche nach unten auf die Schale und inkubieren Sie die Schale kurz für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation fügen Sie 20 Milliliter Medium mit MEM Alpha-Modifikation sanft an den Seiten der Schale hinzu, die das Nabelschnurgewebe enthält.

Stellen Sie sicher, dass die Explantate nicht aus ihrer Ausrichtung entfernt werden, und fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, den die Gewebeexplantationen während der Inkubation aufsaugen. Dann legen Sie das Gericht für drei Tage in den Inkubator. Fügen Sie nach dem Ende der Inkubation frisches Medium in die Kultur ein und stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.

Entfernen Sie nach einer Woche mit sterilen Pinzetten die Gewebefragmente einzeln und entsorgen Sie sie mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle vier Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichenNachdem Sie die Zellen wie im Manuskript beschrieben gefärbt haben, analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 CD90-positiven und CD105-CD73-positiven Zellen.

Analysieren Sie CD105-positive und CD34-CD45-negative Zellen separat. Beschichten Sie die Gewebekulturplatte mit 0,01% Kollagen und 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS und legen Sie sie für mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur auf die Wippe. Entfernen Sie nach der Inkubation das Kollagen und waschen Sie die Platte mit PBS, dann die uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter im Wachstumsmedium.

Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70% erreicht haben, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturplatte zweimal mit PBS ab. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu und analysieren Sie uMSCs auf die Expression von pax7, MyoD, Myogenin und myosin heavy chain an zwei Tagen, vier bis fünf Tagen, sechs bis sieben Tagen bzw. zehn bis vierzehn Tagen. uMSCs zeigen den Ausdruck CD105 und CD90 an und exprimieren keine hämatopoetischen Marker CD34 und CD45.

Die uMSCs waren auch positiv für die Expression des uMSCs-Markers CD73, was darauf hindeutet, dass die uMSCs mehrere Schlüsselmarker exprimierten. uMSCs zeigten eine Expression von pax7 innerhalb der ersten zwei Tage nach der Zugabe von M1, gefolgt von einer MyoD-Expression innerhalb der ersten vier Tage nach der M1-Addition. Die Zellen exprimieren das Myogeninprotein nach sechs Tagen der Differenzierung, gefolgt von der Expression der Myosin-schweren Kette zwischen 10 Tagen und 14 Tagen nach der Induktion der Differenzierung.

970 Gene wurden als Reaktion auf die Induktion der myogenen Differenzierung im Vergleich zu den undifferenzierten uMSCs hochreguliert. Mehr myogene Gene wurden in aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs im Vergleich zu aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs hochreguliert. Sowohl das Nabelschnurgewebe als auch das Nabelschnurblut zeigten eine Regulierung von Genen, die mit zytoskelettalen Proteinen verwandt sind, die mit der Aktinbindung und Sarkomerassemblierung assoziiert sind, Transporter, die mit kontraktiler Funktion, Muskelmasseerhaltung, Kalziumsignalisierung und enzymatischer Funktion assoziiert sind.

Sammeln Sie das Gewebe unter aseptischem Zustand und pflegen Sie eine sterile Kultur. Die Schnur sollte extern mit 70% Ethanol gefegt und so schnell wie möglich verarbeitet werden. Viele regenerative Therapien erfordern eine große Anzahl von Zellen aus frühen Passagen.

Es kann auch als Modell verwendet werden, um die gesamte trockene Umgebung nachzuahmen und den postnatalen Stoffwechsel widerzuspiegeln.