Name: Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie. Diese Methode gewährleistet hohe Zellviabilität bei minimaler endothelialer Kontamination.

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Wir danken Herrn Ojas Tikoo für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten und der Videoproduktion. Wir danken auch für die Hilfe der Mitarbeiter von GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), Krankenschwestern und leitenden Forschungsbeamten am Gurugram Civil Hospital und Dr. Pallavi Kshetrapal für Hilfe bei der Logistik. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, die Suchitra Gopinath vom Department of Biotechnology, Indien, gewährt wurden (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Die Verwendung von Nabelschnurgewebe in dieser Studie wurde vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), dem Institutional Ethics Committee, dem Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), dem Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana, und dem Institutional Biosafety Committee, THSTI, genehmigt. Menschliche Nabelschnurgewebeproben wurden aus Terminlieferungen zum Zeitpunkt der Geburt entnommen. Von den Probanden wurde eine informierte schriftliche Zustimmung eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
1. Isolierung von MSCs aus Nabelschnurgewebe
<ol><li>Zum Zeitpunkt der Lieferung schneiden Sie mindestens 5 cm Schnur, vorzugsweise näher an der Plazenta, und sterilisieren Sie die Schnur, indem Sie die äußere Oberfläche mit 70% Ethanol abtupfen. Übertragen Sie das Stück Nabelschnurgewebe nacheinander von einem 50-ml-Sammelröhrchen, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält, zu einem anderen, das dasselbe enthält. Transportieren Sie das Sammelrohr mit dem Namen des Probanden auf Eis innerhalb von 1 Stunde ins Labor. HINWEIS: Bei einer größeren Studie kann es sinnvoll sein, die Proben mit einem Barcode zu versehen, um ihre Verfolgung während der gesamten Studie zu ermöglichen. Wichtig ist, dass allen Mitarbeitern, die mit menschlichem Gewebe umgehen, das vollständige Regime des Hepatitis-B-Impfstoffs angeboten wird.</li>
	<li>Schalten Sie im Labor das UV für 25 Minuten in der BSL-2-Haube ein, um autoklavierte Instrumente und Pipetten vor dem Gebrauch zu sterilisieren.</li>
	<li>Überführen Sie das Schnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 cm 2 große mit Gewebekultur behandelte Schale, die PBS enthält, das mit 5 g/L Glukose, 50 μg/ml Gentamicin,2,5 μg/ml Amphotericin B, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin angereichert ist (schematisch in Abbildung 1).</li>
	<li>Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seiner Längsachse auf, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Aufgrund der Nabelschnurtorsion und der Schleimhautoberfläche das Gewebe mit einer Pinzette in der anderen Hand festnageln.</li>
	<li>Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und die Vene und entfernen Sie die Blutgefäße, indem Sie sie mit einem Skalpell in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen. Spülen Sie das Nabelschnurgewebe noch einmal in PBS, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Abkratzen schonend ist, um die Integrität der Zellen in der WJ, die die Gefäße umgibt, zu erhalten.</li>
	<li>Zerkleinern Sie jede Hälfte des Schnurgewebes in 0,5 cm3 große Fragmente und legen Sie die Fragmente mit der luminalen Oberfläche nach unten auf die Schale. Brüten Sie die Schale kurz für 10 min in einer 37 °C befeuchteten Kammer, die 5% CO2 enthält.</li>
	<li>Nach der Inkubation die Schale mit den Nabelschnurgewebestücken mit 20 ml Medium, das MEM Alpha Modification ohne L-Glutamin, Ribo- und Desoxyribonukleoside, 15% fetales Rinderserum (nicht hitzeinaktiviert) und 50 μg/ml Gentamycin enthält, überfluten. Fügen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig an den Seiten hinzu, um zu verhindern, dass sich die Gewebeexplantationen von ihrer Orientierung lösen. Fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, der während der Inkubation von den Gewebeexplantaten aufgesaugt wird.</li>
	<li>Nach 3 Tagen Inkubation frischen Medium zu den Kulturen hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.</li>
	<li>Nach 1 Woche die Gewebefragmente einzeln mit steriler Pinzette entfernen und mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung entsorgen. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 ml frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle 4 Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichen. HINWEIS: Es ist wahrscheinlich, dass die Zellen nicht gleichmäßig in der Schale verteilt sind, da es einzelne proliferative Kolonien geben wird, die mit der Zeit auf Zusammenfluss überwacht werden müssen. Im Allgemeinen erzeugt eine 10 cm 2 große Schale innerhalb eines Monats genügend Zellen, um in eine separateSchale aufgeteilt zu werden.</li>
	<li>Ernten Sie die adhärenten Zellen mit Trypsin / EDTA-Lösung (1x 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Die Zellsuspension bei 470 × g für 5 min bei 25 °C zentrifugieren und das Zellpellet in Wachstumsmedium resuspendieren.</li>
</ol>2. Immunphänotypisierung und Ausbreitung von uMSCS
<ol><li>Fahren Sie mit der Immunphänotypisierung fort, sobald die adhärenten Zellen einen Zusammenfluss von 50% -60% erreicht haben und gut verteilt sind. Führen Sie keine MSC-Markeranalyse für vollständig konfluente Kulturen durch, da dies tendenziell zu einer Herunterregulierung der wichtigsten MSC-Marker führt.</li>
	<li>Nach der Trypsinisierung eine Zellsuspension von 1 × 106 Zellen/ml in FACS-Röhrchen (1 × 105 Zellen/Röhrchen) verteilen und mit geeigneten fluorophorgebundenen Antikörpern (alle 1:50-Verdünnung) in Kombination anfärben: ungefärbt; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (gewöhnlicher Fluorophor); Isotypkontrollen für jedes Fluorophor. Zeichnen Sie eine Gesamtzahl von Ereignissen von mindestens 10.000 auf dem Durchflusszytometer zur weiteren Analyse auf. HINWEIS: Da die Zellen für jeden Oberflächenmarker separat analysiert werden, ist kein Gating auf Zellteilmengen erforderlich.</li>
	<li>Zusätzlich zu den oben genannten Markern ist das Vorhandensein positiver und negativer Oberflächenmarker in uMSC-Linien zu bestätigen, die aus einzelnen Nabelschnurgewebeproben erstellt wurden (Tabelle 1).</li>
	<li>Analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 + CD90 + - und CD105 + CD73 + -Zellen. Analysieren Sie CD105+ und CD34−CD45− Zellen separat.</li>
</ol>3. Differenzierung von uMSCs in Skelettmuskulatur
<ol><li>Beschichten Sie Gewebekulturplatten mit 0,01% Kollagen und 20 μg/ml Laminin in PBS. Beschichten Sie diese Platten für mindestens 4 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Platte uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2 in Wachstumsmedium.</li>
	<li>Wenn die Zellen zu 70% konfluent sind, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturen 2x mit PBS aus. Fügen Sie den uMSCs myogenes Differenzierungsmedium (M1) hinzu, das aus DMEM + 5% Pferdeserum + 0,1 μM Dexamethason + 50 μM Hydrocortison besteht. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu.</li>
	<li>Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, analysieren Sie uMSCs für Pax7, MyoD, Myogenin und MyHC-Expression nach 2 Tagen, 4-5 Tagen, 6-7 Tagen bzw. 10-14 Tagen.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Kritische Schritte Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von Gewebe unter aseptischen Bedingungen, vom Zeitpunkt der Lieferung bis zur Aufrechterhaltung steriler Kulturen, für die gesamte Dauer der Vermehrung. Während der Schnursammlung ist es wichtig, dass die Schnur keine nicht sterilisierte Oberfläche berührt und extern mit 70% Ethanol abgewischt wird, bevor sie in mit Antibiotika ergänzten Röhrchen, die PBS enthalten, gesammelt wird. Es ist wichtig, die Zeit zwischen der Nabe...

Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforschtwerden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst - die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)2. Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzenaufweisen 3. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur. 
In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs 3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCsberichtet 6.
Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeitenaufweisen 6. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotische Lösung 100x Flüssigkeit, Endotoxin getestet (10.000 U Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml in 0,9 % normaler Kochsalzlösung)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50 ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH-Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC-Antikörper (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD-Antikörper (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myogenin-Antikörper (Klon F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pax7-Antikörper</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC-Maus Anti-Human-CD90-Klon 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II oder FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert Brasilien</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>nicht hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD106-Klon 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD14 Klon M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD31 Klon WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD34 Klon 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD45 Klon HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD49D Klon 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch CD90 Klon 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch HLA-A,B,C Klon G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Mensch IgG-Klon G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modifikation ohne L-Glutamin, Ribo- und Desoxyribonukleoside</td><td>Hyclone</td><td>SH30568. FS</td><td>Basalmedium für uMSCs</td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Mensch CD105 Klon 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Mensch CD44 Klon 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Mensch CD49E Klon llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Mensch IgG-Klon G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Maus Anti-Mensch CD73 CLONE AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH=7,4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA-Lösung (1x 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100 ml</td><td></td></tr></tbody></table>

gewinnung mesenchymaler stammzellen aus menschlichem nabelschnurgewebe und deren differenzierung in die skelettmuskellinie

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Die Erforschung des therapeutischen Potenzials mesenchymaler Stammzellen hängt von der Leichtigkeit der Isolierung, der Potenz zur Differenzierung und der Zuverlässigkeit und Robustheit der Quelle ab. Wir beschreiben hier ein schrittweises Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe (uMSCs), deren Immunphänotypisierung und die Ausbreitung solcher Kulturen über mehrere Passagen. Bei diesem Verfahren ist die Lebensfähigkeit der uMSCs hoch, da keine enzymatische Verdauung stattfindet. Darüber hinaus stellt die Entfernung von Blutgefäßen, einschließlich der Nabelschnurarterien und der Vene, sicher, dass es keine Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs gibt. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie sind uMSCs bei der Isolierung CD45−CD34−, was auf eine Abwesenheit von Zellen aus der hämatopoetischen Linie hinweist. Wichtig ist, dass sie die Tastenoberflächenmarkierungen CD105, CD90 und CD73 ausdrücken. Nach der Etablierung von Kulturen beschreibt dieses Papier eine effiziente Methode, um die Differenzierung dieser uMSCs in die Skelettmuskellinie zu induzieren. Eine detaillierte Analyse der myogenen Progression in differenzierten uMSCs zeigt, dass uMSCs Pax7 exprimieren, einen Marker für myogene Vorläufer in den Anfangsstadien der Differenzierung, gefolgt von der Expression von MyoD und Myf5 und schließlich einem terminalen Differenzierungsmarker, Myosin Heavy Chain (MyHC).

Der Erfolg der Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beträgt &gt;95%, im Gegensatz zu den schlechten Erfolgsraten von Nabelschnurblut. Nach erfolgreicher Isolierung von uMSCs zeigt die FACS-Analyse, dass alle Zellen CD34−CD45−CD105+CD90+ sind. In der vergleichenden Analyse zeigen uMSCs, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, jedoch heterogene Populationen, wobei ein Teil der Zellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) aufweist. Darüber hinaus si...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.

Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Wir beschreiben unser Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und eine robuste Methode, um sie in die Skelettmuskellinie zu differenzieren. Diese Technik ermöglicht es uns, mesenchymale Stammzellen mit hoher Lebensfähigkeit und Wärme zu isolieren, mit wenig bis gar keiner Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs und die myogene Differenzierung bei diesen Krankheiten effizient zu induzieren. Kordeltorsion und Schleimhautkonsistenz erschweren die Handhabung der Schnur.Wir zeigen, wie man die Schnur verarbeitet, um das Wharton-Gelee nicht abzukratzen und Endothelzellen aus der Population auszuschließen. Nachdem Sie das Nabelschnurgewebe zur Lieferzeit gesammelt haben, geben Sie das Nabelschnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 Quadratzentimeter große mit Gewebekultur behandelte Schale und waschen Sie das Gewebe gründlich mit frischem PBS. Um die Nabelschnurtorsion und die Schleimhautoberfläche zu pflegen, stecken Sie das Gewebe mit einer Pinzette in einer Hand fest.Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seines Längszugangs, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und Venen. Entfernen Sie mit einem Skalpell die Blutgefäße, indem Sie sie in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen und das Nabelschnurgewebe in PBS spülen, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen.Zerkleinern Sie jede Hälfte des Nabelschnurgewebes in 0,5 Kubikzentimeter große Fragmente. Legen Sie die Fragmente mit der leuchtenden Oberfläche nach unten auf die Schale und inkubieren Sie die Schale kurz für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation fügen Sie 20 Milliliter Medium mit MEM Alpha-Modifikation sanft an den Seiten der Schale hinzu, die das Nabelschnurgewebe enthält.Stellen Sie sicher, dass die Explantate nicht aus ihrer Ausrichtung entfernt werden, und fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, den die Gewebeexplantationen während der Inkubation aufsaugen. Dann legen Sie das Gericht für drei Tage in den Inkubator. Fügen Sie nach dem Ende der Inkubation frisches Medium in die Kultur ein und stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.Entfernen Sie nach einer Woche mit sterilen Pinzetten die Gewebefragmente einzeln und entsorgen Sie sie mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle vier Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichenNachdem Sie die Zellen wie im Manuskript beschrieben gefärbt haben, analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 CD90-positiven und CD105-CD73-positiven Zellen.Analysieren Sie CD105-positive und CD34-CD45-negative Zellen separat. Beschichten Sie die Gewebekulturplatte mit 0,01% Kollagen und 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS und legen Sie sie für mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur auf die Wippe. Entfernen Sie nach der Inkubation das Kollagen und waschen Sie die Platte mit PBS, dann die uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter im Wachstumsmedium.Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70% erreicht haben, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturplatte zweimal mit PBS ab. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu und analysieren Sie uMSCs auf die Expression von pax7, MyoD, Myogenin und myosin heavy chain an zwei Tagen, vier bis fünf Tagen, sechs bis sieben Tagen bzw. zehn bis vierzehn Tagen. uMSCs zeigen den Ausdruck CD105 und CD90 an und exprimieren keine hämatopoetischen Marker CD34 und CD45.Die uMSCs waren auch positiv für die Expression des uMSCs-Markers CD73, was darauf hindeutet, dass die uMSCs mehrere Schlüsselmarker exprimierten. uMSCs zeigten eine Expression von pax7 innerhalb der ersten zwei Tage nach der Zugabe von M1, gefolgt von einer MyoD-Expression innerhalb der ersten vier Tage nach der M1-Addition. Die Zellen exprimieren das Myogeninprotein nach sechs Tagen der Differenzierung, gefolgt von der Expression der Myosin-schweren Kette zwischen 10 Tagen und 14 Tagen nach der Induktion der Differenzierung.970 Gene wurden als Reaktion auf die Induktion der myogenen Differenzierung im Vergleich zu den undifferenzierten uMSCs hochreguliert. Mehr myogene Gene wurden in aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs im Vergleich zu aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs hochreguliert. Sowohl das Nabelschnurgewebe als auch das Nabelschnurblut zeigten eine Regulierung von Genen, die mit zytoskelettalen Proteinen verwandt sind, die mit der Aktinbindung und Sarkomerassemblierung assoziiert sind, Transporter, die mit kontraktiler Funktion, Muskelmasseerhaltung, Kalziumsignalisierung und enzymatischer Funktion assoziiert sind.Sammeln Sie das Gewebe unter aseptischem Zustand und pflegen Sie eine sterile Kultur. Die Schnur sollte extern mit 70% Ethanol gefegt und so schnell wie möglich verarbeitet werden. Viele regenerative Therapien erfordern eine große Anzahl von Zellen aus frühen Passagen.Es kann auch als Modell verwendet werden, um die gesamte trockene Umgebung nachzuahmen und den postnatalen Stoffwechsel widerzuspiegeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Isolating adulten Stammzellen aus Muskel-Skelett Weichteile auf der Grundlage der Zelle Einhaltung Geschwindigkeit Kolben.

Isolating Stammzellen aus Soft-Gewebe des Bewegungsapparates

Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Erfahren Sie die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie. Diese Methode gewährleistet hohe Zellviabilität bei minimaler endothelialer Kontamination.

Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

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