Name: Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs mit 3D-Skelettmuskelgewebe und motorischen Neuronen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Quantifizierung neuromuskulärer Verbindungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken der Finanzierung durch das NIH [Fördernummern EB025765 und EB027062], das DOD [Vergabenummer W81XWH-18-1-0095] und die UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Wir danken dem Stammzellkern der Columbia University für seine Hilfe und Anleitung bei der Zellumprogrammierung.

Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet.
1. Vorbereitung des Bioreaktors
<ol><li>Bioreaktorformen herstellen<ol>
<li>Laden Sie eine Bioreaktor-CAD-Datei aus der ergänzenden CAD-Datei herunter oder erstellen Sie ein benutzerdefiniertes eigenes Design.</li>
		<li>Generieren Sie mit der CAM-Software einen CNC-Werkzeugweg aus dem 3D-Modell.</li>
		<li>Bearbeiten Sie Acetalformen mit einer CNC-Fräsmaschine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Bioreaktoren<ol>
<li>Mischen Sie eine 10:1-Base zu einem Härtergemisch aus Polydimethylsiloxan (PDMS, 77 g Mischung pro 4 Plattformen/Formen).</li>
		<li>Legen Sie das Gemisch in eine Vakuumkammer, schließen Sie alle Ventile, schalten Sie das Vakuum ein und entgasen Sie das Gemisch für mindestens 30 Minuten, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Gießen Sie das Gemisch in Formen und entgasen Sie die Formen in der Vakuumkammer für 1 h.</li>
		<li>Schließen Sie die Formen mit der oberen Hälfte der Form in der richtigen Ausrichtung. Legen Sie eine sechseckige Stahlstange über die Mitte und klemmen Sie sie auf beiden Seiten.</li>
		<li>Füllen Sie die Oberseite mit PDMS auf.</li>
		<li>Die Schimmelpilze in einem 65 °C Ofen für mindestens 4 h aushärten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Plattformen aus den Formen, nachdem Sie auf Raumtemperatur abgekühlt sind.</li>
		<li>Reinigen Sie die Geräte in einem Ultraschallbad mit 1-stündigen Zyklen Spülmittel, 400 ml 100% Isopropanol und destilliertem Wasser.</li>
		<li>Über Nacht bei 65 °C trocknen.</li>
		<li>Glasabdeckungen 30 min in 1% nichtionischem Tensidpolyol einweichen und sicherstellen, dass sich die Deckgläser nicht stapeln, damit sie alle ordnungsgemäß beschichtet sind.</li>
		<li>Mit destilliertem Wasser gut abspülen und über Nacht bei 65 °C trocknen.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Plasmareiniger auf hoher Höhe mit 6 l / min Sauerstoff für 1-2 Minuten, um Glasabdeckungen und PDMS-Plattform zu behandeln. Nach der Behandlung verbinden Sie die beiden miteinander, indem Sie das PDMS mindestens 30 Sekunden lang auf das Deckglas drücken.</li>
		<li>Autoklavieren Sie die gebundenen Geräte, bevor Sie Zellen hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Aufbau eines optischen Stimulations-Setups
<ol><li>Befestigen Sie mit einem 30-mm-Käfigwürfelsystem einen dichroitischen 573-nm-Spiegel in der Mitte. Kombinieren Sie eine rote 627-nm-LED mit einem 594-nm-Longpass-Erregungsfilter und befestigen Sie sie an der Oberseite des Würfels, wobei die LED dem Spiegel zugewandt ist. Befestigen Sie dann eine blaue 488-nm-LED mit einem 546-nm-Kurzpass-Erregungsfilter an der angrenzenden Seite des Würfels, wobei die LED dem Spiegel zugewandt ist, wie im Schaltplan in Abbildung 3A dargestellt.</li>
	<li>Befestigen Sie eine ringbetätigte Irismembran an der Unterseite des Käfigwürfels, um die Größe der beleuchteten Fläche zu steuern.</li>
	<li>Versorgen Sie jede LED über einen T-Cube-LED-Treiber mit Strom und steuern Sie sie über ein Arduino Uno Rev3-Board. Schließen Sie den seitlichen Eingang des LED-Treibers an einen Stromquellenstecker an, schließen Sie den mittleren Ausgang an den Arduino an und schließen Sie den seitlichen Ausgang direkt an die LEDs an.</li>
	<li>Verbinden Sie den Arduino Uno über ein USB-Kabel mit einem PC.</li>
	<li>Laden Sie Dateien vom GitHub-Link (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) herunter.</li>
	<li>Öffnen Sie die Datei "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" aus dem Ordner GitHub.</li>
	<li>Startparameter festlegen: Schritte = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Pinausgang 4 dem blauen LED-Treiber und der Pinausgang 2 dem roten LED-Treiber zugewiesen ist. Überprüfen Sie, ob die mittleren Drähte des LED-Treibers mit der Masse und dem jeweiligen Pin-Ausgang verbunden sind.</li>
	<li>Kompilieren und laden Sie das Programm "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" nach Arduino.</li>
	<li>Schließen Sie jeden LED-Treiber an den entsprechenden Kanal an.</li>
</ol>3. Aufbau der Zellkultur (Tag -21-0)
<ol><li>Primäre Skelettmuskelzellen<ol>
<li>Auftauen und erweitern Sie primäre Skelettmyoblasten (erhalten aus Cook Myosite) für maximal sechs Passagen mit myotonem Wachstumsmedium (+ Ergänzung). Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist.</li>
		<li>Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.</li>
		<li>Sobald die Zellen zu etwa 60% konfluent sind, passieren Sie sie mit 0,05% Trypsin-EDTA (1x, für 5 min bei 37 °C). Sammeln Sie die dissoziierten Zellen und fügen Sie frische Medien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen mit 300 x g nach unten und saugen Sie den Überstand über dem Zellpellet ab.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit MGM und Samen 1:3 mit 60 ml pro Dreischichtkolben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ChR2-hiPSC HINWEIS: Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet. In diesem Protokoll wurden ChR2-exprimierende HiPS-Zellen durch CRISPR-Cas9-Genom-Editierung unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden18 erzeugt, aber alle stabilen optogenetischen Zelllinien (lentiviral, piggyBac usw.) können auf die gleiche Weise verwendet werden. Konstitutive Promotoren, die sowohl in iPSCs als auch in Motoneuronen exprimiert werden, wurden ausgewählt (CAG). Es wurde festgestellt, dass die Zellen einen gesunden Karyotyp aufweisen, wie in früheren Veröffentlichungen18,19 erwähnt.<ol>
<li>Beschichten Sie 6-Well-Platten mit 1 ml/Well solubilisierter Basalmembranmatrix, verdünnt in DMEM/F12 (1:80) und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
		<li>Saatierung von iPSCs auf beschichteten 6-Well-Platten mit 2 ml feederfreiem Zellkulturmedium (iPSC-Medien), Austausch von 2 ml Medien jeden zweiten Tag und Durchgang alle 5-7 Tage. Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist.</li>
		<li>Weitergabe<ol>
<li>Dissoziieren Sie die Stammzellen, indem Sie mit 1 ml enzymfreiem Stammzellfreisetzungsreagenz für 4 min inkubieren und mechanisch mit einer breiten P1000-Pipette scheren.</li>
			<li>Samenzellen im Verhältnis 1:24 oder 1:48 in iPSC-Medien mit 2 μM Y-27632-Dihydrochlorid in 2 ml/Well auf beschichteten 6-Well-Platten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Skelettmuskelgewebe-Seeding (Tag -3)
<ol><li>Isolieren und zählen Sie 30 x 106 Myoblasten mit einem automatisierten Zellzähler.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Myoblasten in einer 4: 1-Mischung aus 3 mg / ml Kollagen I und gelöster Basalmembranmatrix (800 μL Kollagenmischung + 200 μL Basalmembranmatrix, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen). Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel (9:1-Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) hinzu und verdünnen Sie die Mischung mit 1x PBS, um ein Volumen von 800 μL zu erreichen.</li>
	<li>Fügen Sie 15 μL Zell-Kollagen-Suspension zu jeder Muskelkammer des Bioreaktors hinzu und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen (Abbildung 2).</li>
	<li>Lassen Sie das Zell-Gel-Gemisch bei 37 °C für 30 min polymerisieren und füllen Sie dann jeden Bioreaktor gut mit 450 μL myotonen Wachstumsmedien.</li>
	<li>Nach 3 Tagen (sobald sich das Gel verdichtet hat) beginnt die Myotube-Differenzierung.</li>
</ol>5. Myotube-Differenzierung (Tage 0-14)
<ol><li>Beginnen Sie mit der Myotube-Infusion, indem Sie das Gewebe für 7 Tage auf 450 μL fusionsinduzierende Medien (FS, Tabelle 1) umstellen und das Medium jeden zweiten Tag wechseln. HINWEIS: Versuchen Sie, die Myotube-Differenzierung am selben Tag wie die Motoneuron-Differenzierung von hiPSCs zu beginnen, um Motoneuronen am Ende der Differenzierungspläne beider Zelltypen zu säen.</li>
	<li>Am Tag 7 wechseln Sie das Medium auf 450 μL Reifungsmedium Ia (MMIa, Tabelle 1).</li>
	<li>Wechseln Sie am 9. Tag auf 450 μL Reifungsmedium Ib (MMIb, Tabelle 1).</li>
	<li>Wechseln Sie am 11. Tag auf 450 μL NbActiv4. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis die Motoneuronen ausgesät sind (Schritt 7).</li>
</ol>6. Motoneuron-Differenzierung (Tage 0-14)
HINWEIS: Unser Motoneuron-Differenzierungsprotokoll wurde von Maury et al8 übernommen.
<ol><li>Übertragen Sie am 0. Tag 4 x 106 ChR2-hiPSCs in eine Petrischale mit extrem niedriger Befestigung und 15 ml Motoneuron-Suspensionskulturmedium (MSCM, Tabelle 1). Ergänzen Sie MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 5 μM Y-27632 Dihydrochlorid.</li>
	<li>Isolieren Sie an Tag 2 die Neurosphären (NS) mit einem 37 μM reversiblen Sieb und einer Neuplatte in 15 ml MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 0,1 μM Retinsäure. NS sollte nach Tag 2 ohne Verwendung eines Mikroskops in der Petrischale sichtbar sein.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen und Medien an Tag 4 in eine 50-ml-Röhre und lassen Sie die Neurosphären auf dem Boden absetzen (5 min). Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 und 0,1 μM Retinsäure.</li>
	<li>Wiederholen Sie an Tag 7 Schritt 6.3. aber die Zellen in 15 ml MSCM resuspendieren, ergänzt mit 0,5 μM SAG und 0,1 μM Retinsäure.</li>
	<li>Wiederholen Sie an Tag 9 Schritt 6.3. aber resuspendierte Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 10 μM DAPT.</li>
	<li>Wiederholen Sie an Tag 11 Schritt 6.3. aber resuspendieren die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 20 ng / ml BDNF und 10 ng / ml GDNF.</li>
	<li>Samen Sie am 14. Tag die Motoneuronen in die Plattform.</li>
</ol>7. Aussaat von Motoneuronenaggregaten im Bioreaktor (Tag 14)
<ol><li>Bereiten Sie eine 4:1-Gelmischung aus 2 mg/ml Kollagen I und Matrigel (800 μL Kollagenmischung + 200 μL Matrigel zu einem Endvolumen von 1 ml) vor. Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel (9:1-Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) hinzu und verdünnen Sie das Gemisch mit 1x PBS, um ein Endvolumen von 800 μL zu erreichen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein 400-nm-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und in der Gelmischung zu resuspendieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medien aus dem Reservoir und vorsichtig aus der Neurosphärenvertiefung (Abbildung 2).</li>
	<li>Fügen Sie 15 μL Gelmischung in den Neurosphärenkanal hinzu.</li>
	<li>Laden Sie eine 10 μL Pipette mit 10 μL Gel und wählen Sie dann eine Neurosphäre.</li>
	<li>Deponieren Sie die NS in den Neurosphärenkanal und stellen Sie sicher, dass sich die NS in der Kammer befindet. Heben Sie die Pipette langsam an, während Sie das verbleibende Gel freisetzen, sobald das NS abgeschieden ist. Wenn Sie nicht sicher sind, ob der NS korrekt hinterlegt wurde, überprüfen Sie seinen Standort mit einem Mikroskop.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel 30 min bei 37 °C polymerisieren.</li>
	<li>450 μL NbActiv4 ergänzt mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/mL GDNF in die Reservoirs geben.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, um ein axonales Wachstum von NS zu Muskelgewebe zu ermöglichen.</li>
</ol>8. Gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung der NMJ-Funktion (Tag 24+)
<ol><li>Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiter-Kamera (sCMOS).</li>
	<li>Stellen Sie das Binning der Kamerasoftware auf 2x2, die Belichtung auf 20 ms, den Rolling-Shutter-EIN, die Ausleserate auf 540 MHz, den Dynamikbereich: 12-Bit & Gain 1 und den Sensormodus: Überlappung.</li>
	<li>Verwenden Sie ein 2-faches Objektiv auf dem Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden.</li>
	<li>Befestigen Sie eine Lebendzellkammer (37 °C, 5% CO2) an der Mikroskopstufe.</li>
	<li>Wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren.</li>
	<li>Platzieren Sie einen 594-nm-Langpass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem abbildenden Objektiv, um blaue Lichtimpulse aus der Kamera herauszufiltern.</li>
	<li>Legen Sie eine rechteckige 4-Well-Platte mit 4 Bioreaktoren (24 Gewebe) in die Lebendzellkammer.</li>
	<li>Klicken Sie auf Live-Ansicht. Zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI.</li>
	<li>Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) hoch, um die Bühnenposition, das Arduino-Board und die Videoaufnahme zu steuern.</li>
	<li>Legen Sie den Ausgabefilm wie folgt fest: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.</li>
	<li>Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten X,Y-Koordinaten auf der Bühne aus und erfassen Sie einen schnellen Zeitraffer mit 1700 Bildern bei 50 Bildern/s.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium nach der Bildgebung und bringen Sie die Proben zurück in den Inkubator. Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Bildaufnahmesitzungen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden.</li>
</ol>9. Stapelverarbeitung und Analyse (Tag 24+)
<ol><li>Filmverarbeitung<ol>
<li>Verwenden Sie den benutzerdefinierten MATLAB-Code, um die Videos in der Batch-Analyse zu verarbeiten. Die Dateien können aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) heruntergeladen werden. Die Funktionen sind in Tabelle 2 aufgelistet und erläutert. HINWEIS: Der Code ist mit den Formaten .nd2 und .czi kompatibel. Es erfordert die parallele Verarbeitung, die in MATLAB aktiviert werden muss, und benötigt das Bioformatpaket.</li>
		<li>Führen Sie das Skript recursiveOSAnalysis aus, um die Filme durch parallele Verarbeitung zu analysieren. Halten Sie alle erworbenen Videos im selben Ordner und wählen Sie diesen Ordner aus, wenn Sie den Code ausführen.</li>
		<li>Passen Sie die Parameter nach der Analyse nach Bedarf an.<ol>
<li>Ändern Sie baselineTime (Option 1), wenn zu Beginn der Aufzeichnung eine spontane Kontraktion aufgenommen wird. Dies zeigt einen anfänglichen Messwert weit über 0 an und erfordert, dass der Frame verschoben wird, um dies zu kompensieren.</li>
			<li>Ändern Sie peakThreshold (Option 2), wenn die Kontraktionen nicht registriert werden. Der Code erkennt standardmäßig Kontraktionen, die über 25 % des höchsten Peaks liegen, sodass dieser Wert geändert werden kann.</li>
			<li>Ändern Sie minMinProminence und minMinWidth , um die Empfindlichkeit anzupassen, wenn der Beginn jedes Peaks erkannt wird.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Generieren Sie Video- und Diagrammausgaben.<ol>
<li>Führen Sie recursiveOSMovie aus, um für jedes Gewebe eine Videodatei mit seiner jeweiligen Kontraktilitätsspur zu generieren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Störung der NMJ-Funktion (Tag 24+)
<ol><li>Bereiten Sie die Behandlungsmedien vor, indem Sie den Basalmedien von NbActiv4 einen externen Effektor hinzufügen, der mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF ergänzt wird.<ol>
<li>Verwenden Sie für das MG-Sera-Experiment 20% MG-Patientenseren in NbActiv4 + BDNF + GDNF.</li>
		<li>Verwenden Sie für das BTX-Experiment 5 μg / ml BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimulieren/Bild mit Schritt 3.2. , um die Baseline aufzuzeichnen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Medien im Gewebe durch Behandlungsmedien (450 μL/Gewebe).</li>
	<li>Inkubieren für die gewünschte Zeit (48 h für Patientenseren, 20 min für BTX).</li>
	<li>Stimulieren/Bild erneut mit Schritt 3.2. um die Funktion nach der Behandlung aufzuzeichnen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Behandlungsmedien und lassen Sie das Gewebe für die gewünschte Zeit ruhen (48 h nach Serenentfernung) HINWEIS: Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen Stimulation und Bildgebung, um Gewebeermüdung zu vermeiden</li>
</ol>

<ol><li>Al-bassam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics%2C+incidence%2C+and+outcome+of+patients+admitted+to+the+intensive+care+unit+with+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis.</a> Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).</li>
<li>Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+neuromuscular+junctions+and+their+potential+for+novel+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).</li>
<li>Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+the+neuromuscular+junction%2C+vitally+informative+for+understanding+function+and+the+molecular+mechanisms+of+congenital+myasthenic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326(2018).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+anatomy+of+the+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126(2018).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885(2015).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Bianchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+differentiation+of+functional+motor+neurons+from+human+iPSC+for+neural+injury+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling.</a> Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).</li>
<li>Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+correction+of+disease+mutations+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+patients+with+limb+girdle+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy.</a> Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Lin, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+functional+human+neuromuscular+junctions+model+the+pathophysiology+of+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases.</a> JCI Insight. 4 (18), (2021).</li>
<li>Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+versus+3D+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cultures+for+neurodegenerative+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27(2018).</li>
<li>Okano, T., Matsuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+skeletal+muscle%3A+preparation+of+highly+dense%2C+highly+oriented+hybrid+muscular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues.</a> Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).</li>
<li>Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+improves+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-based+functional+NMJ+system+for+personalized+ALS+modeling+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing.</a> Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133(2020).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+optogenetic+model+of+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction.</a> Biomaterials. 276, 121033(2021).</li>
<li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+under+optogenetic+control+allows+modeling+of+human+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).</li>
<li>Santhanam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+phenotypic+human+neuromuscular+junction+model+for+dose+response+evaluation+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics.</a> Biomaterials. 166, 64-78 (2018).</li>
<li>Phillips Ii, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of myasthenia gravis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).</li>
<li>Sanders, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+change+in+acetylcholine+receptor+antibody+level+correlate+with+clinical+change+in+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis.</a> Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).</li>
<li>Vernino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+enigma+of+seronegative+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis.</a> JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. , (2018).</li>
<li>Paredes-Redondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modeling+of+human+neuromuscular+circuits+in+Duchenne+muscular+dystrophy+with+CRISPR+and+pharmacological+corrections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections.</a> Science Advances. 7 (37), (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Dieses System ist ein entwickeltes 3D-Modell für menschliches Gewebe, das Optogenetik und Videoverarbeitung kombiniert, um eine automatisierte und unvoreingenommene Bewertung der NMJ-Funktion zu ermöglichen. Mit einem standardisierten Protokoll haben wir die Fähigkeit nachgewiesen, Veränderungen der NMJ-Funktion während der physiologischen Entwicklung zu messen und die schädlichen Auswirkungen von Pathologien wie Neurotoxinexposition und Myasthenia gravis Patientenseren zu charakterisieren.
Fr...

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die chemische Synapse zwischen Motoneuronen (MNs) und Skelettmuskelzellen (SkM), die eine Muskelkontraktion ermöglicht. Toxine wie Neurotoxin α-Bungarotoxin (BTX) oder neuromuskuläre Erkrankungen (NMD) wie Myasthenia gravis (MG) können zu einer Degeneration des NMJ und einer Verringerung der Muskelkontrolleführen 1. Biotechnologisch hergestellte menschliche Gewebemodelle rekapitulieren die funktionellen und physiologischen Mechanismen menschlicher NMJs besser und bieten ein größeres translationales Potenzial als Tiermodelle.
Während Tiermodelle das Verständnis der Bildung und Funktion des NMJ vorangebracht haben, gibt es signifikante Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Synapsen, die die Übersetzung der Ergebnisse auf den Menschen beschränken und die In-vivo-Charakterisierung des NMJ zu einer Herausforderung machen 2,3,4. Studien haben deutliche physiologische Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen NMJs gezeigt. Mäuse haben im Vergleich zu menschlichen NMJs größere NMJs und kleinere aktive Zonendichten4. Darüber hinaus spiegeln Arzneimittelstudien, die in Tiermodellen durchgeführt werden, nicht immer die Wirkungen wider, die in klinischen Studien am Menschen gefunden wurden. Technisch hergestellte menschliche Gewebemodelle bieten die Möglichkeit, die gesunde Entwicklung des NMJ und die Pathologie neuromuskulärer Erkrankungen zu untersuchen und medikamentöse Screenings zu ermöglichen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs)5 können in eine Vielzahl von Zelltypen differenziert werden, einschließlich Skelettmuskelzellen6,7 und Motoneuronen 8,9. hiPS-Zellen können leicht aus Patientenzellen generiert werden, was eine bessere Krankheitsmodellierung 10 und ein Arzneimittelscreening11,12 durch patientenspezifische Gewebemodelle ermöglicht.
Zweidimensionalen (2D) Monolayer-Co-Kulturen von SkMs und MNs fehlen die Morphologie, der Phänotyp, die Organisation und das funktionelle Verhalten physiologischer NMJs. NMJs bilden sich zufällig in einer 2D-Kultur, die die Isolierung motorischer Einheiten für die Analyse hemmt, genaue funktionelle Messungen einschränkt und ihre Verwendung für wiederholte, systematische Experimente verhindert13 . Dreidimensionale (3D) Gewebemodelle von NMJs überwinden viele dieser Einschränkungen und rekapitulieren die morphologischen und funktionellen Eigenschaften physiologischer NMJs 7,14,15,16,17. Unter Verwendung dieses Modells werden die beiden Gewebetypen separat entwickelt und dann integriert, indem das axonale Wachstum gesteuert wird, so dass sich im Vergleich zu 2D-Kultursystemen besser organisierte NMJs entwickeln können.
Unsere frühere Studie zeigte, dass die Kombination von Optogenetik mit Tissue Engineering eine genaue nicht-invasive Stimulation und Bewertung der NMJ-Funktionermöglichen kann 18,19. Durch die Gentechnik können lichtempfindliche Proteine in das Genom von hiPSCs integriert werden. Die Integration von Kanalrhodopsin-2 (ChR2), einem Ionenkanal, der sich als Reaktion auf blaues Licht öffnet, in die Membran erregbarer Zellen wie Neuronen ermöglicht eine berührungslose raumzeitliche Kontrolle über die Zellaktivierung20,21,22. hiPSCs, die ChR2 tragen, können in optogenetische Motoneuronen unterschieden werden, die für blaues Licht empfindlich sind, wodurch die Notwendigkeit typischer invasiver Elektroden, die Neuronen stimulieren, entfällt und eine unerwünschte Stimulation der Muskelzellen durch Elektrodenvermieden wird 23. Dieses System verwendet optogenetische Motoneuronen, um Kontraktionen in nicht-optogenetischen Skelettmuskelzellen zu stimulieren. Durch die Kombination von Videoerfassung und kontrollierter Blaulichtbeleuchtung können die gemeinsam kultivierten Gewebe gleichzeitig stimuliert und für die NMJ-Funktion aufgezeichnet werden.
MG wird durch Autoantikörper verursacht, die auf nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChR) abzielen, was zu einer verminderten NMJ-Funktion und Muskelschwäche führt24. Es wird auf der Grundlage der vorgestellten Symptome, der Elektrodiagnose und des Nachweises von Autoantikörpern durch serologische Bluttests diagnostiziert. Es wurden jedoch nicht alle an MG beteiligten Autoantikörper identifiziert, und bei einigen seronegativen Patienten wird MG diagnostiziert, aber ohne anerkannte Antikörper25,26. Unser System ermöglicht eine wiederholte funktionelle Beurteilung des NMJ vor und nach der Zugabe von Serum von MG-Patienten und liefert unschätzbare Einblicke in die funktionellen und biochemischen Veränderungen, die durch die MG-Antikörper verursachtwerden 18. Unser Protokoll veranschaulicht, wie 3D-In-vitro-Modelle von funktionellem menschlichem NMJ erstellt werden können, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Wir demonstrieren die Vielseitigkeit des Systems in zwei Plattformen, einem mikrofluidischen Gerät und einer größeren Open-Well-Bioreaktorplattform.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SkMDC</td><td>Cook Myosite</td><td>P01059-14M</td><td></td></tr><tr><td>Medien und Nahrungsergänzungsmittel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634-020</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminlösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>G-5 Supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, rekombinante humane</td><td>Millipore Sigma</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>MyoTonic Growth Media</td><td>Kit Koch Myosit</td><td>MK-4444</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NbActiv4 500 mL</td><td>BrainBits LLC</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13710-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm Cage Cube System</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH, CP33, ER1-P4 und ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m Reversibles Sieb, groß</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27250</td><td></td></tr><tr><td>546 nm Kurzpass-Anregungsfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-546/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>573 nm dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF573-Di01&ndash; 25x36</td><td></td></tr><tr><td>594 nm Langpass-Emissionsfilter</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>594 nm Langpass-Anregungsfilter</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>Blau (470nm) Rebel LED auf einem SinkPAD-II 10mm quadratischer Sockel - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carclo 29.8&deg; Frosted 10 mm Circular Beam Optik - Integrierte Beine</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>10413</td><td></td></tr><tr><td>Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Kulturschale</td><td>Corning</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Kühlkörper</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>LPD-19-10B</td><td></td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 400 &micro; m, 25er Pack, steril</td><td>PluriSelect</td><td>43-50400-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 500 &micro; m, 25er Pack, steril</td><td>PluriSelect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>Rote (627nm) Rebel LED auf einem SinkPAD-II 10mm quadratischer Sockel - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-R5</td><td></td></tr><tr><td>ringbetätigte Irisblende</td><td>ThorLabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>T-Cube LED-Treiber</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B, KPS101<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Molds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sechskant-Abstandshalter mit Innengewinde&nbsp; 3 1/2" 10-32, Teilgewinde 1/2"</td> <td>MCMASTER</td><td>91920A046</td><td></td></tr><tr><td>Low-Profile&nbsp; C-Clamp</td><td>McMaster</td><td>1705A12</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 3&prime;,5&prime;-cyclisches Monophosphat</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021, 10 mg</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>DAPT 10 mg</td><td>R& D Systems</td><td>2634/10</td><td></td></tr><tr><td>Human CNTF, Forschungsqualität, 5 & Mikro; g</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-336</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Vitronectin-Protein, CF</td><td>R& D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Vitronektin-Protein, CF</td><td>F& D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 Rekombinantes humanes Protein</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0078</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-Mausprotein, natürliches</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Agrin-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>6624-AG-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes GDNF-Protein, CF 50ug</td><td>R& D Systems</td><td>212-GD-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Neurotrophin 3&nbsp; 100 ug</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRN500D</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human Neurotrophin-4</td><td>Zellwissenschaften</td><td>CRN501B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus</td><td>R& D Systems</td><td>1845-SH-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Mensch/Maus/Ratte BDNF 50 ug</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure, 50 mg</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2625-50</td><td></td></tr><tr><td>SAG Geglätteter Agonist</td><td>Millipore Sigma</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 10 mg</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-103-925</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin aus humanem Plasma</td><td>Millipore Sigma</td><td>V8379-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Actinin mAb (Maus IgG1)</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Cholin-Acetyltransferase (ChAT) (Ziege)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Desmin mAb (Maus IgG1)</td><td>Dako</td><td>M076029-2</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain (MHC) (Maus IgG2b)</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno R3</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Tisch</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MS- 2000 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Expandierter Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001&nbsp;( 115V)</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess Automated Cell Counter</td><td>Marshal</td><td>Scientific I-CACC</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-ILL100LH</td><td></td></tr><tr><td>Serie Stage Top Inkubator System</td><td>Tokai Hit</td><td>STX TOKAI-HIT-STXG</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCOMS Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>ZYLA-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Software (IDE)</td><td>Arduino</td><td>IDE 1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Mastercam</td><td>Mastercam</td><td>Mastercam for Solidworks</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Matlab</td><td>R2021b</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS elements</td><td>Nikon</td><td>Basic Research</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 3D CAD</td><td>Solidworks</td><td>Solidworks Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

engineering und charakterisierung eines optogenetischen modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

Viele neuromuskuläre Erkrankungen, wie Myasthenia gravis (MG), sind mit einer Dysfunktion der neuromuskulären Verbindung (NMJ) verbunden, die in Tiermodellen aufgrund physiologischer Unterschiede zwischen Tieren und Menschen schwer zu charakterisieren ist. Tissue Engineering bietet Möglichkeiten, In-vitro-Modelle funktioneller menschlicher NMJs bereitzustellen, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Durch den Einbau optogenetischer Proteine in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugten wir Neuronen, die mit bestimmten Wellenlängen des Lichts stimuliert werden können. Wenn das NMJ gesund und funktionell ist, führt ein neurochemisches Signal des Motoneurons zu einer Muskelkontraktion. Durch die Integration von Optogenetik und Mikrofabrikation mit Tissue Engineering haben wir eine unvoreingenommene und automatisierte Methodik zur Charakterisierung der NMJ-Funktion mittels Videoanalyse etabliert. Es wurde ein standardisiertes Protokoll für die NMJ-Bildung, die optische Stimulation mit gleichzeitiger Videoaufzeichnung und die Videoanalyse der Gewebekontraktilität entwickelt. Die Stimulation optogenetischer Motoneuronen durch Licht zur Induktion von Kontraktionen der Skelettmuskulatur rekapituliert die menschliche NMJ-Physiologie und ermöglicht wiederholte funktionelle Messungen von NMJ im Laufe der Zeit und als Reaktion auf verschiedene Eingaben. Wir demonstrieren die Fähigkeit dieser Plattform, funktionelle Verbesserungen der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit zu zeigen und die schädlichen Auswirkungen von MG-Antikörpern oder Neurotoxinen von Patienten auf die NMJ-Funktion zu charakterisieren.

Neuromuskuläre Verbindungen wurden durch Kokultivierung optogenetischer HiPSC-abgeleiteter Motoneuronen mit nicht-optogenetischem Skelettmuskelgewebe erzeugt. Menschliche primäre Skelettmyoblasten (SkM) wurden in die Plattformen eingesät und unter Verwendung des 2-Wochen-Protokolls in mehrkernige Myotubes differenziert. Die optogenetischen Motoneuronen wurden separat, aber parallel zur Myotube-Differenzierung, differenziert und dann in die Plattform eingesät (Abbildung 1). Die Gewebe beganne...

Wir beschreiben ein reproduzierbares, automatisiertes und unvoreingenommenes Bildgebungssystem zur Charakterisierung der neuromuskulären Verbindungsfunktion unter Verwendung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und optogenetischen Motoneuronen. Dieses System ermöglicht die funktionelle Quantifizierung der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit und erkennt eine verminderte neuromuskuläre Funktion, die durch Neurotoxine und Myasthenia gravis Patientenserum verursacht wird.

Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie funktionelle 3D-In-vitro-humane neuromuskuläre Verbindungen entwickelt werden können, die zur Untersuchung neuromuskulärer Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Diese Technik verwendet simultane optogenetische Stimulation und Videoverarbeitung. Es sind quantifizierte Veränderungen der neuromuskulären Übergangsfunktion während der Entwicklung und aufgrund externer Faktoren wie Neurotoxine und Serum von Myasthenia gravis-Patienten.Die Schritte, bei denen die Muskelzelle und die Motoneuronenaussaat in den Bioreaktor einfließen, können zunächst eine Herausforderung darstellen. Das Aufbewahren der Kollagengelmischung auf Eis kann dazu beitragen, die Zeit zu verlängern, die zur Verfügung steht, um alle Zellen zu säen, bevor das Gel erstarrt. Beginnen Sie mit dem Mischen einer 10-zu-1-Base-zu-Härter-Mischung aus Polydimethylsiloxan oder PDMS und legen Sie die Mischung in eine Vakuumkammer.Schließen Sie alle Ventile und schalten Sie das Vakuum ein, um das Gemisch für mindestens 30 Minuten zu entgasen, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Gießen Sie die Mischung in Formen und entgasen Sie die Formen in der Vakuumkammer für 1 Stunde, dann schließen Sie die Formen mit der oberen Hälfte der Form in der richtigen Ausrichtung. Legen Sie eine sechseckige Stahlstange über die Mitte und klemmen Sie auf beiden Seiten.Als nächstes füllen Sie die Oberseite mit PDMS auf und härten Sie die Formen in einem 65-Grad-Celsius-Ofen für mindestens 4 Stunden aus. Nachdem die Formen auf Raumtemperatur abgekühlt sind, entfernen Sie die Plattformen von den Formen. In der Zwischenzeit so Glasabdeckungsschlüsse in 1% nichtionischem Tensidpolyol für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass sich die Deckscheine nicht stapeln und alle ordnungsgemäß beschichtet sind, spülen Sie sie dann gut mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie über Nacht bei 65 Grad Celsius.Behandeln Sie die Glasabdeckscheine und die PDMS-Plattform mit einem Plasmareiniger auf hoher Höhe mit 6 Litern pro Minute Sauerstoff für 1 bis 2 Minuten. Nach der Behandlung verbinden Sie die beiden miteinander, indem Sie das PDMS mindestens 30 Sekunden lang auf den Deckzettel drücken. Bereiten Sie eine 4-zu-1-Mischung aus 3 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1 und einer gelösten Basalmembranmatrix vor und resuspendieren Sie dann die Myoblasten in dieser frisch zubereiteten Kollagenmischung.Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter dieser Zell-Kollagen-Suspension zu jeder Muskelkammer des Bioreaktors hinzu und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen. Lassen Sie die Zellgelmischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius polymerisieren und füllen Sie dann jeden Bioreaktor gut mit 450 Mikrolitern myotoner Wachstumsmedien. Am Tag 11 der Motoneuron-Differenzierung übertragen Sie die Zellen und Medien in eine 50-Milliliter-Röhre und lassen Sie die Neurosphären für 5 Minuten auf dem Boden absetzen.Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 Milliliter Motoneuron-Suspensionskulturmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophem Faktor aus dem Gehirn und 10 Nanogramm pro Milliliter von Gliazellen abgeleitetem neurotrophem Faktor. Samen Sie am Tag 14 der Differenzierungsprotokolle die Motoneuronen in die Plattform. Bereiten Sie eine 4-zu-1-Gelmischung aus 2 Milligramm pro Milliliter Kollagen 1 und einer gelösten Basalmembranmatrix vor.Verwenden Sie ein 400-Nanometer-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und in der vorbereiteten Gelmischung zu resuspendieren. Saugen Sie die Medien vorsichtig aus dem Reservoir und der Neurosphäre gut ab und fügen Sie dann 15 Mikroliter der Gelmischung in den Neurosphärenkanal hinzu. Laden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette mit 10 Mikrolitern Gel und wählen Sie eine Neurosphäre.Legen Sie die Neurosphäre in den Neurosphärenkanal ab, stellen Sie sicher, dass sie sich in der Kammer befindet, und heben Sie dann langsam die Pipette an, während Sie das verbleibende Gel freisetzen, sobald sich die Neurosphäre abgelagert hat. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius polymerisieren und fügen Sie dann 450 Mikroliter NbActiv4 hinzu, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophem Faktor aus dem Gehirn und 10 Nanogramm pro Milliliter aus Gliazellen stammendem neurotrophem Faktor zu den Reservoirs. Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiterkamerasoftware.Stellen Sie das Binning auf 2 x 2, die Belichtung auf 20 Millisekunden, den Rollladen ein, die Ausleserate auf 540 Megahertz, den Dynamikbereich auf 12 Bit und die Verstärkung 1 und den Sensormodus auf Überlappung ein. Verwenden Sie ein 2-faches Objektiv am Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden, und befestigen Sie eine Lebendzellkammer am Mikroskoptisch. Wählen Sie die Region von Interesse, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren, und platzieren Sie dann einen 594-Nanometer-Long-Pass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem Bildgebungsobjektiv, um blaue Lichtimpulse aus der Kamera herauszufiltern.Als nächstes platzieren Sie eine rechteckige 4-Well-Platte mit vier Bioreaktoren in der Lebendzellkammer, klicken Sie dann auf Live-Ansicht und zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI. Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner herunter, um die Bühnenposition, die Arduino-Platine und die Videoerfassung zu steuern, und legen Sie dann den Ausgabefilm als Tag fest, der den Gewebegruppen-Unterstrich des Gewebenamens unterstrichen Experimentpunkt ND2 unterstreicht. Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten X- und Y-Koordinaten auf der Bühne aus und erfassen Sie einen schnellen Zeitraffer mit 1700 Bildern bei 50 Bildern pro Sekunde.Ersetzen Sie nach der Bildgebung das Medium und bringen Sie die Proben in den Inkubator zurück. Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Bildaufnahmesitzungen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden. Laden Sie für die Filmverarbeitung die Dateien aus dem GitHub-Ordner herunter und verwenden Sie den benutzerdefinierten MATLAB-Code, um die Videos in der Stapelanalyse zu verarbeiten.Öffnen Sie das rekursive Betriebssystemanalyseskript, um alle erworbenen Videos im selben Ordner zu haben. Passen Sie die Parameter vor der Analyse an und führen Sie das rekursive OSAnalysis-Skript aus, um die Filme durch parallele Verarbeitung zu analysieren. Passen Sie die Parameter nach der Analyse wie Baseline-Zeit, Peak-Schwellenwert, Min-Min-Prominenz und Min-Min-Breite nach Bedarf an.Generieren Sie schließlich die Video- und Diagrammausgabe, indem Sie recursiveOSMovie ausführen, um eine Videodatei für jedes Gewebe mit seiner jeweiligen Kontraktilitätsspur zu generieren. Dieses Protokoll wurde mit zwei Systemen mit unterschiedlichen Skalen getestet, einer mikrofluidischen Vorrichtung, die 1 Millimeter langes Skelettmuskelgewebe mit etwa 20.000 Myoblasten liefert, und dem Open-Well-Bioreaktorsystem, das zu 4 Millimeter langem Muskelgewebe führt, das ungefähr 450 Myoblasten umfasst. Ein optisches Setup wurde entwickelt, um eine kontrollierte Stimulation von Motoneuronen mit blauem Licht zu ermöglichen, und die NMJ-Funktion wurde mit einem benutzerdefinierten Mikroskopmakroskript in Verbindung mit einem benutzerdefinierten Arduino-Code erhöht.Dieser Code enthält abstimmbare einstellbare Parameter und bestimmt, ob eine Kontraktion ausgelöst wird, basierend auf der Zeit zwischen einem Lichtimpuls und dem Beginn des Kontraktilitätspeaks. Das System erfasste eine Verbesserung der NMJ-Funktion in Geweben, die eine Woche nach der Gewebeherstellung einen Anstieg der ausgelösten Reaktionen zeigte, gefolgt von einer stabilen Funktion für eine weitere Woche. Alpha-Bungarotoxin stoppte alle ausgelösten und spontanen Kontraktionen, was zu einer vollständigen Störung der NMJ-Funktion führte, was zeigt, dass die Lichtstimulation des Gewebes eine funktionelle NMJ erfordert.Die Analyse der mit 20% Myasthenia gravis Serum behandelten Gewebe für 48 Stunden zeigte eine verminderte Funktion im Vergleich zu Kontrollgeweben, die mit Serum von gesunden Spendern behandelt wurden. 48 Stunden nach dem Entfernen und Auswaschen des Serums zeigten die entwickelten NMJs eine Wiederherstellung der Funktion. Stellen Sie sicher, dass sich alle Bioreaktoren für die gleiche Zeit im Ofen befinden, um Steifigkeitsschwankungen zwischen den Chargen zu vermeiden.Achten Sie auch darauf, die Motoneuronenaussaat mit dem Mikroskop zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können Metabalomics, Proteomics und CRISPR-Screening durchgeführt werden, um zusätzliche Informationen zu sammeln und die mechanistischen Veränderungen, die durch erkranktes Serum verursacht werden, besser zu verstehen.

engineering-characterization-an-optogenetic-model-human-neuromuscular

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Video zeigt die Bildung von neuromuskulären Verbindungen mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts. Neuronale Vorläuferzellen und Muskelvorläuferzellen werden in verschiedene Vertiefungen innerhalb des Geräts ausgesät und zu Motoneuronen bzw. Myotuben reifen gelassen. Die Bildung eines Volumens und eines chemischen Gradienten führt zur Entwicklung aktiver neuromuskulärer Verbindungen.

Erzeugung neuromuskulärer Verbindungen mit einem mikrofluidischen Gerät

Dieses Video zeigt eine Methode zur Beurteilung funktioneller neuromuskulärer Verbindungen. Mit Hilfe eines Bioreaktors, der Muskelgewebe und Motoneuronen enthält, werden zusammen mit der Fluoreszenzmikroskopie die lichtempfindlichen Kanäle in den Neuronen stimuliert, um elektrische Signale zu erzeugen, was zu Muskelfaserkontraktionen führt.

Beurteilung einer funktionellen neuromuskulären Verbindung durch gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung

Quelle: Marinello, M., et al. Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen durch kombinierte konfokale und superauflösende Mikroskopie. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Präparation, Immunfärbung und Bildgebung von neuromuskulären Verbindungen im Muskelgewebe von Ratten mit konfokaler und superauflösender Mikroskopie zur Visualisierung und Analyse präsynaptischer und postsynaptischer Strukturen.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen in Mäusen durch kombinierte konfokale und superauflösende Mikroskopie

Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von In-vitro-NMJs aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zur Verfügung. Diese Methode kann NMJs mit ausgereifter Morphologie und Funktion in 1 Monat in einem einzigen Brunnen induzieren. Die daraus resultierenden NMJs könnten potenziell verwendet werden, um verwandte Krankheiten zu modellieren, pathologische Mechanismen zu untersuchen oder medikamentöse Verbindungen für die Therapie zu untersuchen.

In vitro Neuromuskuläre Junction Induziert von humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung menschlicher motorischer Einheiten in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten durch Kokulturierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Motoneuronen mit humanen primären Mesoangioblasten-abgeleiteten Myotuben, was zur Bildung funktionell aktiver neuromuskulärer Verbindungen führt.

Erzeugung humanmotorischer Einheiten mit funktionellen neuromuskulären Verbindungen in mikrofluidischen Geräten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur morphometrischen Analyse neuromuskulärer Verbindungen durch kombinierte konfokale und STED-Mikroskopie, die zur Quantifizierung pathologischer Veränderungen in Mausmodellen von SMA und ColQ-bezogenen CMS verwendet wird.

Charakterisierung neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen mittels kombinierter konfokaler und hochauflösender Mikroskopie

Das Protokoll zeigt eine Methode zur Untersuchung der räumlichen Korrelation zwischen den präsynaptischen Terminals, postsynaptischen Rezeptoren und perisynaptischen Schwann-Zellen im medialen Gastrocnemius-Muskel der Ratte unter Verwendung der fluoreszierenden Immunhistochemie mit verschiedenen Biomarkern, nämlich Neurofilament 200, vesikulärem Acetylcholintransporter, Alpha-Bungarotoxin und S100.

Visualisierung der morphologischen Eigenschaften der neuromuskulären Verbindung im Musculus atralis guestrocnemius medialis der Ratte

In dieser Studie demonstrieren wir ein verfeinertes Single Fiber Electromyography (SFEMG)-Protokoll, um in vivo die Übertragung der neuromuskulären Verbindung (NMJ) in Nagetiermodellen zu messen. Es wird ein schrittweiser Ansatz für die SFEMG-Technik beschrieben, um die Quantifizierung der NMJ-Übertragungsvariabilität und des NMJ-Transmissionsversagens im Gastrocnemius-Muskel der Ratte zu ermöglichen.

Stimulierte Einzelfaser-Elektromyographie (SFEMG) zur Beurteilung der Übertragung neuromuskulärer Verbindungen in Nagetiermodellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Erfahren Sie die Entwicklung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs mit 3D-Skelettmuskelgewebe und motorischen Neuronen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Quantifizierung neuromuskulärer Verbindungen.

Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Weitere Videos entdecken