Einzelzell-Proteomik-Vorbereitung für die massenspektrometrische Analyse mittels Gefrierwärmelyse und isobarem Träger

SCoPE2 kann Tausende von Proteinen aus Tausenden von einzelnen Säugetierzellen ohne Antikörper quantifizieren. Dieses Protokoll kann helfen, Proteomheterogenität aufzudecken, die sonst für Massenanalysen unsichtbar wäre. Die Einzelzellproteomik wurde unter Verwendung des SCoPE2-Ansatzes so konzipiert, dass sie Forschern mit einer Reihe von Ressourcen zugänglich ist, von nur einer Pipette bis hin zu Liquid-Handling-Robotik.

SCoPE2 ist in vielen Forschungsbereichen, einschließlich Krebs und Immunologie, breit anwendbar, indem es Einblicke in die Häufigkeit von Proteinen zwischen einzelnen Zellen derselben Population bietet. Um zu beginnen, beginnen Sie den Zelllysevorgang, indem Sie eine 384-Well-Platte mit sortierten Einzelzellen in den Thermocycler legen und ihn 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius erhitzen, gefolgt von einem Abkühlen bei 12 Grad Celsius. Drehen Sie die Platte kurz in einem Tischplattenspinner bei 18 bis 22 Grad Celsius herunter.

Beschallen Sie die Platte fünf Minuten lang in einem Wasserbadsonikator bei 18 bis 22 Grad Celsius. Dann legen Sie es auf Eis. Um mit dem Trypsinaufschluss fortzufahren, bereiten Sie 100 Mikroliter der Mastermischung vor und fügen Sie 0,2 Mikroliter der Mastermischung mit einem Liquid Handler in jede Vertiefung der 384-Well-Platte hinzu.

Versiegeln Sie die Platte, wirbeln Sie fünf Sekunden lang und drehen Sie sich in einem Tischplattenspinner bei 18 bis 22 Grad Celsius. Erhitzen Sie die 384-Well-Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, wobei die Deckeltemperatur auf 52 Grad Celsius eingestellt ist. Um eine Tandem-Massenmarkierungsreaktion einzustellen, nehmen Sie die 85-Millimolar-Bestände an Tandem-Massenanhängern aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank.

Bevor Sie sie öffnen, erwärmen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur und verdünnen Sie die Etiketten auf 22 Millimol in wasserfreiem Acetonitril. Mit dieser Kennzeichnungsstrategie fügen Sie 0,5 Mikroliter verdünnte Tandem-Massenanhänger zu jeder Vertiefung der 384-Well-Platte hinzu, entweder mit einem Flüssigkeitsdosierroboter oder einer manuellen Pipette. Versiegeln Sie die Platte, wirbeln Sie fünf Sekunden lang und drehen Sie sich in einem Tischplattenspinner bei 18 bis 22 Grad Celsius.

Lassen Sie die Markierungsreaktion eine Stunde lang bei 18 bis 22 Grad Celsius ablaufen. Zum Abschrecken der Tandem-Massenmarkierungsreaktion werden 0,2 Mikroliter 0,5% Hydroxylamin, verdünnt in HPLC-Wasser, mit einem Liquid Handler in jede Vertiefung der 384-Well-Platte gegeben. Verschließen Sie die Platte, wirbeln Sie fünf Sekunden lang und drehen Sie sie in einem Tischplattenspinner herunter, bevor Sie die Platte 30 Minuten lang bei 18 bis 22 Grad Celsius halten.

Die Vorbereitung der LC-MS-Analyse beginnt mit der Entnahme des kombinierten Trägers oder Referenzmaterials aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Für jeden Satz wird ein Mikroliter Träger- und Referenzmaterial in die erste Vertiefung pipettiert, die Teil eines einzigen Satzes ist. Pipetten Sie das gesamte Volumen von der ersten Vertiefung bis zur nächsten Vertiefung.

Pipettieren Sie das gesamte Volumen von einer Vertiefung zur nächsten, bis alle Vertiefungen in einem einzigen Satz in der endgültigen Vertiefung kombiniert wurden. Fügen Sie für jeden Satz fünf Mikroliter 50% Acetonitril in HPLC-Wasser für die erste Einzelzellmulde hinzu, die in jedem Satz enthalten sein soll. Pipetten Sie das gesamte Volumen von der ersten Vertiefung bis zur nächsten Vertiefung.

Pipettieren Sie das gesamte Volumen von einer Zelle zur nächsten, bis alle Vertiefungen in einem einzigen Satz in der endgültigen Vertiefung kombiniert wurden. Übertragen Sie nun jedes Set in ihre Autosampler-Glaseinsätze. Trocknen Sie die Proben, sobald alle Sets kombiniert und in Glaseinsätze gelegt wurden.

Vor der LC-MS-MS-Analyse 1,2 Mikroliter 0,1% Ameisensäure zu jedem Satz hinzufügen, um die markierten Peptide zu resuspendieren. Legen Sie die Autosampler-Einsätze in Glas-Autosampler-Durchstechflaschen und verschließen Sie jede Probe mit einer Kappe. Ziehen Sie jede Durchstechflasche fünf Sekunden lang durch, um sicherzustellen, dass die Resuspension abgeschlossen ist, und drehen Sie sich dann in einer Durchstechflasche bei 18 bis 22 Grad Celsius herunter.

Stellen Sie sicher, dass sich jede Probe an der Unterseite des Einsatzes befindet und nicht an den Seiten verspritzt wird. Legen Sie die Durchstechflaschen in das Autosampler-Fach und injizieren Sie für jedes Set eine Ein-Mikroliter-Probe für die LC-MS-MS-Analyse. Die Aufschluss- und Markierungseffizienz der einzelnen Zellen kann nicht direkt wie beim Träger untersucht werden, aber die DO-MS-Software bietet Diagramme, die die Verdauungs- und Markierungseffizienz schätzen.

Eine schlechte Verdauung wird durch ein hohes Verhältnis der Intensität der gespaltenen Peptide zu ihren vollständig gespaltenen Gegenstücken angezeigt. Ein weiterer Faktor, der in den Sets zu berücksichtigen ist, ist der Anteil der fehlenden Daten in der mittleren Reporterionenintensität in jedem Tandem-Massenmarkierungskanal. Wenn einzelne Zellen erfolgreich vorbereitet sind, sind die fehlenden Daten pro Zelle und die Positivkontrolle viel geringer als bei negativen Kontrollproben.

Eine sorgfältige Handhabung von Flüssigkeiten während der LC-MS-MS-Probenvorbereitung ist entscheidend für eine maximale Rückgewinnung von Peptiden. Kleine Proben von etwa 100 Pikogramm bis 100 Nanogramm pro Vertiefung können mit einem isobaren Träger für die Proteomik-Analyse vorbereitet werden. SCoPE2 macht Einzelzell-Proteomik-Messungen für Forscher weltweit zugänglich, indem nur gängige Reagenzien und kommerziell erhältliche Geräte verwendet werden.

Es ist für manuelle Verarbeitung oder Hochdurchsatzautomatisierung durch robotergestütztes Liquid Handling geeignet.