Name: Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung hochreinen Newcastle-Disease-Virus mit Titer über 6 × 10⁹ PFU/mL aus Allantoic Fluid mittels Tangentialflussfiltration. Diese Methode ermöglicht sichere In-vivo-Anwendungen in der Virologie.

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J.G.E.Y erhielt ein PhD-Stipendium des Ontario Veterinary College und ein Ontario Graduate Scholarship. Diese Arbeit wurde durch Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants an SKW (Grant # 304737) und LS (Grant # 401127) finanziert.

<ol><li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
<li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li>
<li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219(2021).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
<li>Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).</li>
<li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).</li>
<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).</li>
<li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ulster+strain+Newcastle+disease+virus+hemagglutinin-neuraminidase+reveals+auto-inhibitory+interactions+associated+with+low+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).</li>
<li>Sheets, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+on+adventitious+agents+testing+for+vaccines%3A+Why+do+we+worry+so+much+about+adventitious+agents+in+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines.</a> Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).</li>
<li>Chung, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+allergies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccine allergies.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).</li>
<li>Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+clinical+application+of+Newcastle+disease+virus%3A+time+to+celebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate.</a> Biomedicines. 4 (3), (2016).</li>
<li>Ajamian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL5+persists+in+RSV+stocks+following+sucrose-gradient+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).</li>
<li>Axis-Shield. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Axis-Shield+OptiPrepTM+The+ideal+density+gradient+medium+for+isolation+of+blood+cells%22">Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells</a>. , (2020).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li>
<li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li>
<li>Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Viren, die in präklinischen Studien als Therapeutika verwendet werden, müssen bei der Verabreichung in vivo15 stark gereinigt werden, um Toxizität zu vermeiden. Wenn zufällige Agenzien oder Verunreinigungen nicht entfernt werden, kann dies zu schweren Nebenwirkungen führen, die die therapeutische Wirkung des viralen Wirkstoffszunichte machen 28. Da NDV in embryonierten Hühnereiern hergestellt wird, gibt es mehrere kontaminierende Eiproteine wie Eieralbumin, die vor...

Newcastle Disease Virus, auch bekannt als Avian Orthoavulavirus-1, ist ein umhülltes aviäres Paramyxovirus mit dem Potenzial, sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff 1,2,3,4,5,6,7 verwendet zu werden. In jüngster Zeit wurde NDV, das zur Expression des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 entwickelt wurde, als wirksamer intranasales Impfstoff in den Maus- und Hamster-Challenge-Modellen 7,8,9 charakterisiert. Wenn es als Krebsimmuntherapie verwendet wird, führt es zur Rekrutierung angeborener Immunzellen, insbesondere natürlicher Killerzellen, zur Produktion von Typ-I-Interferon und zur Erzeugung von antitumorspezifischen T-Zellen10,11,12,13. Zusätzlich zu diesen starken immunstimulierenden Eigenschaften hat NDV ein starkes Sicherheitsprofil und ein gut etabliertes umgekehrtes Genetiksystem14,15. Diese wünschenswerten Eigenschaften haben zur Bewertung von NDV in zahlreichen präklinischen und humanklinischen Studien geführt (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Um diesen vielversprechenden, immunstimulierenden viralen Vektor weiter voranzubringen, sind detaillierte Methoden zur Herstellung und Reinigung von hochtiterem, hochreinem NDV erforderlich, das sicher in vivo verabreicht werden kann.
Da NDV ein Vogelparamyxovirus ist, wird es am häufigsten in embryonierten Hühnereiern amplifiziert. Während es zellbasierte Systeme zur Vermehrung von NDV gibt, waren die meisten nicht in der Lage, Titer zu produzieren, die denen ähneln, die in embryonierten Hühnereiern18 erreicht wurden. Dennoch gibt es einige Nachteile bei der Herstellung von NDV in Eiern, einschließlich der Tatsache, dass die Produktion auf Eibasis langwierig und nicht leicht skalierbar ist, die Beschaffung großer Mengen von SPF-Hühnereiern problematisch sein kann und das Potenzial für eine Kontamination mit Eiallergenen besteht13,18,19,20 . Kürzlich hat eine Gruppe gezeigt, dass Vero-Zellen, die in Suspension in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, die Replikation von NDV zu Titern unterstützen können, die mit denen vergleichbar sind, die in Eiern vor der Reinigungerreicht wurden 21. Dies erforderte jedoch eine serielle Übertragung des Virus, um das Virus an Vero-Zellen anzupassen, und die Optimierung einer Methode zur Reinigung von NDV aus Suspensions-Vero-Zellen ist immer noch erforderlich21.
Wie bereits erwähnt, variieren die Methoden zur Reinigung von High-Titer-In-vivo-Viren je nach dem betreffenden Virus22. Für die Erzeugung rekombinanter NDV steht ein gut etabliertes System der umgekehrten Genetik zur Verfügung. Dieser Prozess, bei dem ein cDNA-Klon, Helferplasmide und ein Helfervirus verwendet werden, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, wurde zuvor ausführlich beschrieben 15,23. Dieses Protokoll kann entweder auf lentogene oder mesogene NDV angewendet werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Virus ist ein rekombinantes mesogenes NDV, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria kodiert, das zwischen viralen P- und M-Genen als individuelle Transkriptionseinheit eingefügt wurde, da dies zuvor als optimaler Ort für die Insertion von Fremdtransgenen beschrieben wurde24.
Geschlossene Methoden beschreiben die Reinigung von NDV basierend auf seiner Größe, die von 100 bis 500 nm reicht, und seiner Dichte15. Dies ermöglichte die Erzeugung von In-vivo-haltigen, hochtiteren NDV-Beständen in etwa 3 Wochen, beginnend mit dem Empfang der Eier bis hin zu einem endgültigen Titer. Es werden Techniken beschrieben, die häufig bei der großtechnischen Produktion von Viren auf Eibasis verwendet werden, wie z. B. Tangentialflussfiltration, Tiefenfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, die die Übertragung dieser Methoden auf die Produktion in größerem Maßstab ermöglichen. Zuvor beschriebene Techniken zur Reinigung von NDV wurden durch den Einbau eines virusstabilisierenden Puffers, die Verwendung von Iodixanol während der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die Beschreibung verschiedener Qualitätskontrollmaßnahmen zur Sicherstellung der In-vivo-Qualität verbessert 15. Dies hat die Reinigung von In-vivo-Qualität NDV ermöglicht, die Titer von bis zu 3 × 1010 PFU / ml von 0,8 bis 1,0 L Allantoikflüssigkeit erreicht.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin</td><td>HyClone</td><td>SH30042,02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Slip-Tip Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Spritze</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10 % Povidon-Jod-Lösung</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 1/2 Zoll stumpfe Füllnadel</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 Zoll Präzisions-Gleitnadel</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 Zoll Nadel</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Gewebekulturplatte - flacher Boden</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, Glacial</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Bleiche (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>Breite, ungefederte Pinzette</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Kassettenhalter</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Diät Gel Recovery</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Digital 1502 Sportler Ei-Inkubator</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>Egg Candler</td><td>Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung, pH 8,0, 0,5 M in H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>T-Stücke mit Innengewinde, Nylon, 1/8 Zoll NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Fine Point High Precision Pinzette</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>Nicht erforderlich, wenn keine IFA durchgeführt wird oder wenn NDV kein fluoreszierendes Protein kodiert</td></tr><tr><td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX Gel Imager</td><td>Syngene</td><td></td><td>Bildgebung von Agarose-Gelen</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td> Thermo-Fisher <td>BP381-5</td><td></td><td>cDNA-Reverse-Transkriptase-Kit</td></tr><tr>mit<td>hoher Kapazität</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Hoher Glukosegehalt Dulbeccos modifiziertes essentielles Medium</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Humidity</td><td>Kit Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>Jodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (w/v) Lösung von Iodixanol in Wasser (steril)</td></tr><tr><td>L-Lysin-Monohydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Außengewinde 1/8 Zoll Nationalrohrgewinde, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digitalantrieb</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>Schlauchpumpe mit Digitalanzeige</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy Load Pumpenkopf für Präzisionsschläuche</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Silikonschlauch (Platin) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm Platin-Cured Silicone</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE Cast und Running Appartus</td></tr><tr><td>Maus-Anti-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>Klon 6H12</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Omega Membran LV Centramate Kassette, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A Mini Gel-Elektrophorese-System</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X Lösung</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol) Durchschnitt Mn 20.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>Modell 1655050 - für Agarose-Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-Lyzer Dialysekassette (extra stark), 10.000 MWCO 0,5-3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (Pellets)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>Spezifisch pathogenfreie Eier</td><td>CFIA</td><td>NA</td><td>Lieferant variiert je nach Standort</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 Tiefenfilter</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische</td> <td>SchereThermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>Wird in den Protokollschritten 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>verwendet SX4750 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>SxX4750 Adapter für Concial-Bottom Röhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Ultraclear Zentrifugenröhrchen ( 9/16 Zoll x 3 1/2 Zoll)</td><td>Beckman Schar</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchschraubklemme</td><td>PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung des rekombinanten newcastle-disease-virus mit hohem titer aus allantoic fluid

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Das Newcastle-Disease-Virus (NDV), auch bekannt als Vogelorthoavulavirus-Serotyp-1, ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit negativem Sinn, das sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff entwickelt wurde. NDV ist aufgrund seines gut etablierten reverse-genetischen Systems, seiner starken immunstimulierenden Eigenschaften und seines ausgezeichneten Sicherheitsprofils ein attraktives therapeutisches und prophylaktisches Mittel. Bei der Verabreichung als onkolytisches Virus oder viral-vektorisierter Impfstoff löst NDV eine robuste Antitumor- oder Antigen-spezifische Immunantwort aus, die sowohl den angeborenen als auch den adaptiven Arm des Immunsystems aktiviert. 
Angesichts dieser wünschenswerten Eigenschaften wurde NDV in zahlreichen klinischen Studien untersucht und ist eines der am besten untersuchten onkolytischen Viren. Derzeit gibt es zwei registrierte klinische Studien mit NDV: eine zur Bewertung eines rekombinanten NDV-vektorisierten Impfstoffs für SARS-CoV-2 (NCT04871737) und eine zweite zur Bewertung eines rekombinanten NDV, das Interleukin-12 kodiert, in Kombination mit Durvalumab, einem AntiPD-L1-Antikörper (NCT04613492). Um die Weiterentwicklung dieses vielversprechenden viralen Vektors zu erleichtern, sind vereinfachte Methoden zur Erzeugung von rekombinantem NDV (rNDV) mit hohem Titer-, In-vivo-Grad erforderlich. 
Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Amplifikation von rNDV in spezifizierten pathogenfreien (SPF) embryonierten Hühnereiern und zur Reinigung von rNDV aus Allantoikflüssigkeit mit Verbesserungen zur Verringerung des Verlusts während der Reinigung. Ebenfalls enthalten sind Beschreibungen der empfohlenen Qualitätskontrollassays, die durchgeführt werden sollten, um den Mangel an Kontaminanten und die Virusintegrität zu bestätigen. Insgesamt ermöglicht dieses detaillierte Verfahren die Synthese, Reinigung und Speicherung von hochtiteren, in vivo gradigen, rekombinanten, lentogen und mesogenen NDV für den Einsatz in präklinischen Studien.

Ernte von Allantoikflüssigkeit Da Allantoikflüssigkeit aus embryonierten Hühnereiern gewonnen wird, sollte sie klar und transparent erscheinen. Wenn die Flüssigkeit undurchsichtig und gelb erscheint, deutet dies auf das Vorhandensein von Verunreinigungen hin. Die Einbeziehung dieser allantoischen Flüssigkeit während der Reinigung behindert den Reinigungsprozess, da der Druck schnell ansteigt und 10 psi überschreitet, was zur Scherung des Virus und zum Verlust des infektiösen Virus führt. Allantoische ...

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg > 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Dieses Protokoll beschreibt die Techniken, die zur Herstellung des Newcastle-Disease-Virus verwendet werden, damit es Mäusen und anderen Tieren wie Hamstern und Schafen sicher verabreicht werden kann. Durch den Einsatz der tangentialen Strömungsfiltration können große Startvolumina im Vergleich zu bestehenden Verfahren, die nur Zentrifugationsverfahren verwenden, effizienter verarbeitet werden. Dies ist ein langwieriges Verfahren mit mehreren komplizierten Schritten, was bedeutet, dass das Zeitmanagement ein Problem sein kann.Ich würde empfehlen, alle potenziellen Pausenschritte zu identifizieren, damit die Technik angemessen aufgeteilt werden kann, wodurch der Stress minimiert wird. Dieses Verfahren wird Alex, ein Forschungsassistent aus meinem Labor, demonstrieren. Für die Reinigung des Newcastle Disease Virus oder NDV bereiten Sie zunächst das zuvor festgelegte experimentelle System vor, indem Sie 50 Milliliter PBS durchlaufen.Stoppen Sie die Pumpe, wenn etwa fünf Milliliter PBS im Rohr verbleiben. Als nächstes befestigen Sie einen Tiefenfilter mit einer mikromolaren Retentionsrate von ein bis drei an den Schläuchen. Um den Filter zu entlüften, entfernen Sie die zweite Kappe auf der epischen Seite des Tiefenfilters und beginnen Sie dann, zusätzliche 50 Milliliter PBS durch das System laufen zu lassen.Sobald der PBS beginnt, durch die Entlüftung an der Oberseite des Filters zu fließen, schließen Sie den Anschluss und fahren Sie fort, PBS durch die Leitungen zu fließen. Danach ersetzen Sie das Abfallgefäß durch ein neues steriles Sammelgefäß und beginnen Sie, Allantoic Fluid durch den Tiefenfilter zu führen. Als nächstes richten Sie die tangentiale Strömungsfiltration oder das TFF-System in einer offenen Bestätigung ein und führen Sie sie wie im Manuskript beschrieben aus.Wenn sich noch etwa fünf Milliliter Flüssigkeit im Reservoir befinden, pausieren Sie die Pumpe und fügen Sie dem Reservoir tiefengefilterte Allantoic Fluid hinzu. Nehmen Sie dann den Pumpendurchfluss wieder auf. Um das Scheren des Virus zu verhindern, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Druck des Systems 10 Pfund Kraft pro Quadratzoll nicht überschreitet.Um die Illusion zu erhöhen, sollte eine Kombination aus der Drehzahl der Peristaltikpumpe und der C-Klemme verwendet werden. 150 bis 100 Milliliter Allantoic Fluid verbleiben im Reservoir, pausieren Sie die Pumpe und tauschen Sie den Puffer durch Zugabe von 150 bis 200 Milliliter ML-Puffer aus. Halten Sie die Pumpe erneut an, wenn fünf bis 10 Milliliter Flüssigkeit im Reservoir verbleiben, und schließen Sie dann mit zwei C-Klemmen die Taille.Entkoppeln Sie die festsitzende Leitung, die den Behälter speist, und führen Sie sie in ein 50-Milliliter-Konusrohr ein. Nehmen Sie dann den Fluss wieder auf und pausieren Sie, wenn nur noch wenige Flüssigkeitstropfen im Reservoirtank vorhanden sind. Entfernen Sie als Nächstes die C-Klemmen von den Abfallleitungen und befestigen Sie die zurückgehaltene Zuleitung wieder am Reservoirtank.Um sich auf die Ultrazentrifugation des Iodixanol-Dichtegradienten vorzubereiten, fügen Sie zunächst 0,5 Milliliter 40% iodixanol zu einem 13,2 Milliliter offenen dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchen hinzu. Dann machen Sie die Säule mit aufeinanderfolgenden Zugaben von 2,5 Millilitern 20% Jodixanol und 2,5 Millilitern 10% Iodixanol fertig. Vor der Ultrazentrifugation sechs bis 6,5 Milliliter der aus dem TFF-System angedeuteten Viruslösung vorsichtig in die Iodixanol-Säule geben, ohne den Gradienten zu stören.Entfernen Sie nach der Ultrazentrifugation die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Das Zielband sollte ein großes Band zwischen den Gradienten von 10 und 20% sein. Als nächstes hängen Sie das Rohr mit einem Retortenständer über die Oberseite eines Becherglases.Danach befestigen Sie eine 1,5-Zoll-Nadel von 18 Gauge an einer Fünf-Milliliter-Spritze, durchstechen Sie dann die Seite des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel und entfernen Sie das Zielband, indem Sie den Kolben langsam verlängern. Nachdem Sie Iodixanol aus der Viruslösung entfernt haben, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie eine Spritze, um das Virus vorsichtig in eine Dialysekassette zu injizieren. Um die Viruslösung zu konzentrieren, nehmen Sie die Dialysekassette aus dem Dialysepuffer und legen Sie sie in einen kleinen verschließbaren Plastikbeutel.Dann geben Sie einen 15 bis 25 Milliliter 40% Polyethylenglykol in den Beutel, so dass die Dialysekassette vollständig untergetaucht ist. Nach der Dialyse die Dialysekassette kurz mit PBS abspülen. Als nächstes füllen Sie eine Spritze, die mit einer 1,5-Zoll-Nadel von 18 Gauge ausgestattet ist, mit Luft, setzen Sie die Spritze in die Dialysekassette ein und drücken Sie den Kolben.Drehen Sie das Gerät zum Entfernen des Virus, ohne die eingebrachte Luft zu entfernen. Um das an der Membran haftende Restvirus zu entfernen, massieren Sie die Membran vorsichtig mit behandschuhten Fingern, ohne sie zu beschädigen. Um den Verdrängungsprozess zu erleichtern, entfernen Sie einen Teil der überschüssigen Luft in der Dialysekassette.Für Qualitätskontrollassays verdünnen Sie zunächst die Viruslösung 100 Mal, indem Sie 10 Mikroliter davon zu 990 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Fahren Sie dann mit der seriellen Verdünnung fort, indem Sie 100 Mikroliter der vorherigen Verdünnung zu 900 Mikrolitern PBS hinzufügen. Für Infektionsassays fügen Sie 20 Mikroliter jeder Wahnvorstellung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu.Bevor Sie die zytopathische Wirkung von grünem Fluoreszenzprotein untersuchen oder einen indirekten Immunfluoreszenztest durchführen, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für mindestens 48 Stunden. Durch die Verwendung dieses Protokolls wurde hochgereinigtes NDV erhalten, wie durch Natrium-Do-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der viralen Proteine gezeigt wurde. Die Infektiosität des mit dieser Methode gereinigten Virus wurde auch durch die 50%ige Gewebekulturinfektionsdosis oder den TCID50-Assay in 96 Well-Platten verifiziert.Der TCID50 wurde aus der Anzahl der positiven Vertiefungen für jede Verdünnung mit dem Spearman-Karber-Rechner bestimmt. Der Infektionsassay zeigte den Unterschied zwischen den zytopathischen Wirkungen von lentogener und mesogener NDV auf DF-Ein-Zellen unter verschiedenen Bedingungen nach 10 und 24 Stunden Inkubation. Der Immun-Florence-Assay war auch wirksam bei der Untersuchung der Infektion von Vero-Zellen durch lentogene NDV.Stellen Sie bei der Grundierung des experimentellen Systems sicher, dass die Linien effektiv vorbereitet werden, da jedes verbleibende Natriumhydroxid das Virus inaktiviert. Es ist auch wichtig, die Integrität der Membran aufrechtzuerhalten, da dies die Virusreinigung und -ausbeute erheblich beeinträchtigt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

In diesem Artikel beschreiben wir die Identifikation des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 (AAV3) als die effizienteste Vektor für die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebszellen.

High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren

Rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAVs) Vektoren sind immer wertvoll...

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Fruchtbare Hühnereier werden häufig verwendet, um große Mengen an humanen Influenza-A-Viren zu produzieren, da sie ein bequemes und kostengünstiges System zum Nachweis hoher Viruserträge bieten.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent &gt;1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen

Da sich das Gebiet der Gentherapie ständig weiterentwickelt, besteht ein wachsender Bedarf an innovativen Methoden, die diese Herausforderungen bewältigen können. Hier wird eine einzigartige Methode vorgestellt, die den Prozess der Generierung von hochreinen und hochreinen AAV-Vektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform rationalisiert und die Qualitätsstandards für In-vivo-Studien erfüllt.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

In diesem Artikel wird eine vereinfachte Methode zur Herstellung von 4 Hämagglutinationseinheiten Antigen für serologische Tests auf das Virus der Newcastle-Krankheit vorgestellt. Durch die genaue Bestimmung des Hämagglutinationstiters des Antigens, kombiniert mit einer strengeren Rücktitrationsmethode und einem genau definierten Anpassungsprozess, erhöht es die Testeffizienz, reduziert falsch positive Ergebnisse und verbessert die Krankheitsüberwachung bei Geflügel.

Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie

Erfahren Sie die Herstellung hochreinen Newcastle-Disease-Virus mit Titer über 6 × 10⁹ PFU/mL aus Allantoic Fluid mittels Tangentialflussfiltration. Diese Methode ermöglicht sichere In-vivo-Anwendungen in der Virologie.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

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