Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Der isogene Glomerulus-Chip wird patientenspezifische Krankheitsmodellierung und Nephrotoxizitätstests sowie fortschrittliche Anwendungen in der Präzisionsmedizin ermöglichen. Glomeruläres Epithel und Endothel stammen aus einer einzigen Population von human-induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPSCs. IPSCs besitzen unbegrenzte Selbsterneuerung und können sich in fast jeden Zelltyp differenzieren.

Diese Technik kann verwendet werden, um pathologische zelluläre Phänotypen und Krankheiten zu beurteilen. Der patientenspezifische Organchip kann auch als Plattform für Medikamentenscreenings und mechanistische Studien dienen. Dieses Modell kann auf die Entwicklung eines Körper-auf-Chip-Systems angewendet werden, das auf einen bestimmten Patienten zugeschnitten ist.

Dieses System hat das Potenzial, patientenspezifische Reaktionen vor klinischen Tests vorherzusagen. Beginnen Sie mit der vorsichtigen Zugabe von 25 Mikrolitern Basalmembranmatrix 2-Lösung in den Harnkanal und 20 Mikroliter in den Kapillarkanal des Chips. Nehmen Sie zwei sterile 15-Milliliter-konische Schlauchkappen und füllen Sie sie mit 500 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser.

Legen Sie die Kappe in die Petrischale, um ein Austrocknen zu verhindern, und setzen Sie den Deckel auf die Schale. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius über Nacht. Anschließend wird das Medium aus T75-Kolben aspiriert, die eine 15-tägige Kultur von vaskulären Endothelzellen bei 90%-Konfluenz enthalten.

Fügen Sie fünf Milliliter Zellablösungspuffer hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf bis sieben Minuten. Dann werden die Zellen in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen überführt und fünf Milliliter DMEM/F-12 hinzugefügt. Zentrifugieren Sie bei 200 mal G für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern endothelialem Erhaltungsmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, um etwa 2 Millionen Zellen zu erhalten. Spülen Sie mit einer P200-Barrierespitze sowohl den oberen als auch den unteren Kanal des mikrofluidischen Chips mit 200 Mikrolitern DMEM/F-12 und saugen Sie gleichzeitig von der Peripherie des Auslasses ab.

Halten Sie den Chip fest mit der P200-Barrierespitze, die am Aspirator befestigt ist, weg vom Ausgang des unteren Kanals. Injizieren Sie 20 Mikroliter der vaskulären Endothelzellsuspension fest in den Kapillarkanal des Chips und saugen Sie das Medium vorsichtig aus der Peripherie des Auslasses ab. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop auf Blasen oder eine ungleichmäßige Aussaatdichte.

Drehen Sie den Chip vorsichtig um, damit die Zellen an der basalen Seite der flexiblen PDMS-Membran haften können. Legen Sie den Chip in die Halterpatrone und geben Sie drei Milliliter PBS in die Kartusche, um ein Austrocknen der Membran zu verhindern. Inkubieren Sie den Chip bei 37 Grad Celsius für drei Stunden.

Überprüfen Sie den unteren Kanal unter dem Mikroskop auf eine konfluente Zellschicht, die an der flexiblen PDMS-Membran befestigt ist. Waschen Sie die nicht angeschlossenen Zellen, indem Sie 200 Mikroliter endotheliales Erhaltungsmedium am Eingang des unteren Kanals hinzufügen, während Sie von der Peripherie des Kapillarkanalauslasses absaugen. Setzen Sie den Chip wieder in die Halterpatrone ein und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag spülen Sie den Kapillarkanal vorsichtig mit 200 Mikrolitern endothelialem Erhaltungsmedium. Spülen Sie den Harnkanal mit 200 Mikrolitern DMEM/F-12 und lassen Sie 50 Mikroliter DMEM/F-12 auf die Ein- und Auslassöffnungen fallen. Ersetzen Sie das intermediäre Mesoderm-Induktionsmedium aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte durch einen Milliliter Trypsin EDTA und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.

Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zelllifter ab und dissoziieren Sie die Zellen durch Pipettieren. Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-Neutralisationslösung in jede Vertiefung und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Das Volumen der Zellsuspension mit DMEM/F-12 auf 50 Milliliter auffüllen und bei 200 mal G fünf Minuten zentrifugieren.

Asspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern intermediärem Mesoderm-Induktionsmedium, um etwa 3 Millionen Zellen zu erhalten. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Halten Sie den Chip und injizieren Sie 25 Mikroliter Zellsuspension fest in den Harnkanal des Chips, während Sie das Medium vorsichtig von der Peripherie des Auslasses ansaugen.

Überprüfen Sie auf Blasen oder ungleichmäßige Zellaussaatdichte. Drei Milliliter PBS in die Chiphalterkartusche geben und drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation spülen Sie beide Kanäle mit 200 Mikrolitern ihres jeweiligen Zellkulturmediums.

Befestigen Sie leere P200-Barrierespitzen in beiden Ausgängen des Harn- und Kapillarkanals. Pipettieren Sie 200 Mikroliter endotheliales Erhaltungsmedium und injizieren Sie die Hälfte davon in den Kapillarkanaleinlass. Lassen Sie die Pipettenspitze im Einlass so los, dass sowohl der Einlass als auch der Auslass des Kanals an mit Medium gefüllten Pipettenspitzen befestigt sind.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Harnkanaleinlass mit 200 Mikrolitern intermediärem Mesoderm-Erhaltungsmedium. Inkubieren Sie die Chips mit Spitzen, die bei 37 Grad Celsius eingebettet sind, über Nacht. Um die Chips mit dem Organchip-Bioreaktor zu verbinden, entfernen Sie zunächst die P200-Spitzen aus den Kanälen.

Fügen Sie Tröpfchen entsprechender Medien in den Ein- und Auslass der Harn- und Kapillarkanäle ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Fügen Sie drei Milliliter warmes Podozyten-Induktionsmedium in das Urineinlassreservoir und drei Milliliter warmes endotheliales Erhaltungsmedium in das kapillare Einlassreservoir hinzu. Geben Sie 300 Mikroliter des jeweiligen Mediums direkt über dem Auslassanschluss in die Auslassbehälter.

Schieben Sie die Pods auf das Tablett und in den Bioreaktor des Organchips. Verwenden Sie den Drehregler, um den Prime-Zyklus auszuwählen und für zwei Minuten zu starten. Untersuchen Sie die Unterseite des Pods visuell auf kleine Tröpfchen an allen vier fluidischen Anschlüssen.

Um einen Flüssigkeitskontakt zwischen der Pod-Unterseite und den mikrofluidischen Chipports zu erreichen, schieben Sie den Chipträger vorsichtig in den Pod. Drücken Sie die Chipträgerlasche vorsichtig hinein und nach oben. Saugen Sie überschüssiges Medium von der Chipoberfläche ab.

Stellen Sie die Durchflussrate des Organchip-Bioreaktors auf 60 Mikroliter pro Stunde ein. Stellen Sie die zyklische Belastung auf 10% bei 0,4 Hertz ein. Verwenden Sie den Drehregler am Organchip-Bioreaktor, um den Regelzyklus auszuwählen und zwei Stunden lang zu laufen.

Prüfen Sie die Auslassbehälter visuell auf eine Erhöhung des Mediumsspiegels. Verwenden Sie den Drehregler am Organchip-Bioreaktor, um den Regelzyklus auszuwählen. Nach Tag 17 der Kultur saugen Sie das Medium täglich aus den Harnkanalauslassreservoirs diagonal vom Hafen weg ab, aber halten Sie etwas Medium im Reservoir.

Füllen Sie das Harnkanaleinlassreservoir fünf Tage lang alle zwei Tage mit bis zu drei Milliliter Podozyten-Induktionsmedium auf. Nach fünf Tagen saugen Sie das Medium aus dem Harnkanal ab, aber halten Sie etwas Medium im Reservoir. Füllen Sie das Harnkanaleinlassreservoir täglich mit drei Milliliter Podozyten-Erhaltungsmedium auf.

In ähnlicher Weise saugen Sie das Medium aus dem Kapillarkanalauslass ab und füllen die Einlassbehälter täglich mit endothelialem Wartungsmedium auf. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden humane induzierte pluripotente Stammzellen verwendet, um ein funktionelles in vitro Modell des Glomerulus zu entwickeln, indem vaskuläre Endothelzellen und Podozyten vermehrt wurden. Am Tag 21 nach der Podozyteninduktion und der vaskulären Endothelausbreitung exprimierten die Zellen innerhalb der Chips Linienidentifikationsmarker wie Podocin und Nephrin für Podozyten, VE Cadherin und PECAM-1 für vaskuläre Endothelzellen.

Sowohl die Podozyten- als auch die vaskulären Endothelzellschichten exprimierten Kollagen IV, das am häufigsten vorkommende GBM-Protein im Nierenglomerulus. Die Glomerulus-Chips filtern selektiv kleine Moleküle wie Inulin aus der Kapillare in den Harnkanal und verhindern, dass große Proteine wie Albumin den Kapillarkanal verlassen, was eine selektive molekulare Filtrationsfunktion zeigt. Während der endothelialen Induktion an den Tagen vier bis sieben kann eine Zunahme der Zellzahl zu einer sekundären Zellschicht führen, aber eine Übersaat kann zu einer Aggregation führen, die die Differenzierung behindern kann.

Ein unerwarteter Flüssigkeitsquerfluss zwischen den Harn- und Kapillarkanälen kann bei unzureichender Verklebung der PDMS-Chipkomponenten, Verstopfung des Flüssigkeitsströmungspfads oder beeinträchtigter Filterbarriere beobachtet werden. Bei der Aussaat von Endothel und Epithel und der Pflege der Späne ab Tag 15 ist es wichtig, bei jedem Schritt visuell auf Luftblasen in den Kanälen zu prüfen. Im isogenen Glomerulus-Chip können klinisch relevante Wirkstoffkandidaten verabreicht werden, um ihr therapeutisches Potenzial oder ihre Toxizität zu testen.

Diese Technik eröffnet nun Möglichkeiten, die genetischen Grundlagen menschlicher Nierenerkrankungen zu verstehen und personalisierte Therapeutika zu entwickeln.