Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung vieler neurophysiologischer Phänomene, die nicht gut verstanden werden, wie z.B. die Übertragung von Nervenblockaden nach Hochfrequenz- / Hochamplitudenstrominjektion, während Interferenzen durch andere Prozesse in einem lebenden Körper verhindert werden. Diese Technik liefert hochgradig wiederholbare, robuste Ergebnisse und ist praktischer als die In-vivo-Elektrophysiologie, da komplexe Variablen wie die Tiefe der Anästhesie nicht kontrolliert werden müssen und daher die Messungen nicht beeinflussen können. Legen Sie nach einem Euthanasieverfahren unter Narkose eine weibliche Ratte auf den Seziertisch, halten Sie den Knöchel fest zwischen Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger und durchtrennen Sie die Fersensehne mit einer 12 Zentimeter langen geraden stumpfen Schere.

Machen Sie mit einer feinen Pinzette und einer Schere vorsichtige Schnitte durch die Muskelschichten in der Nähe der Mitte der Rückseite des Beins, bis der Ischiasnerv freigelegt ist. Sobald der Nerv sichtbar ist, befeuchten Sie die Höhle mit eiskalt modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer (MKHB), um zu verhindern, dass der Nerv austrocknet. Ziehen Sie mit Hämostaten die Hautlappen auf jeder Seite und halten Sie den Einschnitt für eine feinere Dissektion offen.

Ausgehend von der Position des Fersensehnenschnitts unterbrechen Sie mit einer feinen Schere den Muskel auf der medialen Seite des Beins, um den Nerv zu befreien. Halten Sie den Feuchtigkeitsgehalt in der Region mit eiskaltem MKHB aufrecht. Wenn der Nerv freigelegt wird, während Sie sich das Bein hinaufbewegen, sezieren Sie das darüber liegende Muskelgewebe.

Befreien Sie den Nerv näher an der Wirbelsäule vom Bindegewebe, bis Sie die Wirbelsäulenspalte erreichen, an der sich ein Knick im Nerv befindet. Reinigen Sie den Nerv noch nicht, da Geschwindigkeit in diesem Stadium unerlässlich ist. Um die Dissektion zu erleichtern, ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Ende des Nervs in der Nähe des Knöchels.

Dann mit einer feinen Schere den Nerv in der Nähe der Wirbelsäule verschärfen. Legen Sie den sezierten Nerv in ein mit MKHB gefülltes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und legen Sie das Röhrchen bis zum Beginn des Reinigungsvorgangs wieder auf das Eis. Füllen Sie die beschichtete Petrischale zur Hälfte mit gekühltem sauerstoffhaltigem MKHB, legen Sie dann einen sezierten Ischiasnerv in die Schale und befestigen Sie beide Enden des Nervs an der Schale, so dass der Nerv gerade ohne Knicke, Torsion oder Verdrehungen ist.

Binden Sie mit 6-0-Seidennähten oder feinem Faden einen Doppelknoten um jedes Ende des Nervs, um ein Austreten von Zytosol in den Puffer zu verhindern. Platzieren Sie die Knoten direkt neben den Insektenstiften auf der Seite, die näher an der Mitte des Nervs liegt, um ein Austreten von Nervengewebe in den Puffer zu verhindern. Entfernen Sie unter dem Mikroskop mit einer zwei Millimeter abgewinkelten Federschere und einer feinen Pinzette Fett, Blutgefäße und Muskelgewebe aus dem Nerv.

Beschneiden Sie alle Nervenäste, die nicht bei der Stimulation und Aufzeichnung verwendet werden. Ersetzen Sie den Puffer nach jeder fünften Minute der Reinigung durch frisches, gekühltes, sauerstoffhaltiges MKHB. Legen Sie den Nerv nach der Reinigung wieder in das mit Puffer gefüllte Transportrohr und legen Sie das Rohr auf Eis.

Bereiten Sie ein sauberes Zweikammer-Nervenbad vor. Platzieren Sie das Nervenbad mit Standard-Labor-Chefköpfen und Greifern unter dem Niveau der Zwei-Liter-Flasche, die auf dem Heizrührer platziert ist. Schließen Sie den Abfluss des Bades an den peristaltischen Pumpeneinlass an.

Schließen Sie den Auslass der Peristaltikpumpe an ein Rohr an, das zurück zur Pufferflasche führt. Schließen Sie den Badeinlass mit einem einstellbaren Durchflussventil an ein Rohr an und legen Sie das Rohr in die Flasche. Verwenden Sie ein Drei-Wege-Ventil mit einer Spritze, die mit dem mittleren Auslass verbunden ist, um das Rohr als Siphon für den schwerkraftunterstützten Pufferzufluss vorzubereiten.

Grundieren Sie den Siphon, indem Sie die Spritze ziehen, bis Puffer in ihn hineinfließt. Konfigurieren Sie das Ventil so, dass der Pufferdurchfluss in das Bad fünf bis sechs Millimeter pro Minute beträgt. Die Durchflussrate kann zunächst erhöht werden, um das Bad zu füllen.

Sobald der Pufferstand des Bades den Abfluss erreicht hat, legen Sie die Nerven in das Bad. Sichern Sie mit einem Insektenstift das Ende des Nervs an der Ecke der mit Puffer gefüllten Badekammer. Verwenden Sie eine um 45 Grad abgewinkelte feine Pinzette und kneifen Sie den Nerv nur an den Enden ein, fädeln Sie den Nerv vorsichtig ein, um durch das Loch in der Trennwand zwischen den beiden Badkammern stimuliert zu werden.

Sichern Sie mit einem Insektenstift das andere Ende des Nervs in der Ölkammer des Bades und stellen Sie sicher, dass der Nerv gerade ist, ohne gedehnt zu werden und frei von Knicken und Verdrehungen ist. Verwenden Sie Silikonfett, machen Sie eine Dichtung, um Pufferleckage von der Pufferkammer in die Ölkammer zu verhindern Füllen Sie die Ölkammer mit Silikon oder Mineralöl. Legen Sie die Silber/Silberchlorid-Aufzeichnungselektrodenhaken in die Ölbadkammer und sichern Sie sie mit Bossköpfen und Greifern.

Dann drapieren Sie den Teil des Nervs im Ölbad über die Haken, ohne den Nerv straff zu ziehen. Stellen Sie die Silikonfettdichtung ein oder reparieren Sie sie, wenn nach dem Bewegen des Nervs eine Leckage beobachtet wird. Verbinden Sie die Referenz-Silber-/Silberchloridelektrode mit der Verstärkermasse und platzieren Sie die Elektrode in der puffergefüllten Badkammer, indem Sie sie mit einem Laborgreifer befestigen.

Nachdem Sie eine saubere Nervenmanschettenelektrode zur Stimulation vorbereitet haben, legen Sie die Elektrode in die mit Puffer gefüllte Badekammer. Öffnen Sie mit einer Pinzette oder einer feinen Pinzette mit stumpfen oder abgewinkelten Spitzen die Elektrode im Bad, um die Innenseite der Manschette zu benetzen. Wenn Blasen verbleiben, verwenden Sie eine feine Spritze, um Puffer aus dem Bad zu ziehen und die Blasen aus der Manschette zu drücken.

Öffnen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Manschette und schieben Sie sie unter den Nerv. Schließen Sie die Manschette um den Nerv und vermeiden Sie ein Knicken oder Verdrehen des Nervs. Schließen Sie die Stimulationselektrode und die Stromrücklaufelektrode an den Stimulator an.

Wenn Sie eine quadratische Platinplatte als Stromrücklaufelektrode verwenden, positionieren Sie die Folie vom Nerv im Bad weg. Sichern Sie die Leitung beider Elektroden mit Band. Schließen Sie den TTL-Signalausgang des Stimulators an Kanal vier des Oszilloskops an.

Drücken Sie auf dem Oszilloskopbildschirm die Registerkarte Triggerkanal und geben Sie Kanal vier als auslösenden Kanal an. Stellen Sie den Triggerpegel mit dem Pegelregler auf ein Volt ein. Stellen Sie auf dem Oszilloskop die Zeitauflösung auf eine Millisekunde pro Division und die Spannungsauflösung auf 10 Millivolt pro Division ein.

Zentrieren Sie die Triggerreferenz in der Zeit und stellen Sie den Triggerpegel auf ein Volt ein. Nachdem Sie den Stimulator an den Computer angeschlossen haben, schalten Sie den Stimulator ein, indem Sie das Batterienetzteil an den Stromeingang anschließen. Starten Sie dann die MATLAB-Software auf dem Computer.

Führen Sie das benutzerdefinierte MATLAB-Skript aus. Öffnen Sie dann das angegebene MATLAB-Skript. Bearbeiten Sie das Skript und stellen Sie die Parameter Stimulatorpulsamplitude auf minus 300 Mikroampere, Stimulatorpulsbreite auf 300 Mikrosekunden, Stimulatoranzahl der Impulse auf 10 und Stimulatorzeit zwischen den Impulsen auf eine Sekunde ein.

Starten Sie das Stimulationsprotokoll, indem Sie in der Software auf Ausführen klicken. Das zusammengesetzte Aktionspotential (CAP) hatte eine Peak-to-Peak-Amplitude von einem Millivolt an der Elektrode und 100 Millivolt, wenn es verstärkt wurde. Hier wird die typische Nervenerregbarkeit für Standard-Platin-Nervenmanschetten und maßgeschneiderte leitfähige Elastomer-Nervenmanschetten gezeigt.

Die CAP, die ex vivo über einen Tag von Experimenten mit beiden Ischiasnerven erhalten wurde, ist hier dargestellt. Eine minimale CAP-Amplitudenreduktion wurde mit dem rechten Ischiasnerv beobachtet. Im Gegensatz dazu ähnelte die CAP-Amplitude des linken Ischiasnervs bei etwa drei Millivolt der des rechten Ischiasnervs zu Beginn des Experiments mehr als sechs Stunden nach der Nervenextraktion.

Betonen Sie Präzision und Wiederholbarkeit bei der Sezier-, Reinigungs- und Implementierungstechnik. Achten Sie darauf, was im Bad passiert. Wenn das Nervensignal verloren geht, kann es einfach sein, dass die Elektroden nicht im guten Kontakt sind oder dass sich Kochsalzlösung in der Badeöltrennwand befindet, und nicht, dass der Nerv abgestorben ist.

Erstmalige Benutzer könnten versucht sein, sich zu beeilen, besonders während der Sezierphase. Dies wird wahrscheinlich zu Fehlern führen und den Nerv schädigen. Präzision und Konsistenz sind hier der Schlüssel und führen zu qualitativ hochwertigeren Ergebnissen.

Besonderes Augenmerk sollte auch auf die Konsistenz bei der Puffervorbereitung gelegt werden.