Name: Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Lernen Sie die chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden mit Salicylphosphorchloridit und Pyrophosphat. Diese Methode ermöglicht die Synthese von 5'-triphosphorylierten Oligonukleotiden beliebiger Sequenz, Länge und Rückgratchemie, einschließlich nicht-natürlicher L-RNA für biotechnologische Anwendungen.

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Die Autoren danken Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski und Katrina Tjhung für nützliche Diskussionen über Best Practices für chemische Triphosphorylierungsreaktionen und Gerald Joyce für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium MCB 2114588 der National Science Foundation unterstützt.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Triphosphorylierungsverfahren ist weitgehend kompatibel mit der Oligonukleotidsynthese unter Verwendung der Standard-Phosphoramid-Chemie. Nukleosidphosphoramidite sollten basenlabile Schutzgruppen aufweisen, die mit einer schnellen Deprotektion in AMA39 kompatibel sind, einschließlich der Standard-β-Cyanoethyl auf dem Phosphit und Isobutyryl-, Dimethylformamidyl-, Acetyl-, Phenoxyacetyl- oder 4-Isopropylphenoxyacetylgruppen auf den exocyclischen Aminen der Nukleobasen. Ribose-2'-Hydroxylgruppen sollten durch Silylschutzgruppen geschützt werden, entweder t-Butyldimethylsilyl (TBDMS) oder Tri-iso-Propylsilyloxymethyl (TOM)40,41. Es wurde auch berichtet, dass die basenlabile Pivaloyloxymethylgruppe (PivOM) mit der chemischen Triphosphorylierung30 kompatibel ist.
Für die chemische Triphosphorylierung von synthetischen Oligonukleotiden 28,29,30,31,32,33,34,35 wurden mehrere Verfahren beschrieben. Wir haben festgestellt, dass die Triphosphorylierung mit dem Ludwig-Eckstein-Reagenz37 eine der zugänglichsten ist, die keine spezielle Synthese von Reagenzien und keine spezielle Ausrüstung erfordert. Oligonukleotid-5′-Triphosphate, die nach dieser Methode hergestellt wurden, wurden routinemäßig als Substrate für RNA-Ligase-Ribozyme verwendet, einschließlich der Verwendung von enzymatisch unzugänglichen L-RNA-Oligonukleotidtriphosphaten, um eine vorlagenabhängige Synthese und Replikation dieser "spiegelbildlichen" Nukleinsäurezu erreichen 14,16,17,18 . Die Methode eignet sich auch zur Herstellung von kleinen 5′-triphosphorylierten Stammschleifen-RNAs, die potente Aktivatoren der angeborenen Immunantwort bei Wirbeltierensind 6,7.
Das Ludwig-Eckstein-Reagenz, Salicylphosphorochloridit37, ist sehr reaktiv gegen Wasser und fängt effektiv jegliches Wasser ab, das beim Auflösen des Reagenzes vor dem Laden auf die Oligonukleotidsäule eingeführt wird. Nach diesem Punkt reagiert das 5′-phosphitylierte Oligonukleotid jedoch bevorzugt mit jeglichem Wasser, das über Pyrophosphat in das System eingeführt wird, und bildet nach Aufarbeitung 28,37,38 ein 5′-H-Phosphonat-Nebenprodukt. Die sorgfältige Herstellung von Triphosphorylierungsreagenzien und die Triphosphorylierungsreaktionskammer stellen sicher, dass dieses Nebenprodukt nicht gebildet wird. Für die Lösungsmitteltrocknung werden Molekularsiebe vom Typ 4 Å in Teflonbeuteln, die mit den meisten organischen Lösungsmitteln kompatibel sind, unter verschiedenen Markennamen von den meisten Oligonukleotidsynthese-Reagenzienunternehmen vorverpackt verkauft. Zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, wie die Durchführung einer Triphosphorylierung in einem Handschuhfach unter wasserfreier Atmosphäre, sind in der Regel nicht erforderlich.
Die Reaktion des 5′-phosphitylierten Oligonukleotids mit TBAP bildet ein cyclisches 5′-Trimetaphosphitphit-Zwischenprodukt, das dann unter Verwendung einer Oligonukleotidsynthese-Oxidationslösung (Jod in Wasser/Pyridin/THF) zu dem cyclischen 5′-Trimetaphosphat oxidiert wird. Es sollte beachtet werden, dass kommerzielle Oxidationslösungen unterschiedliche Mengen an Jod verwenden, und es ist wichtig, die hohe Jodkonzentration von 0,1 M zu verwenden, um eine vollständige Oxidation des Triphosphats zu gewährleisten. Das cyclische Produkt wird in derselben Lösung37 zu dem endgültigen linearen 5′-Triphosphat hydrolysiert, und es müssen alternative, wasserfreie Oxidationslösungen verwendet werden, wenn eine Linearisierung mit anderen Nukleophilen als Wasser gewünscht ist (Anwendungen siehe unten)33. Jedes verbleibende cyclische Trimetaphosphat wird jedoch während der anschließenden alkalischen Deprotektion des Oligonukleotids linearisiert. Die Hydrolyse des cyclischen 5′-Trimetaphosphats ergibt nur das lineare und nicht das verzweigte Triphosphat 37,46.
Der Oligonukleotid-Deschutz muss in der Regel nicht modifiziert werden, um eine 5′-Triphosphorylierung aufzunehmen, aber es sollten einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Das Triphosphat ist relativ stabil gegenüber einer kurzen Exposition gegenüber alkalischen Bedingungen, aber es sollte darauf geachtet werden, dass das Triphosphat nicht länger als nötig AMA ausgesetzt wird. Der Schutz von Gruppen, die eine längere Behandlung in Ammoniak oder AMA für mehr als 10 Minuten bei 65 ° C benötigen, sollte vermieden werden. Schonendere Behandlungen, wie 2 h in Ammoniak bei Raumtemperatur, sind akzeptabel, wenn sie mit anderen Phosphoramidit-Schutzgruppen kompatibel sind. Eine gängige, schnelle Detektionsmethode für Silyl-geschützte synthetische RNA-Oligonukleotide verwendet Triethylamintrihydrofluorid und Hochtemperatur47; Dies sollte jedoch bei der Herstellung von RNA 5′-Triphosphaten vermieden werden, da die anhaltenden sauren Bedingungen die Triphosphathydrolyse31,32 beschleunigen.
Preparative PAGE hat sich als die einfachste und zuverlässigste Methode zur Nachreinigung von 5′-triphosphorylierten Oligonukleotiden erwiesen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Die präparative Umkehrphasen-HPLC kann jedoch auch zur Reinigung von triphosphorylierten Produkten eingesetzt werden. Das Vorhandensein von 5′-Diphosphat und, in geringerem Maße, 5′-Monophosphat-Produkten wird routinemäßig beobachtet, wenn die Triphosphorylierung durch Massenspektrometrie nachgewiesen wird. Wir haben eine 5′-Triphosphatfragmentierung während der Massenspektrometrie aus hochreinem Material beobachtet, das durch chemische Synthese oder Transkription hergestellt wurde, insbesondere wenn das Instrument nicht für die Analyse von Oligonukleotiden optimiert ist. Dennoch zeigt die RP-LC-Analyse häufig, dass 10%-20% des 5′-Diphosphat-Nebenprodukts in längeren 5′-triphosphorylierten Oligonukleotiden vorhanden sind (Abbildung 4). Kommerzielle Zubereitungen von Tributylammoniumpyrophosphat können mit bis zu 20% Monophosphat kontaminiert werden, was bei der Triphosphorylierung 5′-Diphosphat als Nebenproduktergibt 30,31. Eine sorgfältige Vorbereitung dieses Reagenzes im eigenen Haus kann viel mehr reine TBAP-Beständeergeben 31. Wir haben jedoch festgestellt, dass Oligonukleotide, die mit kommerziellen TBAP-Quellen triphosphoryliert wurden, immer noch eine vergleichbare oder größere Reaktivität aufweisen, wenn sie als Substrate in enzymatischen Reaktionen verwendet werden (Abbildung 5B), verglichen mit Material, das durch In-vitro-Transkription hergestellt wurde.
Eine bemerkenswerte weitere Verwendung der Oligonukleotid-Triphosphorylierung mit dem Ludwig-Eckstein-Reagenz nutzt das cyclische Trimetaphosphit-Zwischenprodukt33. Wird der anschließende Oxidationsschritt mit 1 M t-Butylperoxid in Hexanen durchgeführt, das häufig zur Oligonukleotidoxidation unter wasserfreien Bedingungen verwendet wird, erfolgt die Oxidation des Phosphits ohne Ringöffnungshydrolyse, wodurch das cyclische Trimetaphosphat entsteht. Dieses Zwischenprodukt kann dann mit primären Amin- oder Alkoholnukleophilen umgesetzt werden, um 5′-Triphosphate mit Modifikationen am γ-Phosphat zu erhalten. Zu diesen Modifikationen gehört die Zugabe eines lipophilen Tags, der durch eine Phosphoramidatbindung verbunden ist, was eine schnelle triphosphatspezifische Reinigung durch RP-LC ermöglicht, gefolgt von einer sauren Hydrolyse des Tags aus dem Triphosphat33. Fluoreszierende Modifikationen an der γ-Phosphat-Position können auch für den Einsatz als Echtzeit-Fluoreszenzreporter für Ribozym-katalysierte Ligationsreaktioneneingeführt werden 15,33.

Die 5′-triphosphorylierte Form der RNA ist in der Biologie allgegenwärtig, da sie durch RNA-Transkription in allen Bereichen des Lebens und durch RNA-Replikation während des Lebenszyklus vieler RNA-Viren erzeugt wird. Diese Triphosphate dienen als Substrat für die Bildung von 7-Methylguanylat-gekappter mRNA in Eukaryoten und spielen daher eine wesentliche Rolle bei der Proteinexpression1. Im Gegensatz dazu wird das Triphosphat in Bakterien und Viren zurückgehalten; Somit werden RNA 5′-Triphosphate von angeborenen Immunitätsreaktionsregulatoren in Eukaryoten 2,3,4,5,6,7 erkannt. Außerhalb der Biologie wurde eine Vielzahl von RNA-Ligase-Ribozymen entwickelt, um das 5′-Triphosphat in vitro8 zu verwenden und für die Verwendung in diagnostischen Assays 9,10,11,12,13,14,15 modifiziert. Ein solches Ribozym kann für die vorlagenabhängige Synthese von L-RNA, dem nichtbiologischen "spiegelbildlichen" Enantiomer der natürlichen D-RNA, aus kleinen L-RNA-Oligonukleotid-5′-Triphosphaten16,17,18 verwendet werden. Die routinemäßige Herstellung von triphosphorylierten Oligonukleotiden unterschiedlicher Sequenz und Rückgratzusammensetzung ist für die Untersuchung dieser Systeme unerlässlich.
Die gebräuchlichste und zugänglichste Methode zur Herstellung von RNA-5′-Triphosphaten im Labor ist die In-vitro-Transkription. Die mit dieser Methode hergestellte RNA ist jedoch in Sequenz und Größe durch die Promotor- und Substratanforderungen des RNA-Polymerase-Enzyms eingeschränkt. T7-RNA-Polymerase und spezialisierte Derivate sind die am häufigsten verwendeten Polymerasen für diesen Zweck 19,20,21,22. In vitro transkribierte RNA, die mit diesen Enzymen hergestellt wird, muss mit einem 5'-terminalen Purin initiiert werden und ist stark auf Purine in den ersten 10 Nukleotiden23,24 ausgerichtet. Darüber hinaus ist der enzymatische Einbau von Basen- oder Rückgrat-modifizierten Nukleotiden bestenfalls ineffizient und mit natürlichen Polymerasen häufiger unmöglich, was die Möglichkeit einschränkt, Oligonukleotid-5′-Triphosphate herzustellen, die aus etwas anderem als natürlicher D-RNA bestehen. Ein weiterer limitierender Faktor ist, dass RNA, die durch In-vitro-Transkription erzeugt wird, eine erhebliche 5′- und 3′-Heterogenität aufweisen kann und als extrem heterogene Produkte produziert wird, wenn sie kürzer als 20 nt23,24,25,26,27 ist.
Im Gegensatz dazu kann die chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden, die durch Festphasenphosphoramiditsynthese 28,29,30,31,32,33,34,35 hergestellt werden, verwendet werden, um Oligonukleotid-5′-Triphosphate 3-50 nt Länge beliebiger Sequenz herzustellen. Darüber hinaus kann eine breite Palette von Nukleinsäuremodifikationen, die für die Phosphoramiditensynthese zugänglich sind, vor der 5′-Triphosphorylierung 14,15,16,17,18,29,36 an Oligonukleotide angehängt werden. Viele dieser Methoden verwenden das Phosphitylationsreagenz Salicylphosphorochloridit, das von Ludwig und Eckstein für die Lösungsphasentriphosphorylierung von Mononukleosiden37 entwickelt wurde. Die Triphosphorylierung von Oligonukleotiden mit diesem Reagenz erfolgt in der festen Phase durch Phosphitylierung des Oligonukleotids 5′-hydroxyl, Umwandlung in das Triphosphat durch Reaktion mit Pyrophosphat und Oxidation, gefolgt von Standardverfahren zur Spaltung des Oligonukleotids aus dem festen Träger, Deprotektion und Reinigung (Abbildung 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schema für die Triphosphorylierung von synthetischen Oligonukleotiden. Im ersten Schritt wird das Oligonukleotid 5ʹ-hydroxyl mit SalPCl phosphityliert. Im nächsten Schritt wird der 5'-Salicylphosphit mit TBAP zum cyclischen Metaphosphit umgesetzt, dann im dritten Schritt oxidiert, um das cyclische 5'-Trimetaphosphat in DNA/RNA-Synthesizer-Oxidationslösung (0,1 M Jod/Pyridin/H2O/THF) zu erzeugen, das schnell hydrolysiert wird, um das lineare 5'-Triphosphat in derselben Lösung28,33 zu erhalten. 37. Die anschließende alkalische Spaltung aus der festen CPG-Unterstützung und Deprotektion des Oligonukleotids in wässrigem MeNH2 / Ammoniak hydrolysiert jedes verbleibende cyclische Trimetaphosphat in die lineare Form. Abkürzungen: SalPCl = Salicylphosphorochloridit; TBAP = Tributylammoniumpyrophosphat; THF = Tetrahydrofuran; CPG = kontrolliertporiges Glas; MeNH2 = Methylamin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Obwohl frühe veröffentlichte Berichte mit dieser Methode oft unter schlechten Erträgen und unerwünschten Nebenprodukten litten28,37,38, ist die sorgfältige Aufrechterhaltung wasserfreier Bedingungen alles, was notwendig ist, um routinemäßig hohe Erträge zu erzielen. Dies kann durch eine sorgfältige Vorbereitung von Reagenzien und die Verwendung einer einfachen Reaktionsvorrichtung erreicht werden, die aus Standard-Kunststoffkomponenten zusammengesetzt ist. Hier demonstrieren wir die geeigneten Schritte zur chemischen Triphosphorylierung von Oligonukleotiden, einschließlich der Herstellung von Reagenzien, der Montage der Reaktionskammer, der Triphosphorylierungsreaktion und der anschließenden Deprotektion und Reinigung der triphosphorylierten Oligonukleotide. Ebenfalls enthalten ist die repräsentative Verwendung von 5′-triphosphorylierten Oligonukleotiden als Substrate für Ligase-Ribozyme zur Synthese größerer Nukleinsäureprodukte mit natürlicher D-RNA und abiotischen L-RNA-Rückgraten.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Polyethersulfon-Spritzenvorsatzfilter</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Spritzenvorsatzfilter zur Entfernung von zerkleinerten Polyacrylamid-Gelpartikeln (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m PTFE-Spritzenvorsatzfilter</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>Spritzenvorsatzfilter zur Entfernung von CPG-Harz (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>1 mL Kunststoffspritzen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Bestandteile der Triphosphorylierungsapparatur (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>1,4-Dioxan, wasserfreies</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>Triphosphorylierungslösungsmittel (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>2-Chlor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on, Salicylphosphorochloridit (SalPCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>Triphosphorylierungsreagenz (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>30-ml-Glasflaschen</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Flaschen zur Herstellung von Triphosphorylierungslösungsmitteln und TBAP-Lösung (Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhahn, Polycarbonat/Polypropylen</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>Bestandteil einer Triphosphorylierungsvorrichtung (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>40%ige Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung, 19:1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>für PAGE (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Acetonitril, wasserfrei, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Lösungsmittel zur Triphosphorylierung (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Ammoniak-Neutralisationsfalle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 und ANS121</td><td>Zur Verwendung mit Speedvac DNA130 (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Für PAGE, Katalysator für die Acrylamidpolymerisation (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Wässriges Ammoniak, 28 %</td> <td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>Zur Herstellung eines AMA-Entschützungsreagenzes (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Wässriges Methylamin, 40 %</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Zur Herstellung eines AMA-Entschützungsreagenzes (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Automatisierter DNA/RNA-Oligonukleotid-Synthesizer</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA/RNA-Synthesizer</td><td>Jeder säulenbasierte Synthesizer ist akzeptabel (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>Bead-Capture-Magnet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Für die Streptavidin-Bead-Capture (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>Für PAGE Harnstoff-Ladepuffer (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Tiefvakuum-Ölpumpe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Zur Verwendung mit Lyophilisator (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Trockenmittel Drierit-Trockenmittel, 10-20 mesh</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Trockenmittel zur Lagerung von Triphosphorylierungschemikalien und -geräten (Abschnitte 1&ndash; 2)</td></tr><tr><td>D-RNA 27,3 t kreuzchirale Polymerase</td><td>, hergestellt im Haus18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCAUAG GUCGAAAAAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACC-3&prime;</td><td>Bei crosschiralen Ribozymreaktionen (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>D-RNA CPG Vollstützen, 1.000 μM, vorverpackt 1 & Mikro; Molsynthesesäulen</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>repräsentativ, für die D-RNA-Oligonukleotidsynthese (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>D-RNA TOM-geschützte Phosphoramidite</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>repräsentativ, für die D-RNA-Oligonukleotidsynthese (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>Leere Expedite Synthesis Säulen, 1&micro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Synthesesäulen zur Verwendung mit dem Expedite DNA/RNA-Synthesizer (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N&prime;-(3-Propansulfonsäure), feste</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Ribozym-Reaktionspufferkomponente (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), fester</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Divalenter Metallionenchelator zur Verwendung in verschiedenen Puffern ( Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Filter für Expedite-Synthesesäulen</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Expedite-Synthesesäulenfilter für die Verwendung mit leeren Synthesesäulen (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>Fluoreszierender/phosphoreszierender Gelscanner</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Zur Visualisierung von analytischer PAGE (Abschnitte 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Formamid, deionisiert</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>Für PAGE Formamid-Gel-Ladepuffer (Abschnitte 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software zur Quantifizierung von Gelbildern</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Zur Quantifizierung von gescannten Gelbildern (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Glasexsikkator</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Lagerung von Lösungsmitteln zur Triphosphorylierung (Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>L-RNA CPG Feststoffträger, 1.000 μM,</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>L-RNA-Oligonukleotidsynthese (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>L-RNA-Hammerhai-Template</td><td>, hergestellt im Haus18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>Bei crosschiralen Ribozymreaktionen (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>L-RNA-Primer</td>, <td>hergestellt im Haus18</td><td>5&prime;-fluorescein-GGCUCGA-3&prime;</td><td>Bei crosschiralen Ribozymreaktionen (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM-geschützte Phosphoramidite</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-RNA-Oligonukleotidsynthese (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>Lyophilisator/Gefriertrockner</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>Zur Konzentration von Oligonukleotiden (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat, fest</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Für Ribozymreaktionen (Abschnitte 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid, wasserfreies</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>Triphosphorylierungslösungsmittel (Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>NAP-25 Entsalzungssäule (Sephadex G-25 Harz)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Einweg-Chromatographiesäulen mit Sephadex G-25 Harz (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Nicht entkernende Edelstahlnadel, 20 g</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Nadeln zum Durchstechen von Gummisepten (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Oligonukleotid-Extinktionskoeffizienten-Rechner Integriertes</td><td>DNA-Technologien</td><td>OligoAnalyzer-Tool</td><td>Nearest-Neighbor-Modell Kurzes Oligonukleotid 260-nm-Extinktionskoeffizienten-Rechner (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Oxidationsmittellösung, 0,1 M Jod in THF/Pyridin/Wasser</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>Triphosphorylierungsreagenz (Abschnitt 4)</td></tr><tr><td>PAGE-Platten</td><td>Timberrock/CBS</td><td>NGP-250-BO und NO</td><td>Für PAGE (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>PAGE-Netzteil</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>für PAGE (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>PAGE-Abstandshalter und -Kämme (analytisch)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725 und VGC-0714</td><td>Für PAGE (Abschnitte 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>PAGE Abstandshalter und Kämme (präparativ)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R und VGC-3001</td><td>Für PAGE (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>PAGE Ständer</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>Für PAGE (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>Wachsversiegelungsfolie für Triphosphorylierungsgeräte (Abschnitte 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>Für kreuzchirale Ribozymreaktionen (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>PD 10 Entsalzungssäule (Sephadex G-10 Harz)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Einweg-Chromatographiesäulen mit Schwerkraftflussgrößenausschluss mit Sephadex G-10 Harz, für Oligonukleotide < 15 nt (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Phosphor-Screens</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>Zur Visualisierung von 32P-markierter RNA (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Reagenzien für die Phosphoramidit-Synthese</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>repräsentativ, für die Standard-RNA/DNA-Synthese (Abschnitt 1)</td></tr><tr><td>Verschließbares Röhrchen aus Polypropylen</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss und Silikon-O-Ring, für sichere AMA-Entschützung ( Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Pyridin, wasserfreies</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Lösungsmittel für die Triphosphorylierung (Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie/Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Kommerzieller Service für LC/MS mit Spezialisierung auf Oligonukleotide (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Gummisepten (ID x AD 7,9 mm x 14 mm), weißes</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Septen zur Herstellung von Triphosphorylierungslösungsmitteln und TBAP (Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>Selbstreplikator-Ribozym E</td>, <td>hergestellt im Haus14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime;</td><td>Bei Selbstreplikator-Ribozym-Reaktionen (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Selbstreplikatorsubstrat A</td>, <td>hergestellt im Haus14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>Für Selbstreplikator-Ribozymreaktionen (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Selbstreplikatorsubstrat B, transkribiert</td><td>im Haus hergestellt14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>Bei Selbstreplikator-Ribozym-Reaktionen (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Kleine Trocknungsfallen, 4 & Molekularsiebe</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>Trocknungsfallen für DNA/RNA-Synthesizer, Phosphoramidite und Triphosphorylierungsreagenzien (Abschnitte 1&ndash; 2)</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl), festes</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>Salz zur Verwendung in verschiedenen Puffern (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH), festes</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>Salz zur Verwendung in verschiedenen Puffern (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software zur Anpassung statistischer Daten</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Zum Anpassen von Daten aus analytischen PAGE an kinetische Modelle (Abschnitt 6)</td></tr><tr><td>Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Zum Einfangen von Biotin-markierter RNA in crosschiralen Ribozymreaktionen (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>Für PAGE-Harnstoffbeladungspuffer (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>TBE Laufpuffer, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>für PAGE (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Tetrabutylammoniumfluorid, 1,0 M Lösung in Tetrahydrofuran</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>Zur Entfernung von 2&prime;-Silyl-Schutzgruppen (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>Zur Polymerisation von Acrylamid für PAGE (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Tributylamin</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Triphosphorylierungsreagenz (Abschnitt 2)</td></tr><tr><td>Tributylammoniumpyrophosphat (TBAP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Tris-Base</td></tr> <tr><td></td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Puffermittel zur Verwendung in verschiedenen Puffern (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 Polysorbat-Reinigungsmittel</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Neutrales Reinigungsmittel zur Verwendung mit magnetischen Kügelchen (Abschnitt 7)</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>Für PAGE- und Gel-Ladepuffer (Abschnitte 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>Zur Messung von Oligonukleotidkonzentrationen (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Vakuumzentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Vakuumkonzentrator</td><td>Zur Entfernung von AMA und THF (Abschnitt 5)</td></tr><tr><td>Xylolcyanol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>Für PAGE-Harnstoffladepuffer (Abschnitt 5)</td></tr></tbody></table>

chemische triphosphorylierung von oligonukleotiden

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

Das 5′-Triphosphat ist eine essentielle Nukleinsäuremodifikation, die während des gesamten Lebens vorkommt und zunehmend als funktionelle Modifikation von Oligonukleotiden in der Biotechnologie und der synthetischen Biologie eingesetzt wird. Oligonukleotid-5′-triphosphate wurden in der Vergangenheit in vitro mit enzymatischen Methoden hergestellt. Diese Methoden beschränken sich jedoch auf natürliche RNA-Oligonukleotide, haben starke Sequenzpräferenzen und neigen dazu, heterogene Produkte herzustellen. Neue Methoden der chemischen Triphosphorylierung ergänzen sowohl die reduzierten Kosten der automatisierten Oligonukleotidsynthese durch Phosphoramidchemie als auch die vielfältigen Nukleotidmodifikationen, die jetzt verfügbar sind. Somit ist nun die Synthese von Oligonukleotidtriphosphaten beliebiger Sequenz und Länge, die gegebenenfalls verschiedene nichtnatürliche Modifikationen enthalten, zugänglich.
In diesem Beitrag werden die geeigneten Methoden und Techniken zur chemischen Triphosphorylierung von Oligonukleotiden unter Verwendung von Salicylphosphorochloridit und Pyrophosphat vorgestellt. Diese Methode verwendet kommerziell erhältliche Reagenzien, ist mit den meisten Oligonukleotiden kompatibel, die mit Standard-Festphasensynthesemethoden hergestellt werden, und kann in 2 h nach der Oligonukleotidsynthese vor Deprotektion und Reinigung abgeschlossen werden. Es werden zwei Anwendungen von chemisch triphosphorylierten Oligonukleotiden als Substrate für katalytische RNA-Enzyme demonstriert, darunter die Synthese einer spiegelbildlichen Version des Hammerkopf-Ribozyms aus nichtbiologischen L-RNA-Triphosphaten.

Oligonukleotide sollten unter Verwendung von Standardprotokollen synthetisiert werden, die für die Phosphoramidite und den automatisierten DNA/RNA-Synthesizer geeignet sind, wobei das Produktoligonukleotid von der festen Stütze in der ursprünglichen Kunststoffsynthesesäule entfernt wird, wobei die 5ʹ-terminale Dimethoxytritylgruppe entfernt wird, um das freie 5ʹ-Hydroxyl zu erhalten (Abschnitt 1). Alle in dieser Demonstration verwendeten Oligonukleotide wurden unter Verwendung von 1.000 Å kontrolliertem Porenglasharz (CPG) als festem Träger hergestellt und auf der 0,2- oder 1-μmol-Skala durchgeführt. Repräsentative Beispiele für Synthesizersäulen, Harze, Reagenzien und Phosphoramidite finden Sie in der Materialtabelle. Bei Reaktionen größeren Maßstabs müssen möglicherweise Volumina und Zeiten, die in nachfolgenden Schritten verwendet werden, angepasst werden.
Die Triphosphorylierungsreaktion wird in einer speziell angefertigten Reaktionskammer (Abbildung 2, Abschnitt 3) unter Verwendung von handelsüblichen Standardkomponenten, die in der Materialtabelle aufgeführt sind, durchgeführt und folgt dem in Abbildung 1 (Abschnitt 4) 28 dargestellten Schema. Es ist wichtig, dass die Bedingungen während der Triphosphorylierung streng wasserfrei gehalten werden und dass alle Lösungsmittel und Reagenzien im Voraus über Molekularsieben hergestellt und vor der Verwendung vollständig getrocknet werden (Abschnitt 2). Die Triphosphorylierung dauert in der Regel 2 Stunden, und danach kann die gewaschene und getrocknete Säule gemäß den Standardverfahren zur Deprotektion und Reinigung von Oligonukleotiden behandelt werden (Abschnitt 5).
Nach der Deprotektion werden Oligonukleotidtriphosphate durch Denaturierung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt, wobei durch UV-Rückschatten, die aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert werden können, ein einziges Hauptproduktband gezeigt wird. Das 5′-Triphosphat-Produkt lässt sich leicht von reaktionsseitigen Produkten für kurze Oligonukleotide trennen, wie für DNA-Trinukleotid-5'-Triphosphate, pppAAA und pppCCC und L-RNA-Trinukleotid 5ʹ-triphosphat pppGAA in Abbildung 3A,B gezeigt. Sowohl die 5′-Hydroxyl- als auch die 5′-Triphosphat-Produkte für AAA- und CCC-DNA-Trimer wurden massenspektrometrie ausgeschnitten und identifiziert und in Abbildung 3A entsprechend markiert. Zusätzliche Banden, wie sie für das AAA-DNA-Trimer sichtbar sind, enthalten im Allgemeinen nicht genügend Material, um sich zu erholen und zu identifizieren. Das Vorhandensein dieser Banden korreliert jedoch mit zusätzlichen Produktmassen in den ungereinigten Reaktionsprodukten (Abbildung 3C), die typischerweise 5′-Diphosphat-, Monophosphat- und H-Phosphonat-Nebenprodukte darstellen, wie unten erörtert.
Nach der PAGE-Reinigung können größere Oligonukleotide mit der Crush-and-Soak-Methode42 und anschließender Ethanolfällung eluiert werden. Oligonukleotide unter 15 nt können jedoch nicht effizient mit Ethanol ausgefällt werden und erfordern daher ein modifiziertes Verfahren zur Gelelution (Schritt 5.11.3). Die in der Materialtabelle aufgeführte Ausschlussspalte für Einweggrößen ist nur für die Verwendung mit Oligonukleotiden von mehr als 10 NT zugelassen. Wir haben jedoch festgestellt, dass Oligonukleotide, die so kurz wie Trimere sind, mit dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll effektiv entsalzt werden können. Dennoch wird empfohlen, beim Entsalzen kurzer Oligonukleotide (wie in den Schritten 5.6 und 5.11.3) das Säuleneluat in Fraktionen zu sammeln und Produktfraktionen durch Absorption bei 260 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer zu identifizieren. Eine für kürzere Oligonukleotide optimierte Größenausschlussspalte wird in der Materialtabelle als alternative Wahl bereitgestellt. Die Endausbeute aus der Oligonukleotidsynthese im 1-μmol-Maßstab nach der Reinigung beträgt 50-300 nmol.
Die Triphosphorylierung kann durch Massenspektrometrie bestätigt werden, wobei das triphosphorylierte Produkt eine Masse von +239,94 Da größer als das 5′-Hydroxyloligonukleotid aufweist, obwohl häufig das Vorhandensein von Materialien beobachtet wird, die dem 5′-Di- und Monophosphat (+159,96 bzw. +79,98 Da) entsprechen. Ein 5′-H-phosphonat-Nebenprodukt mit einer Masse von +63,98 Da aus der 5′-OH-Masse kann ebenfalls beobachtet werden, und hohe Konzentrationen dieses Produkts deuten darauf hin, dass die Bedingungen während der Triphosphorylierung nicht ausreichend wasserfrei waren. Vor der Reinigung zeigen degeschützte Oligonukleotide typischerweise alle diese Produkte (Abbildung 3C), während gereinigtes Material einen Peak aufweist, der dem 5′-Triphosphatprodukt zusammen mit 5′-Di- und Monophosphaten entspricht (Abbildung 3D,E).
Die Massenspektrometrie allein ergibt aufgrund der unterschiedlichen Ionisationsraten und der Fragmentierung des Triphosphats während der Ionisation typischerweise kein strenges Maß für die Reinheit von 5′-Triphosphat. Zur Messung der Reinheit des Endprodukts werden die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und das Tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS) empfohlen, insbesondere bei längeren Oligonukleotiden. Die Analyse der D-RNA 5ʹ-Triphosphate pppACGAGG und pppGAGACCGCAACUUA mittels RP-LC/ESI-MS (Abbildung 4A,B) zeigt eine typische Endproduktreinheit, die 20% 5ʹ-Diphosphat enthält, da diese beiden Spezies schwer zu trennen sind, wenn sie auf längeren Oligonukleotiden vorhanden sind.
Synthetische 5′-Triphosphat-Oligonukleotide funktionieren typischerweise genauso gut oder besser als Materialien, die in biochemischen Studien enzymatisch hergestellt werden. In Abschnitt 6 wurden beispielsweise 5′-Triphosphat-14-nt-RNA-Substrate, die entweder synthetisch oder durch In-vitro-Transkription hergestellt wurden, in einer RNA-katalysierten Selbstreplikationsreaktion 14,15,43,44,45 verglichen. Ribozym E katalysiert die Verbindung der Substrate A und B, um eine neue Kopie von E in einer autokatalytischen Reaktion zu erhalten, die exponentielles Wachstum ermöglicht (Abbildung 5A). E- und 32P-markierte A-Komponenten wurden durch In-vitro-Transkription hergestellt, und triphosphoryliertes Substrat B wurde entweder synthetisch, wie oben beschrieben, oder durch In-vitro-Transkription 14 hergestellt. Der Fortschritt der Selbstreplikationsreaktion wurde überwacht, indem periodische Proben entnommen wurden, die durch Denaturierung von PAGE analysiert und über einen fluoreszierenden/phosphoreszierenden Gelscanner quantifiziert wurden. Die resultierenden Daten, die zu einer logistischen Wachstumsfunktion passen, zeigten, dass entweder transkribiertes oder synthetisches B-Substrat exponentielles Wachstum unterstützt, aber synthetisches B eine etwas größere Menge an Produkt liefert (Abbildung 5B). Dieses Ergebnis könnte die Heterogenität der Zusammensetzung am 5'-Ende der durch In-vitro-Transkription hergestellten RNA widerspiegeln23,24.
Die chemische Triphosphorylierung ermöglicht auch die Synthese von Oligonukleotidtriphosphaten, die weder in vitro noch in Zellen biologisch hergestellt werden können. In Abschnitt 7 wurden nichtbiologische Oligonukleotidtriphosphate aus L-RNA, dem Enantiomer der natürlichen D-RNA, hergestellt wie in den Abschnitten 1-5, als Substrate für die D-RNA "cross-chirale" Polymerase-Ribozyme 27.3t verwendet (Abbildung 6A), die die vorlagengerichtete Polymerisation eines längeren L-RNA-Produkts aus kurzen L-RNA-Oligonukleotid-5′-Triphosphaten in sequenzallgemeiner Weise katalysiert. Beispielsweise kann das Ribozym eine L-RNA-Version des Hammerkopf-Selbstspaltungsmotivs synthetisieren (Abbildung 6B)18. Gereinigte L-RNA-Trinukleotidtriphosphate wurden mit einem Fluorescein-markierten L-RNA-Primer und L-RNA-Template kombiniert (Abbildung 6C) und mit der kreuzchiralen Ligase reagiert. Die Proben im Verlauf der Reaktion wurden von PAGE analysiert und mit einem fluoreszierenden/phosphoreszierenden Gelscanner abgebildet, um die Synthese einer L-RNA-Version des von der Vorlage kodierten Hammerkopf-Ribozyms zu demonstrieren (Abbildung 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Abbildung 3: Reinigung von Trinukleotid-5ʹ-triphosphaten. (A) PAGE-Analyse (visualisiert durch UV-Rückschatten) der Triphosphorylierung der DNA-Trinukleotide Tri-Desoxyadenosin (AAA, blau) und Tridesoxycytidin (CCC, rot), absichtlich überladen, um kleinere Nebenprodukte sichtbar zu machen. Sowohl das 5'-Triphosphat-Produkt (ppp) als auch das 5ʹ-hydroxyl (OH)-Ausgangsmaterial wurden von MALDI-MS herausgeschnitten und identifiziert. (B) Präparative PAGE der Triphosphorylierung von L-RNA-Trinukleotid GAA, wobei die Hauptproduktbande ausgeschnitten und von ESI-MS als 5ʹ-Triphosphat (ppp) identifiziert wurde. (C) MALDI-MS von rohen Reaktionsprodukten nach Deprotection und (D) gereinigte Produkte von (A). 5ʹ-Triphosphat (ppp; pppAAA erwartet 1.119 Da, beobachtet 1.118 Da; pppCCC erwartet 1.047 Da, beobachtet 1.046); 5ʹ-diphosphat (pp), 5ʹ-monophosphat (p), 5ʹ-hydroxyl (OH) und 5ʹ-H-phosphonat (Hp) sind gekennzeichnet. (E) Dekonvolutes Massenspektrum aus ESI-MS mit Direktinjektion von isoliertem 5ʹ-Triphosphat-Produkt aus (B), wobei identifizierte Peaks markiert sind (erwartete 1 181,6 Da, beobachtet 1 181,0 Da). 5'-Diphosphat (pp)-Produkte werden ebenso beobachtet wie Natriumionenpeaks sowohl für die Tri- als auch für die Diphosphatprodukte (+22 Da). Häufige Schadstoffspitzen sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Zur Vereinfachung des Vergleichs wurden Massenspektren auf die höchste in jedem Spektrum gemessene Intensität normalisiert und als Prozentsatz relativ zu diesem Wert angegeben. Abkürzungen: PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese; MALDI-MS = matrixgestützte Laserdesorption/-ionisation; ESI-MS = Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Abbildung 4: Analytisches RP-LC von 6 nt und 14 nt D-RNA Oligonukleotidtriphosphaten . (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ und (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3'. Tandem ESI-MS identifizierte den Hauptpeak beider (~ 70%) als 5ʹ-Triphosphat (ppp), mit geringeren Mengen des 5ʹ-Diphosphats (pp). Abkürzungen: RP-LC = Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie; nt = Nukleotide; ESI-MS = Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Abbildung 5: Vergleich von Oligonukleotid-5'-triphosphat-Substraten, die durch chemische Synthese oder In-vitro-Transkription hergestellt wurden . (A) Das selbstreplizierende Ribozym E ligiert RNA A und 5′-triphosphorylierte RNA B. (B) Vergleich von Selbstreplikationsreaktionen unter Verwendung von 10 μM A und 10 μM B, entweder synthetisch (offene Kreise) oder in vitro transkribiert (gefüllte Kreise). (B) Die Daten wurden an die logistische Wachstumsgleichung angepasst: [E] = a / (1 + b e-ct), wobei a der Endertrag, bder Grad der Sigmoidizität und c die exponentielle Wachstumsrate ist. Die Wachstumsraten für die beiden Reaktionen waren mit 1,14 h-1 identisch, während das endgültige Ausmaß für Reaktionen mit synthetischem B um 10% höher war<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Abbildung 6: Kreuzchirale L-RNA-Polymerisation mit einem Ribozym. (A) Das D-RNA 27.3t Polymerase-Ribozym, das die vorlagenabhängige Ligation der L-RNA katalysiert. (B) Das durch 27,3 t synthetisierte L-RNA-Produkt ist Teil eines Hammerkopf-Endonuklease-Motivs. (C) L-RNA-Polymerisation, katalysiert durch 27,3 t unter Verwendung einer biotinylierten L-RNA-Vorlage (braun), eines endmarkierten L-RNA-Primers (Magenta) und vier synthetisch hergestellten L-RNA-Trinukleotidtriphosphaten (Cyan). (D) PAGE-Analyse von Erweiterungsprodukten von (B) bei 4 h und 24 h, wobei jeder Trinukleotideinbau bis zum Produkt in voller Länge (schwarzer Punkt) gezeigt wird. Nicht umgesetzter L-RNA-Primer ist als Referenzmarker enthalten. Abkürzungen: PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese; M = Referenzmarker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Oligonukleotid-5′-Triphosphate sind allgegenwärtige Bestandteile in essentiellen biologischen Signalwegen und werden zunehmend in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Hier beschreiben wir Techniken zur routinemäßigen Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotid-5′-Triphosphaten, ausgehend von Oligonukleotiden, die durch automatisierte Standardsynthesetechniken hergestellt werden.

Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Die Triphosphorylierung ist eine allgegenwärtige 5'-Modifikation von RNA in der Biologie und wird zunehmend in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die 5'Triphosphorylierung eines beliebigen Oligonukleotids, das durch automatisierte Standardsynthese hergestellt wird. Die chemische Triphosphorylierung funktioniert an Oligonukleotiden, die RNA, DNA oder nicht-natürliche Nukleinsäure enthalten.Hier wird triphosphorylierte linkshändige L-RNA, das Enantiomer der biologischen D-RNA, gereinigt synthetisiert und in einer Ribosomenreaktion eingesetzt. Die Triphosphorylierung erfolgt nach automatisierter Oligonukleotidsynthese und vor Deprotektion. Diese Schritte werden hier nicht gezeigt, aber die Forscher sollten mit Standardmethoden für beide vertraut sein.Stellen Sie zunächst sicher, dass der Arbeitsbereich für die Phosphorylierung über einen Gasverteiler mit mindestens zwei Leitungen und den Blasen verfügt, der mit einer trockenen Argonquelle mit einstellbarem Druck verbunden ist, da die Triphosphorylierungsreaktion unter Argon durchgeführt werden muss. Befestigen Sie dann eine Milliliter-Kunststoffspritze an den Leitungen, um den Anschluss an den Reaktionsapparat zu erleichtern. Als nächstes sammeln Sie die Ausrüstung einschließlich eines Milliliters Kunststoffspritzen, eines Drei-Wege-Polypropylen-Absperrhahns, nicht entkernenden Nadeln, 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen, eines kleinen Metallspatels und lagern Sie sie in einem versiegelten Behälter oder Exsikkator mit einem Trockenmittel bei Raumtemperatur für mindestens einen Tag vor dem Gebrauch.Unter Argondruck 30 Milliliter wasserfreies 1,4-Dioxan aus einer verschlossenen Flasche entnehmen. In eine getrocknete 30-Milliliter-Glasflasche geben und eine Trockenfalle hinzufügen. Mit Gummisepten versiegeln und in einem Exsikkator mit Trockenmittel aufbewahren.In ähnlicher Weise bereiten Sie 30 Milliliter N, N-Dimethylformamid, Acetonitril und die Mischung aus drei Teilen Dioxan und einem Teil Pyridin nach Volumen vor. Bereiten Sie TBAP-Lösung vor, indem Sie festes Tributylammoniumpyrophosphat mit Dimethylformamid und Tributylamin in einer 30-Milliliter-Glasflasche mischen, wie im Manuskript beschrieben. Fügen Sie drei Zeichenfallen hinzu.Verschließen Sie die Flasche mit einem Gummiseptum unter Argon und blasen Sie mit Argon für 30 Minuten. Nach der Herstellung eines Oligonukleotids mit einem freien 5'hydroxyl auf einer Synthesesäule mit einem automatisierten DNA/RNA-Synthesizer. Bereiten Sie die Kammer vor, indem Sie den Kolben aus einer trockenen Ein-Milliliter-Spritze entfernen.Schneiden Sie die Oberseite der Spritze mit einer Schere oder einer Rasierklinge ab und befestigen Sie die Spritze an der Synthesesäule. Befestigen Sie den Drei-Wege-Absperrhahn an der Oberseite der Spritze und befestigen Sie den seitlichen Einlass des Absperrhahns mit dem Bubbler an der trockenen Argonquelle, so dass der obere Einlass des Absperrhahns als Reagenzieninjektionsanschluss fungiert. Befestigen Sie diese Bediener an einem Ständer mit Klemmen und dichten Sie alle vorgeschalteten Verbindungen mit Wachsdichtfolie ab.Stellen Sie dann den Absperrhahn so ein, dass der Einspritzanschluss geschlossen ist und die Vorrichtung zur Argonquelle hin offen ist. Schließen Sie den Bubbler und lassen Sie Argon bei niedrigem Druck fünf Minuten lang durch die Aktionskammer strömen. Nachdem Sie den Bubbler wieder geöffnet haben, befestigen Sie eine Spritze an der Unterseite der Synthesesäule, bei der es sich um die Abfallspritze handelt.Als nächstes ziehen Sie Argon wiederholt mit der Abfallspritze durch die Säule und befestigen Sie dann die Spritze wieder, wobei der Kolben vollständig eingedrückt ist. Um ein Reagenz oder Lösungsmittel hinzuzufügen, befestigen Sie eine Nadel an der trockenen Argonquelle und führen Sie sie in das Reagenz- oder Lösungsmittelflaschenseptum ein, wobei Sie darauf achten, dass die Nadel nicht in den Flascheninhalt eingetaucht wird. Setzen Sie dann eine Trockenspritze mit einer Nadel zusammen und führen Sie sie in das Reagenz- oder Lösungsmittelflaschenseptum ein, ohne sie in den Flascheninhalt zu tauchen.Füllen Sie anschließend die Spritze mit Argon, ziehen Sie die Nadel aus dem Septum und stoßen Sie das Argon aus. Nachdem Sie die Spritze mit Argon gefüllt und noch einmal ausgestoßen haben, füllen Sie die Spritze mit dem erforderlichen Volumen an Lösungsmittel oder Reagenz unter Argondruck. Stellen Sie den Absperrhahn so ein, dass die Argonquelle geschlossen und der Einspritzanschluss geöffnet ist.Sobald der Stopp am Gerät schnell eingestellt ist, entfernen Sie die gefüllte Spritze und die Nadel aus der Quellflasche, wischen Sie das Lösungsmittel ab, das an der Seite oder Spitze der Nadel haftet, und führen Sie die Nadel dann in den Injektionsanschluss ein. Nachdem ein Reagenz in die Antikammer der Bediener ausgestoßen wurde, entfernen Sie die Nadel und schließen Sie die Injektionsöffnung, während Sie das Gerät wieder für die Argonquelle öffnen. Ziehen Sie die Flüssigkeit vorsichtig aus der Antikammer durch die Synthesesäule mit der Abfallspritze, so dass die gesamte Flüssigkeit nun in der Abfallspritze gehalten wird.Schieben Sie nun die Lösung langsam wieder in die Synthesesäule, um sicherzustellen, dass sich keine Gasblasen in der Säule befinden. Zum Mischen oder Rühren ziehen Sie die Lösung vorsichtig mit der Abfallspritze über die Säule auf und ab. Um ein Reagenz oder Lösungsmittel aus der Säule zu entfernen, ziehen Sie die Lösung langsam in die Abfallspritze.Nachdem der Großteil der Lösung in die Abfallspritze gelangt ist, ziehen Sie Argon durch, um das verbleibende Lösungsmittel aus der Säule zu spülen. Als nächstes entfernen Sie die Wachsdichtungsfolie um die Abfallspritzenfuge. Entfernen Sie dann die Spritze und entsorgen Sie die Abfalllösung.Ersetzen Sie anschließend die Abfallspritze durch eine neue Trockenspritze und verschließen Sie die Verbindung erneut. Nach dem Zusammenbau der Triphosphorylierungsvorrichtung beginnen Sie die Triphosphorylierungsreaktion, indem Sie 200 Mikroliter Pyridindioxan in die Antikammer geben, wie zuvor gezeigt. Aber ziehen Sie die Probe noch nicht auf die Synthesesäule.Nachdem SalPCl wie im Manuskript beschrieben in Dioxan gelöst wurde, fügen Sie es der Antikammer hinzu und laden Sie es mit einer Trockenspritze auf die Synthesesäule. Lassen Sie es dann 15 Minuten lang reagieren und entfernen und entsorgen Sie dann die SalPCl-Lösung mit einer Abfallspritze, wie zuvor gezeigt. Unmittelbar nach dem Entfernen der SalPCl-Lösung 250 Mikroliter TBAP-Lösung in die Antikammer geben und auf die Synthesesäule laden.Lassen Sie es 20 Minuten mit Rühren reagieren und verwerfen, wie zuvor beschrieben. Danach wurde die Säule mit 0,5 Millilitern N, N-Dimethylformamid, dann 0,5 Milliliter Acetonitril gewaschen und das Lösungsmittel nach jeder Zugabe entfernt. Nach Zugabe der Oxidationslösung, dem Entfernen und erneuten Waschen der Säule mit Acetonitril nach dem gleichen Verfahren zerlegen Sie die Apparatur und waschen die Säule mit fünf Millilitern Acetonitril.Anschließend trocknen Sie die Säule. Spalten Sie das triphosphorylierte Oligonukleotid vom festen Träger und entfernen Sie den Schutz mit Standardprotokollen, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes das getrocknete ungeschützte Oligonukleotid in Harnstoff-Ladepuffer gelöst, auf 80 Grad Celsius erhitzt, dann auf ein Polyacrylamid-Gel geladen und ein bis zwei Stunden bei 25 bis 35 Watt laufen lassen.Am Ende der Gelelektrophorese, nach dem Entfernen der Gelplatte, zerlegen Sie sie und wickeln Sie das Gel in Polyvinylchloridfolie. Als nächstes identifizieren Sie die Produktbänder durch Rückbeschattung mit 254 Nanometer UV-Licht und entfernen Sie das Hauptproduktband mit einer Rasierklinge. Zerkleinern Sie das ausgeschnittene Gel, indem Sie es durch eine Kunststoffspritze oder mechanisch extrudieren.Bei Oligonukleotiden, die kürzer als 15 Nukleotide sind, im dreifachen Gelvolumen von nukleasefreiem Wasser für mindestens 12 Stunden mit Bewegung oder Schütteln eluieren. Entfernen Sie dann feste Gelstücke, indem Sie die Lösung durch eine Spritze führen, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist, und konzentrieren Sie sich durch Lyophilisation. Entfernen Sie nach der Konzentration Restsalze und Salutschüsse mit einer Einweg-Größenausschlusssäule und konzentrieren Sie sich durch Lyophilisation, wie zuvor gezeigt.Nach der Herstellung von 10 Mikrolitern einer RNA-Lösung, die Polymerase-Ribozym und L-RNA-Primer-Schablone und Triphosphat-Trinukleotide enthält, wie im Manuskript beschrieben, wird es geglüht, indem es für eine Minute auf 90 Grad Celsius erhitzt und in einem PCR-Thermocycler auf 23 Grad Celsius bei 0,2 Grad Celsius pro Sekunde abgekühlt wird. Nachdem Sie die RNA-Lösung bei 17 Grad Celsius inkubiert haben, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 Mikroliter der doppelten Konzentration des Startpuffers hinzufügen, während die Reaktion fortschreitet, nehmen Sie 10 Mikroliter Aliquots und löschen Sie mit fünf Mikrolitern 0,5 molar EDTA bei pH 8 und verarbeiten Sie jede Probe, um RNA zu isolieren, wie im Manuskript beschrieben. Lösen Sie die ausgefällte RNA in 10 Mikrolitern formalisiertem Gelladepuffer auf und bereiten Sie den nicht umgesetzten endmarkierten Primer wie im Text beschrieben vor.Sobald die Proben vorbereitet sind, auf 80 Grad Celsius erhitzen. Laden Sie fünf Mikroliter der Probe in jede Vertiefung und lassen Sie das Gel mit 40 Watt für ungefähr 40 Minuten laufen. Nachdem Sie die Gelplatte aus dem Ständer entfernt haben, scannen Sie mit einem fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Gelscanner, um kreuzchirale L-RNA-Extensionsprodukte zu visualisieren.Nach der Gelreinigung zeigt die UV-Rückbeschattung das Vorhandensein von 5'Triphosphat als einzelnes Hauptprodukt, wie es für AAA- und CCC-DNA-Trimere und GAA L-RNA-Trimere gezeigt wurde. Das 5'hydroxyl-Nebenprodukt ist oft als langsamer wanderndes Band sichtbar, das isoliert und durch Massenspektrometrie für DNA-Trimer identifiziert wurde. Zusätzliche Banden während der Gelreinigung korrelieren mit 5'diphosphat, Monophosphat und H-phosphonat-Nebenprodukten in der Massenspektrometrie der ungereinigten Reaktionsprodukte.5'Triphosphatprodukte zeigen einen primären Massenpeak, der dem 5'triphosphat zusammen mit 5'di und Monophosphatmassen entspricht. Chemisch triphosphatverwandte L-RNA-Trinukleotide wurden mit einem L-RNA-Primer und einer L-RNA-Vorlage in einer von PAGE analysierten und mit einem fluoreszierenden Gelscanner abgebildeten RNA-Polymerisationsreaktion verwendet. Das erweiterte Produkt, das durch schwarze Kreise markiert war, demonstrierte die Synthese einer L-RNA-Version des von der Vorlage kodierten Hammerkopf-Ribozyms.Die Exposition gegenüber Wasser während der Triphosphorylierung verringert die Ausbeute. Befolgen Sie die Schritte zur Herstellung von Trockenreagenzien und zur sorgfältigen Montage des Reaktionsapparates. Bewegen Sie Flüssigkeiten langsam durch das Gerät, um einen Bruch der Dichtungen zu vermeiden.Die chemische Triphosphorylierung ist für die Herstellung nicht-biologischer Oligonukleotidtriphosphate, einschließlich linkshändiger RNA, unerlässlich. Dies hat eine kreuzchirale Ribozymsynthese der spiegelbildlichen Versionen von RNA-Molekülen ermöglicht, die in der Biologie gefunden wurden.

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