Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Mit den vorgestellten mikrofluidischen Geräten können wir dynamische Wechselwirkungen zwischen Pilzen und anderen Mikroben mit präziser räumlicher und Umgebungskontrolle sowie hochauflösender Bildgebung auf Einzelzellebene untersuchen. Wichtig ist, dass das Pilzwachstum innerhalb des mikrofluidischen Kanals begrenzt und gelenkt werden kann. Ermöglicht qualitativ hochwertige Zeitrafferbilder.

Daher kann die Komplexität von Pilz-Pilz- und Pilz-Bakterien-Interaktionen erforscht werden. Das Verständnis mikrobieller Wechselwirkungen von Pilzen ist ein wesentlicher Schritt zur Definition und Erhaltung des Bodenmikrobioms. Dieses Wissen kann für die Entwicklung neuartiger Biokontrollmittel mit nachhaltiger Landwirtschaft genutzt werden.

Bereiten Sie zunächst etwa 40 Gramm Poly(dimethylsiloxan) oder PDMs vor, indem Sie die Base und den Härter im Verhältnis 10 zu 1 mit einem Spatel in einem sauberen Plastikbecher gründlich mischen. Um alle Luftblasen zu entfernen, stellen Sie den Becher für eine Stunde in eine Vakuumkammer. Als nächstes befestigen Sie die Master-Form mit klarem Klebeband in einer Kunststoffhalterung und verwenden Sie komprimierte gefilterte Luft, um Staubpartikel zu entfernen, dann gießen Sie die PDMs auf die Mitte der Master-Form und lassen Sie sie absetzen.

Um die Ablagerung von Staubpartikeln auf der PDM-Oberfläche zu verhindern, bedecken Sie die Masterform locker mit einem Kunststoffdeckel, geben Sie dann die Masterform in einen Ofen und härten Sie über Nacht bei 70 Grad Celsius aus. Nachdem Sie die Master-Form aus dem Ofen genommen und abkühlen lassen, schälen Sie die ausgehärteten PDMs von der Master-Form und dem Kunststoffrahmen weg, ohne die Master-Form in den PDMs zu beschädigen. Um eine staubfreie Oberfläche zu erhalten, legen Sie klares Klebeband über die Mikrokanäle, die in die PDMs geprägt sind.

Als nächstes verwenden Sie eine montierte Guillotine oder eine Rasierklinge, um die PDMs in Platten zu schneiden, wie vom Design vorgesehen. Stellen Sie beim Schneiden der seitlichen Öffnung der PDMs-Platte, die für das bakteriell-pilzliche Interaktionsgerät oder BFI-Gerät verwendet wird, sicher, dass die Mikrokanäle vollständig geöffnet sind. Bei PDMs-Platten, die bei der Montage des Pilz-Pilz-Interaktionsgeräts (FFI) verwendet werden, sollte jedoch jede Ecke so zugeschnitten werden, dass sie in eine Petrischale mit Glasboden passt.

Als nächstes verwenden Sie einen Präzisionsschneider, um Einlass- oder Auslasslöcher entsprechend dem Gerätedesign zu stanzen. Als nächstes tauchen Sie die PDMs-Platten in eine 0,5-molare Natriumhydroxidlösung. Spülen Sie die Platten in sterilem doppelt destilliertem Wasser ab, bevor Sie sie in eine 70%ige Ethanollösung überführen.

Nachdem Sie das Ethanol entfernt und die Platten erneut mit doppelt destilliertem sterilem Wasser gespült haben, tauchen Sie die Platten fünf Minuten lang in steriles doppelt destilliertes Wasser und Ultraschall, entfernen Sie dann die PDMs-Platte aus dem Wasser, trocknen Sie sie mit komprimierter gefilterter Luft und legen Sie sie in eine sterile quadratische Petrischale. Als nächstes brüten Sie die Petrischale mit PDMs-Platte in einem Ofen bei 70 Grad Celsius für eine Stunde. Sobald die Brammen in einer staubfreien Umgebung abgekühlt sind, entfernen Sie Staub von ihrer Oberfläche mit Klebeband und komprimierter gefilterter Luft.

Um die Oberflächen der PDM-Platten und Glasboden-Petrischalen zu aktivieren, die anschließend miteinander verbunden werden, legen Sie sie in einen Plasmareiniger, wobei die zu aktivierenden Oberflächen nach oben zeigen. Nachdem Sie die PDMs-Platte in den Petrischalen aus dem Plasmareiniger entfernt haben, verbinden Sie sie sanft, indem Sie die aktivierten Oberflächen in konformen Kontakt miteinander bringen. Bond BFI und FFI PDMs Platte mit Petrischalen von 35 Millimeter bzw. 55 Millimeter Durchmesser, um die erfolgreiche Verklebung zu überprüfen, versuchen Sie, das PDMs-Labor von seiner Petrischale mit einer Pinzette zu ziehen.

Visualisieren Sie das Gerät sorgfältig mit dem Auge oder durch generische Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Impfeinlässe oder Mikrokanäle nicht kollabieren. Für wassergesättigte oder nährstoffreiche Bedingungen pipettieren Sie 100 Mikroliter der gewünschten Lösung, um BFI-Geräte unmittelbar nach dem Verkleben zu füllen. Für FFI-Geräte fügen Sie 30 Mikroliter des Mediums in jeden Einlass hinzu.

Zum Schluss fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter steriles doppelt destilliertes Wasser in die Petrischale hinzu, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Für ungesättigte Wasserbedingungen fügen Sie jedoch einfach 100 bis 200 Mikroliter steriles doppelt destilliertes Wasser in die Petrischale hinzu, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Für die Pilzimpfung entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube mit einem sterilisierten Korkbohrer einen Agarstopfen aus einer Kolonie am Rande einer drei Tage alten Kultur, um sicherzustellen, dass die wachsende Hyphenfront intakt bleibt.

Dann führen Sie den Agarplug in den Pilzeinlass des BFI- und / oder FFI-Geräts ein, wobei die Myzelseite in der Hyphenfront auf die Mikrokanalöffnungen ausgerichtet ist, um die Hypheninfiltration der Kanäle zu fördern. Für das FFI-Gerät führen Sie einen weiteren Agarstopfen mit einer zweiten Pilzart in den gegenüberliegenden Einlass ein. Als nächstes verschließen Sie die Petrischale mit einer transparenten Folie und inkubieren Sie sie bei 25 bis 28 Grad Celsius im Dunkeln bis zur Bildgebung.

Für die bakterielle Impfung pipettieren Sie nach dem Entfernen des BFI-Geräts aus dem Inkubator 10 Mikroliter einer bakteriellen Suspension in den bakteriellen Einlass in einer sterilen Umgebung. Sobald die Petrischale mit einer transparenten Folie versiegelt ist, lagern Sie das Gerät aufrecht bei 25 Grad Celsius im Dunkeln, bis die Bildgebung beginnt. Mit diesem Protokoll konnte die Wechselwirkung zwischen dem Pilz Coprinopsis cinerea und dem Bakterium Bacillus subtilis erfolgreich visualisiert werden.

Es wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Bakteriums die Wachstumsrate des Pilzes nach etwa fünf Stunden Kookulation drastisch abnahm. Darüber hinaus hatten die mit den Bakterien assoziierten Pilzhyphen ein dünnes und transparentes Aussehen. Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zeigte auch einen Pilzhyphenkollaps nach fünf Stunden Koinokulation mit Bacillus subtilis.

Ab sechs Stunden begann jedoch auch die Bakterienpopulation zu sinken. Die Visualisierung von Pilz-Pilz-Wechselwirkungen zeigte, dass Fusarium graminearum das Wachstum von Trichoderma rossicum stark hemmte, was mit der Fluoreszenzmikroskopie offensichtlich war. Dieses Protokoll zeigte außerdem signifikante morphologische Veränderungen im Pilz Verticillium longisporum in Gegenwart der Bakterien Pseudomonas synxantha und Pseudomonas fluorescens.

Die in der Studie verwendete hochauflösende dynamische Bildgebungstechnik zeigte auch die Bildung von Septen in Fusarium graminearum in Gegenwart des Pilzes Clonostachys rosea. Die Fluoreszenzmarkierung ermöglichte die dynamische Quantifizierung der Proliferation von Clonostachys rosea hyphal im FFI-Gerät. Diese Geräte können vom Benutzer angepasst und modifiziert werden, um verschiedene Arten von Interesse einzubeziehen und ihre spezifischen experimentellen Fragen zu mikrobiellen Pilzinteraktionen zu beantworten.

Sowohl die BFI- als auch die FFI-Geräte haben wissenschaftliche Grenzen überschritten und gezeigt, wie Pilze Abwehrsignale und Nährstoffe beim Angriff von Pilzen, Viren und Nematoden verbreiten und Untersuchungen zur Bakterienausbreitung ermöglichen.