Name: Quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma-cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen in intakten geklärten Organen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Erfahren Sie quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma cruzi-infizierten Zellen und T-Zellen in geklärten Organen mittels Lichtscheibenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Behandlungsergebnissen bei Chagas-Krankheit.

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Wir danken Dr. Etsuo Susaki für ihre wertvolle Hilfe und Empfehlungen zu Protokollen zur Gewebereinigung und Immunfärbung. Außerdem danken wir M. Kandasamy vom CTEGD Biomedical Microscopy Core für die technische Unterstützung mit LSFM und konfokaler Bildgebung. Wir danken auch allen Mitgliedern der Tarleton Research Group für hilfreiche Vorschläge während dieser Studie.

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<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.

Das Fehlen einer umfassenden Ganzorgan-Bildgebung von Parasiten und der Immunantwort schränkt das Verständnis der Komplexität der Wirt-Parasit-Interaktionen ein und behindert die Bewertung von Therapien für die Chagas-Krankheit. Die vorliegende Studie übernahm die CUBIC-Pipeline, um intakte Organe und Gewebe von T. cruzi-infizierten Mäusen zu klären und zu färben.
In dieser Studie wurden mehrere Gewebereinigungsprotokolle getestet (PACT32, ECi 33, FLASH<sup cla...

Die Chagas-Krankheit, verursacht durch den Protozoenparasiten T. cruzi, gehört zu den am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten der Welt und verursacht jährlich etwa 13.000 Todesfälle. Die Infektion schreitet häufig von einem akuten zu einem chronischen Stadium fort, was bei 30% der Patienten zu einer Herzpathologie führt, einschließlich Arrhythmien, Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod 1,2. Trotz der starken Immunantwort des Wirts gegen den Parasiten während der akuten Phase bleiben während des gesamten Lebens des Wirts eine geringe Anzahl von Parasiten in Geweben wie Herz und Skelettmuskulatur chronisch bestehen. Mehrere Faktoren, einschließlich des verzögerten Einsetzens adaptiver Immunantworten und des Vorhandenseins nicht replizierender Formen des Parasiten, können dazu beitragen, dass T. cruzi eine vollständige Eliminierung durch das Immunsystem vermeidenkann 3,4,5,6. Darüber hinaus zeigen nicht-replizierende ruhende Formen des Parasiten eine geringe Anfälligkeit für trypanocide Medikamente und können teilweise für das in vielen Fällen beobachtete Behandlungsversagen verantwortlich sein 7,8.
Die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren bietet die Möglichkeit, Einblicke in die räumliche Verteilung der Parasiten in den infizierten Geweben und ihre Beziehung zu den an ihrer Bekämpfung beteiligten Immunzellen zu gewinnen. Diese Eigenschaften sind entscheidend für ein besseres Verständnis der Prozesse der Parasitenkontrolle durch das Immunsystem und die Verfolgung der seltenen schlafenden Parasiten, die in chronischen Geweben vorhanden sind.
Die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist eine der umfassendsten und unvoreingenommensten Methoden zur 3D-Bildgebung großer Gewebe oder Organe ohne Dünnschnitt. Lichtblattmikroskope verwenden eine dünne Lichtschicht, um nur die Fluorophore in der Fokusebene anzuregen, Photobleiche und Phototoxizität von Proben zu reduzieren und Bilder von Tausenden von Gewebeschichten mit ultraschnellen Kameras aufzunehmen. Die hohe Gewebetransparenz, die für das ordnungsgemäße Eindringen des Laserlichts in Gewebe erforderlich ist, wird durch Homogenisierung des Brechungsindex (RI) nach Gewebeentfettung und -entfärbung erreicht, wodurch die Lichtstreuung reduziert und qualitativ hochwertige Bilder erzeugtwerden 9,10,11.
Gewebereinigungsansätze wurden für die Bildgebung ganzer Mäuse 12,13,14, Organoide 15,16,17, Organe, die Reporterfluoreszenzmarker exprimieren, 18,19,20,21,22,23 und kürzlich einer begrenzten Anzahl menschlicher Gewebe entwickelt 24 . Die derzeitigen Methoden zur Gewebereinigung werden in drei Familien eingeteilt: (1) organische lösungsmittelbasierte Methoden wie die DISCO-Protokolle 25,26, (2) Hydrogel-basierte Methoden wie CLARITY27 und wässrige Methoden wie CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-Protokolle erhalten Organform und Gewebeintegrität und bewahren die Fluoreszenz endogen exprimierter Reporterproteine. Die neueste Aktualisierung dieser Technik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), erlaubt auch den Nachweis von Epitopen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper und DNA-Markierung28.
Im vorliegenden Protokoll wurde die CUBIC-Pipeline zum Nachweis von T. cruzi exprimierenden fluoreszierenden Proteinen in geklärten intakten Mausgeweben verwendet. Optisch transparente Gewebe wurden LSFM abgebildet, 3D rekonstruiert und die genaue Gesamtzahl der T. cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen pro Organ automatisch quantifiziert. Dieses Protokoll wurde auch erfolgreich übernommen, um eine einheitliche Kennzeichnung von gereinigten Organen mit Antikörpern und nukleären Färbungen zu erhalten. Diese Ansätze sind essentiell für das Verständnis der Expansion und Kontrolle von T. cruzi in infizierten Wirten und sind nützlich für die vollständige Bewertung von Chemo- und Immuntherapeutika für die Chagas-Krankheit.

<table><tbody><tr><td>1-Methylimidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon (Antipyrin</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6-Wells Zellkulturplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Anti-Maus Fab Fragment</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Anti-Kaninchen Fab-Fragment</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP-Nanobody Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&Alpha;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Maus</td><td>Der Jackson Laboratory Stamm</td><td>#007914</td><td>gebräuchlicher Name: Ai14, Ai14D oder Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J Maus</td><td>Der Jackson</td><td>Laboratory Stamm #007914</td><td>Allgemeiner Name: Ai14, Ai14D oder Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 Iodid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Maus</td><td>Der Jackson Laboratory Stamm</td><td>#032080</td><td>Häufig Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Reinigungstücher Kimwipes</td><td>&nbsp; Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D-Immunfärbekit</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D-Nuklearfärbekit</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-basierter</td><td>Gel-Sekundenkleber Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyaniniodid) Unternehmen: Biotium</td><td>Biotium #</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zentrifugenröhrchen 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Falcon Zentrifugenröhrchen 50&nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>#H3884 oder #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector Software</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Intravenöse Injektionsnadel 23-G</td><td>Sartori, Minisart Spritzenfilter</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>fusselfreie Tücher</td></tr><tr><td>Light-Sheet-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II Bildgebungssystem</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen, 10 & Mikro; L, 200 & Mikro; L und 1.000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y und T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Pipettenspender</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Eindecklösung</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-Butyldiethanolamin</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylnicotinamid</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sacrifice Perfusion System</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelinkubator</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Grüner Nukleinsäure-Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative 3d-bildgebung von trypanosoma-cruzi-infizierten zellen, ruhenden amastigoten und t-zellen in intakten geklärten organen

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Die Chagas-Krankheit ist eine vernachlässigte Pathologie, die Millionen von Menschen weltweit betrifft, hauptsächlich in Lateinamerika. Der Erreger der Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ist ein obligater intrazellulärer Parasit mit einer vielfältigen Biologie, der mehrere Säugetierarten, einschließlich des Menschen, infiziert und Herz- und Verdauungspathologien verursacht. Der zuverlässige Nachweis von T. cruzi-In-vivo-Infektionen ist seit langem erforderlich, um die komplexe Biologie der Chagas-Krankheit zu verstehen und das Ergebnis von Behandlungsschemata genau zu bewerten. Das aktuelle Protokoll demonstriert eine integrierte Pipeline zur automatisierten Quantifizierung von T. cruzi-infizierten Zellen in 3D-rekonstruierten, geklärten Organen. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die genaue Visualisierung und Quantifizierung von aktiv proliferierenden und ruhenden T. cruzi-Parasiten und Immuneffektorzellen in ganzen Organen oder Geweben. Auch die CUBIC-HistoVision-Pipeline zur einheitlichen Markierung von befreiten Organen mit Antikörpern und nuklearen Färbungen wurde erfolgreich übernommen. Die Gewebereinigung in Verbindung mit der 3D-Immunfärbung bietet einen unvoreingenommenen Ansatz zur umfassenden Bewertung von Arzneimittelbehandlungsprotokollen, zur Verbesserung des Verständnisses der zellulären Organisation von T. cruzi-infizierten Geweben und soll Entdeckungen im Zusammenhang mit Anti-T-Cruzi-Immunantworten, Gewebeschäden und Reparaturen bei der Chagas-Krankheit vorantreiben.

CUBIC fixierte Gewebe wurden mit PBS gewaschen, um Fixiermittel zu entfernen, und dann mit CUBIC-L-Cocktails inkubiert, einer basischen gepufferten Lösung von Aminoalkoholen, die Pigmente und Lipide aus dem Gewebe extrahieren, was zu einer Entfärbung des Gewebes unter Beibehaltung der Gewebearchitektur führt. Gitterlinien im Papier sind durch die Gewebe hindurch zu sehen, was auf eine entsprechende Reinigung der Organe hinweist (Abbildung 2A). Nach der Delipidierung wurden d...

Das vorliegende Protokoll beschreibt Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte softwaregestützte Methoden zur Visualisierung und genauen Quantifizierung proliferierender und ruhender Trypanosoma-cruzi-Parasiten und T-Zellen in intakten, gereinigten Organen und Geweben. Diese Techniken bieten eine zuverlässige Möglichkeit, Behandlungsergebnisse zu bewerten und neue Einblicke in Parasiten-Wirt-Interaktionen zu bieten.

Quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma-cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen in intakten geklärten Organen

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Diese Technik lieferte ein vollständigeres und 3D-Bild ganzer transparenter Organe und war nützlich für die Quantifizierung, nicht nur von replizierenden, sondern auch von ruhenden Parasiten- und Immunfaktorzellen. Diese Technik ermöglicht es uns, die spezielle Assoziation von Parasiten, Immunzellen und den durch die Infektion resultierenden Gewebeschäden zu bestimmen. Epitop-Immunfärbung und DNA-Markierung waren ebenfalls vergleichbar mit dieser Technik.Dieses Protokoll wurde effektiv zur Bewertung der Behandlungsergebnisse in Mausmodellen der Chagas-Krankheit verwendet. Eine Behandlung mit höheren Einzeldosen, die seltener über einen längeren Behandlungszeitraum verabreicht werden, eliminiert sowohl replizierende als auch ruhende Parasiten. Caleb Hawkins, ein Forschungstechniker aus Rick Tarletons Labor, demonstriert das Verfahren.Nach dem Einschläfern, Sezieren und Fixieren der Organe einer infizierten Maus, wie im Manuskript beschrieben, tauchen Sie einzelne Organe in 10 Milliliter 50% wasserverdünntem CUBIC-L ein, wobei Sie sie bei Raumtemperatur in 50-Milliliter-konischen Röhrchen leicht vor Licht geschützt schütteln. Ersetzen Sie am nächsten Tag 50% CUBIC-L durch 10 Milliliter 100% CUBIC-L und inkubieren Sie sechs Tage lang bei 37 Grad Celsius, während Sie das Röhrchen flach auf dem Shaker-Inkubator halten. Am Ende dieser Inkubationszeit sollten die Gewebe fast vollständig transparent sein.Waschen Sie die durchsichtigen Organe zweimal mit PBS für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Bei jeder Wäsche werden die Gewebe in ein neues 50-Milliliter-konisches Röhrchen überführt, um Triton X-100 zu entfernen. Für die DNA-Färbung verdünnen Sie den handelsüblichen Nukleinsäurefarbstoff in fünf Milliliter Färbepuffer bei 1: 2, 500.Dann tauchen Sie das Gewebe in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen mit Kernfarbstofflösung und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit sanfter Rotation für fünf Tage in stehender Position. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit 15 Milliliter 3D-Kernfärbungspuffer für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Berechnen Sie die erforderliche Menge an primären und sekundären Antikörpern.Mischen Sie primäre und sekundäre Antikörper in einem bernsteinfarbenen Zwei-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden. Für den Pufferaustausch mischen Sie 7,5 Milliliter 2x HV1 3D-Immunfärbungspuffer mit 7,5 Milliliter doppelt destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Gewebeprobe in den Puffer und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang bei 32 Grad Celsius unter leichtem Schütteln in einem 15-Milliliter-konischen Röhrchen in horizontaler Position.Sammeln Sie die Gewebeprobe aus dem Pufferaustauschmedium und tauchen Sie sie in die Antikörperfärbelösung. Inkubieren Sie das Gewebe eine Woche lang einzeln bei 32 Grad Celsius und schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig im Stehen, weg vom Licht. Die Gewebeproben auf vier Grad Celsius bewegen und im Stehen inkubieren.Nach dem Abkühlen des HV1 3D-Immunfärbungs-Waschpuffers auf vier Grad Celsius waschen Sie die Probe mit 15 Milliliter Puffer zweimal bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, jeweils mit leichtem Schütteln in horizontaler Position. Verdünnen Sie Formalin auf 1% in HV1 3D-Immunfärbungs-Waschpuffer und tauchen Sie die Probe 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln in acht Milliliter der Lösung. Nun inkubieren Sie die Probe in frischer 1% Formalinlösung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und waschen Sie 15 Milliliter PBS für zwei Stunden bei 25 Grad Celsius.Tauchen Sie transparente Organe unter leichtem Schütteln in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen mit fünf Milliliter 50%iger wasserverdünnter CUBIC-R+-Lösung. Ersetzen Sie es durch fünf Milliliter 100% CUBIC-R+ und inkubieren Sie es mit leichtem Schütteln für zwei Tage. Trocknen Sie die Gewebe mit Kimwipes und überführen Sie sie dann in fünf Milliliter Montagelösung in einer Sechs-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur.Kleben Sie die Gewebe mit Gel-Sekundenkleber auf den Probenhalter des Mikroskops. Tauchen Sie die Proben in die mit 120 Milliliter Montagelösung gefüllte Quarzküvette des Mikroskops. Stellen Sie sie quer zu ihrer Längsachse vor und haften am Herzen, wobei die Spitze und die Aorta horizontal ausgerichtet sind.3D-rekonstruiertes Trypanosoma cruzi-infiziertes Herz zeigte einen höheren Anteil infizierter Zellen im Vorhof im Vergleich zu Ventrikeln. Ruhende Parasiten können im Herzen identifiziert werden, wie in den 3D-vergrößerten Einsätzen dargestellt. ZsGreen1-exprimierende T-Zellen sowie Trypanosoma-cruzi-infizierte Zellen wurden im Skelettmuskel von einer CD8-Reportermaus visualisiert, die mit Trypanosoma cruzi infiziert war.3D-Zoom-Ins von 3D-rekonstruierten Bildern identifizierten T-Zellen im Bereich einer infizierten Zelle. Die Grenzfläche von T-Zellen in wirtsinfizierten Zellen wurde durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Im Herzen einer immundefizienten Maus wurden Wirtszellen nachgewiesen, die mit zwei verschiedenen Stämmen von Trypanosoma cruzi infiziert waren, und das Durchschneiden der Gewebe zeigte reichlich parasiteninfizierte Zellen in den Herzatrien in verschiedenen Gewebetiefen.Die Immundetektion des Gefäßsystems bei Trypanosoma cruzi-infiziertem und geklärtem Herzen zeigt das komplizierte Gefäßsystem des Herzens. Parasiteninfizierte Zellen konnten in den Herzvorhöfen beobachtet werden. Die Kernfärbung der Skelettmuskulatur zeigte eine Ansammlung von Kernen in Bereichen mit wenigen oder nicht nachweisbaren tdTomato-Parasiten.Die Verstärkung von tdTomato- und GFP-Parasitenreportermarkern mit Antikörpern gegen RFP und GFP sowie der gesamten geklärten Skelettmuskulatur führte zu einer starken Fluoreszenz. Die kritischen Punkte sind also die Inkubationszeit im CUBIC-Puffer, die Verdünnungs- und Inkubationszeit im DNA-Farbstoff, die Inkubationszeit in den Antikörpern und die Inkubationszeit in der gebrochenen Index-Matching-Lösung. Die Verwendung zusätzlicher Färbung mit spezifischem Antikörperfarbstoff und schneller Reaktion könnte das Potenzial dieser Technik erheblich erhöhen und den Nachweis mehrerer Zellen, Prozesse und Strukturen in intakten Organen ermöglichen.Wir haben jetzt einen besseren und vollständigeren Weg, um die Immunzellen zu erforschen, die für die Abtötung der Parasiten verantwortlich sind, die Gewebe, in denen die Parasiten chronisch persistieren, und die Verteilung der spezifischen Medikamente in die Gewebe.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen das Verfahren für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Milz mit GFP transgenen Malaria-Parasiten und die Quantifizierung der Parasiten Mobilität und die Durchblutung in diesem Organ.

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Unter Verwendung dieses Protokolls konnten wir Bild 160 um dicke Gehirnschnitte von Mäusen mit dem Parasiten Toxoplasma gondii, der Visualisierung und Analyse der räumlichen Beziehung zwischen dem encysting Parasiten und der infizierten Neuronen ermöglicht infiziert.

3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte In-vivo- Mit Toxoplasma gondii

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung eines biolumineszierenden Stammes afrikanischer Trypanosomen, um die Verfolgung von Infektionen im Spätstadium zu ermöglichen, und zeigt, wie in vivo Live-Bildgebung verwendet werden kann, um Infektionen im zentralen Nervensystem in Echtzeit zu visualisieren.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

In diesem Protokoll Eindringmittel beschrifteten T. Trypanosoma wurden in durchsichtigen Zebrafischlarven injiziert und Parasiten Motilität wurde in Vivo mit Lichtblattmikroskopie Fluoreszenz beobachtet.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Die Trypanosomen Trypanosoma Agent der Chagas-Krankheit produziert langlebige asymptomatische Infektionen, die abrupt in klinisch anerkannten Pathologie zu entwickeln. Die folgenden Forschungs-Protokoll beschreibt eine kurzfristige familienbasierte epidemiologische Studie um die T. Trypanosoma Infektion, sexuell übertragbare von übergeordneten an Nachkommen zu entwirren.

Sexuelle Übertragung von amerikanischen Trypanosomen von Männchen und Weibchen zu Naive Mates

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Erstellung eines 3D-Modells der Metabolitenverteilung während der Trypanosomatideninfektion, einschließlich Probenentnahme, Metabolitenextraktion, überblick über die Datenerfassung von Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie, 3D-Modellgenerierung und schließlich Datenvisualisierung.

Chemische Kartographie Ansätze zur Untersuchung der Trypanosomatideninfektion

Diese Studie zeigt ein detailliertes Protokoll zur Durchführung der Ultrastrukturexpansionsmikroskopie in drei in vitro Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger, der für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist. Wir schließen die optimierte Technik für Zytoskelettproteine und die Pan-Proteom-Markierung ein.

Ultrastrukturelle Expansionsmikroskopie in drei in vitro Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das den organweiten Nachweis pathogener Bakterien während der Infektion und die Quantifizierung der fluoreszierenden Reporteraktivitäten ermöglicht.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Durchführung von Arzneimittelwirksamkeitsstudien in einem biolumineszierenden Modell der Trypanosoma cruzi-Infektion , wobei der Schwerpunkt auf der Datenerfassung, -analyse und -interpretation liegt. Fehlerbehebungs- und Qualitätskontrollverfahren zur Minimierung technischer Probleme werden ebenfalls bereitgestellt.

Entmystifizierung der In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung eines Mausmodells für die Chagas-Krankheit für Wirksamkeitsstudien von Arzneimitteln

Erfahren Sie quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma cruzi-infizierten Zellen und T-Zellen in geklärten Organen mittels Lichtscheibenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Behandlungsergebnissen bei Chagas-Krankheit.

Quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma-cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen in intakten geklärten Organen (Video) | JoVE Journal

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