Zeitaufgelöste In vivo Messung der Neuropeptiddynamik mittels kapazitiver Immunsonde im Schweineherzen

Dies ist das erste Mal, dass eine Methode zur zeitaufgelösten Messung von Peptid-Transmitter-Spiegeln in vivo entwickelt wurde. Wir können Peptidtransmitterspiegel in einzelnen Probanden und diskreten Orten mit Analysen nahezu in Echtzeit messen. Schneiden Sie zuerst eine Länge von 25 Zentimetern perfluoralkoxybeschichtetem Platindraht.

Entfernen Sie dann mit einem Skalpell etwa fünf Millimeter Perfluoralkoxy-Beschichtung von einem Ende und achten Sie darauf, nicht in den Platindraht zu schneiden. Setzen Sie nun das abisolierte Ende des Platindrahtes in einen vergoldeten, einen Millimeter großen Steckerstift ein. Crimpen Sie dann mit einer Nadelzange die Verbinderstiftzähne um das abisolierte Ende des Platindrahtes und löten Sie den Platindraht an den vergoldeten Steckerstift.

Als nächstes bereiten Sie die Dopaminlösung vor, indem Sie 50 Milligramm Dopaminhydrochlorid in 50 Milliliter 10-millimolares PBS mit einem pH-Wert von sechs hinzufügen und unter Rühren mischen. Nachdem Sie das Dopamin vollständig aufgelöst haben, legen Sie die Spitze des Platindrahtes in das Gefäß, das das frisch hergestellte Dopamin-ergänzte PBS enthält. Verbinden Sie die Silberchlorid-Scheibenelektrode mit dem Erdungskanal in der Kopfstufe.

Legen Sie dann die Silberchloridscheibe in das Gefäß, das Dopamin-ergänztes PBS und Platindraht enthält. Bevor Sie fortfahren, schließen Sie einen Drahtshunt an die Referenzkanäle der Kopfstufe an. Öffnen Sie die interaktive Datenerfassungssoftware und stellen Sie ein Sawtooth-Elektroabscheidungs-Befehlspotentialprotokoll ein, indem Sie das Startpotential auf minus 0,6 Volt, das Endpotential auf 0,65 Volt, die Scanrate auf 0,04 Volt pro Sekunde und die Dauer der Abscheidung auf 420 Sekunden einstellen.

Entfernen Sie nach Abschluss der Polydopaminabscheidung das Silberchlorid-gemahlene Pellet und die Spitze des Platindrahtes aus dem Behälter. Legen Sie die Drahtspitze für zwei bis fünf Minuten in ein Mikroröhrchen, das PBS von pH 7,4 enthält, und stellen Sie sicher, dass die Drahtspitze die Seiten oder den Boden des Mikroröhrchens nicht berührt. Bereiten Sie dann die Antikörperlösung vor, indem Sie den interessierenden Antikörper mit dem PBS von pH 7,4 im Verhältnis 1:20 in einem Gefäß mit geeigneter Größe kombinieren.

Als nächstes tränken Sie die abgeschiedene Poly-Dopamin-Spitze der Platinelektrode zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in Antikörperlösung, um sicherzustellen, dass die Platindrahtspitze in Lösung suspendiert ist und nicht auf der Innenfläche des Mikroröhrchens ruht. Legen Sie die Funktionsspitze der kapazitiven Immunsonde in die Durchflusskammer und achten Sie darauf, die Spitze der Elektrode in keiner Weise zu stören, da dies die sensorische Spitze der Sonde beschädigen kann. Führen Sie vor dem ersten experimentellen Test einen TBS-Standardlauf durch, um die kapazitive Immunsondensonde zu konditionieren, und stellen Sie für das Spannungsprotokoll das positive Schrittpotential auf 110 Millivolt, das negative Schrittpotential auf minus fünf Millivolt, die Schrittdauer auf 20 Millisekunden und die Erfassungsdauer auf 600 Sekunden ein.

Als nächstes erstellen Sie die interessante Peptidlösung mit demselben TBS, um die Zusammensetzung des Superfusats aufrechtzuerhalten. Richten Sie ein vielfältiges System ein, bei dem das Superfusat zwischen TBS und peptidergänztem TBS umgeschaltet werden kann. Verwenden Sie TBS-Standardparameter und richten Sie das Peptid-Sensordatenerfassungsprotokoll ein, indem Sie die Erfassungsdauer auf 360 Sekunden einstellen.

Vor der Poly-Dopamin-Abscheidung fädeln Sie die freiliegende Spitze der Platindrahtelektrode durch eine 22-Gauge-Injektionsnadel, wobei etwa zwei Millimeter über die Nadelspitze hinaus verbleiben. Verwenden Sie eine Pinzette und biegen Sie vorsichtig die Spitze der Platindrahtelektrode, um einen Widerhaken zu erzeugen, der am Ende der Injektionsnadel hängt. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig von der Stachelspitze ab, so dass genügend Draht in den Behälter gelegt werden kann, ohne dass die Nadel die Flüssigkeit berührt, und fahren Sie mit der Dopaminablagerung fort, wie zuvor gezeigt.

Spülen Sie nun die mit Widerhaken versehene Sondenspitze mit PBS aus und legen Sie sie in die Antikörperlösung. Entfernen Sie dann vorsichtig die funktionalisierte Spitze aus dem PBS. Bewegen Sie die Injektionsnadel zur kapazitiven Immunsonde mit Widerhaken und implantieren Sie sie vorsichtig in die Region von Interesse, bevor Sie den goldenen Steckerstift in die Kopfstufe stecken.

Ziehen Sie nach der Implantation die Injektionsnadel zurück und lassen Sie die Elektrode an Ort und Stelle. Ein positiver Schritt im Befehlspotential misst den Einspeisestrom, der zur Klemmung der Sondenspannung erforderlich ist, und ermöglicht die Messung des kapazitiven Stroms. Der negative Befehlspotentialschritt entfernt das gebundene Peptid durch elektrostatische Abstoßung vom Antikörper.

Die Schrittfunktionsbefehlswellenform stellte die zeitaufgelöste iterative Detektion und Quantifizierung des Peptids dar. Die untere Spur stellte das Befehlspotential und den resultierenden Strom unter der Überfusion der Sonde in TBS dar. Die äquilibrierte kapazitive Immunsonde zeigte einen kleineren anfänglichen Zerfall und einen stabilen Ausgangswert über sechs Minuten.

Der Fluss von Neuropeptid Y in die Durchflusskammer erhöhte die kapazitiven Ströme gegenüber dem Ausgangswert. Kapazitive Immunsondenströme, die mit einer Neuropeptid-Y-Antikörper-funktionalisierten Sonde gemessen wurden, zeigten ein konzentrationsabhängiges Signal, das empfindlich auf ein neuropathogenes Neuropeptid mit niedrigem Picomol reagiert Y Für die Kalibrierung wurde für alle getesteten Konzentrationen eine Standardkurve gemessen. Die Stimulation des bilateralen Sternganglions zeigte ein erhöhtes Neuropeptid Y, wenn es mit den kapazitiven Negativkontrollströmen zusammengeplottet wurde.

Die unter Sternstimulation gemessene Noradrenalinfreisetzung zeigte eine synchrone Freisetzung mit Neuropeptid Y, die mit einer evozierten sympathischen Reaktion übereinstimmte. Die Entwicklung dieser Techniken kann intraoperative Auslesungen von Schlüsselmodulatoren der Herzaktivität liefern und so eine mögliche schnelle therapeutische oder interventionelle Anleitung bieten. Die hier vorgestellte Technik ist spezifisch für den kardiovaskulären Einsatz, jedoch ist die Technik selbst für andere physiologische Einstellungen wie Urin, Skelettmuskulatur, Nieren, Fettgewebe usw. geeignet.