Name: Herstellung hochoffenporiger Mikrokugeln (HOPMs) mittels mikrofluidischer Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung hochoffenporiger PLGA-Mikrokugeln mittels mikrofluidischer Technologie für Gewebeengineering und Arzneimittelscreening. Diese Methode ermöglicht verbesserte Zellretention und minimale Invasivität.

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SCL, YW, RKK und AZC bestätigen die finanzielle Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 und U1605225) und das Program for Innovative Research Team in Science and Technology an der Fujian Province University. YSZ wurde weder von einem dieser Programme unterstützt noch erhielt YSZ irgendeine Art von Bezahlung; stattdessen wird die Unterstützung durch das Brigham Research Institute anerkannt.

1. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie die PVA-Stammlösung im Voraus vor, indem Sie die PVA-Lösung in einem 80 °C-Wasserbad erhitzen und anschließend bei 4 °C in den Kühlschrank stellen. Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) für den experimentellen Einsatz.</li>
	<li>Die Emulsionsvorstufe wird durch Zugabe der wässrigen Gelatinelösung (1 ml, 7,5%, w/v) zur organischen Phase von PLGA (2 ml, 2%, w/v in Dichlormethan, DCM) hergestellt (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Im Allgemeinen umfasst die mikrofluidische Technologie verschiedene Phasen, um die Mikrosphären zu bilden. Die kontinuierliche oder Sammelphase umfasst ein wässriges Polyvinylalkohol (PVA, 600 ml, 1%, w/v).</li>
</ol>2. Droplet-mikrofluidische Bauelementmontage und Herstellung von PLGA-HOPMs
HINWEIS: Die für diese Baugruppe erforderlichen Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
<ol><li>Passen Sie die Tröpfchengeneratorbaugruppe an.<ol><li>Konstruieren Sie einen mikrofluidischen Co-Flow-Generator mit einer Glaskapillare (OD, 1 mm), PVC-Rohren (ID, 1 mm) und einer 26-G-Dosiernadel.</li>
		<li>Verbinden Sie die Glaskapillare mit dem Ende des PVC-Rohres und stechen Sie dann mit einer Nadel in die Verbindung der obigen Struktur.</li>
		<li>Legen Sie das andere Ende des PVC-Rohres während der Tröpfchenerzeugung in die kontinuierliche Phase. Versiegeln Sie die Lücken an der Fuge nach dem Aushärten mit UV-Kleber. HINWEIS: Die Nadel muss um 45 ° gebogen werden, um das Durchstechen am PVC-Rohr bequem zu ermöglichen, und die Nadelspitze muss in das Kapillarrohr gestreckt werden, um die koaxiale Struktur zu bilden.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die mikrofluidische Tröpfchenplattform vor.<ol><li>Verwenden Sie zwei Spritzenpumpen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze zum Laden der kontinuierlichen Phase und eine 5-ml-Spritze zur Emulsionsbildung.</li>
		<li>Stellen Sie die Durchflussraten der kontinuierlichen Phase und der Dispergierphase auf 2 ml/min bzw. 0,08 ml/min ein.</li>
		<li>Stellen Sie ein 500-ml-Becherglas in ein Eisbad und füllen Sie es mit einer vorgekühlten PVA-wässrigen Lösung (Schritt 1.1). HINWEIS: Das Ende der Glaskapillare muss in die Sammelphase eingetaucht werden. Es wird empfohlen, den Überstand der Sammelphase nach der Emulsionströpfchenbildung in der Plattform mit dem Glasstab zu rühren (1 h, 60 U/min). Emulsionströpfchen werden an der Spitze der Nadelspitze erzeugt. Im Allgemeinen beeinflusst das Messgerät der Nadel die Größe von PMs, wobei das kleinere Messgerät der kleineren Größe von PMs entspricht. Darüber hinaus korreliert der Porendurchmesser hauptsächlich mit der Porogenkonzentration, die mit entsprechender Gelatinekonzentration ansteigen kann1.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Emulgierung und Tröpfchenerzeugung durch.<ol><li>Bereiten Sie die Emulsion wie folgt vor.<ol><li>Bereiten Sie die Emulsion vor, indem Sie die wässrige Gelatinelösung sofort in die DCM-Lösung von PLGA dekantieren (Schritt 1.2) und mit dem Ultraschallgerät emulgieren (siehe Materialtabelle).</li>
			<li>Stellen Sie die Ultraschallleistung auf 400 W ein und stellen Sie die Gesamtverarbeitungszeit auf 90 s ein (Intervall 2 s, Ultraschallbehandlung 1 s), begleitet von einer ständigen manuellen Änderung der Position der Sonde.</li>
			<li>Stabilisieren Sie die resultierende Emulsion für Spritzenabsaugung und Tröpfchenerzeugung in ca. 20 min. HINWEIS: Setzen Sie die Sonde des Ultraschall-Zellschalters in die Öl-Wasser-Grenzfläche. Es wird empfohlen, die Ultraschallsonde nicht mit dem Behälter in Kontakt zu lassen.</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie die Tröpfchengenerierung durch.<ol><li>Die vorbereitete Emulsion (Schritt 2.3.1) wird nach der Ultraschallbehandlung rasch in die 5-ml-Spritze der mikrofluidischen Plattform geladen.</li>
			<li>Die instabile W/O-Emulsion (die sich im Zuge der Phasentrennung befindet) wird als diskontinuierliche Phase in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht. Verwenden Sie gleichzeitig die wässrige Lösung von PVA als kontinuierliche Phase.</li>
			<li>Sammeln Sie die Mikrokugeln mit der Emulsion am Boden des Auffangbechers (PVA, 1%, w/v), nachdem Sie die richtigen Teile der Emulsion in die mikrofluidische Vorrichtung injiziert haben.</li>
			<li>Die Probe wird zur weiteren Stabilisierung über Nacht bei 4 °C platziert.</li>
		</ol></li>
		<li>Spülen und lyophilisieren Sie die vorbereiteten Mikrosphären (PLGA-HOPMs) gemäß den folgenden Schritten. HINWEIS: Die erzeugten PLGA-HOPMs enthalten beliebige Poren im Inneren und auf der Oberfläche.<ol><li>Lagern Sie die Mikrokugeln vor der Normalisierung auf RT bei 4 °C und rühren Sie mit einem Glasstab (1 h, 60 U/min) um, um das verbleibende DCM zu entfernen.</li>
			<li>Filtrieren Sie die Sammelphase im 500-ml-Becherglas vorsichtig und waschen Sie die gesammelten Mikrokugeln dreimal mit entionisiertem Wasser, um das restliche PVA auf der Oberfläche von PMs abzuwaschen.</li>
			<li>Die PLGA-Mikrokugeln für 30 min in das 37 °C warme Wasserbad geben, um die im PLGA-Rückgrat eingewickelte Gelatine aufzulösen.</li>
			<li>Die resultierenden PLGA-HOPMs werden zweimal mit dem entionisierten Wasser gespült, um die Restgelatine zu entfernen, und für die Lyophilisation bei -80 °C für 24 h vorgekühlt.</li>
			<li>Lagern Sie die trockenen PLGA-HOPMs bei -20 °C für weitere Experimente.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bildgebung
<ol><li>PLGA-HOPMs werden auf dem Probentisch des REM (siehe Materialtabelle) bei RT abgeschieden und der Probentisch in die Sputterzelle des Magnetron-Sputters eingesetzt. Schalten Sie den Transformator und das Magnetron nacheinander ein. Führen Sie die Probe in das REM ein, nachdem sie 1 Minute lang mit Gold gesputtert wurde.</li>
	<li>Erhalten Sie die REM-Bilder, indem Sie die Beschleunigungsspannung auf 5 kV einstellen.</li>
	<li>Zusätzlich quantifizieren Sie die Partikelgröße von PLGA-HOPMs mit 100 PMs im variablen Feld der REM-Bildgebung. Messen Sie das repräsentative Ergebnis, um die Porengrößenverteilung zu quantifizieren.<ol><li>Öffnen Sie die Grafiken mit Bild J und verwenden Sie die "gerade Linie", um den Maßstabsbalken des REM-Bildes anzupassen, wodurch die Software Pixel zu Länge identifiziert.</li>
		<li>Klicken Sie auf Analysieren > stellen Sie den Maßstab ein, stellen Sie den "bekannten Abstand" auf den Maßstabsbalken des REM-Bildes ein und klicken Sie auf globale > OK.</li>
		<li>Klicken Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager... , um die Poren- oder Partikelgröße von PLGA PMs zu messen und klicken Sie auf Hinzufügen. Messen Sie die Anzahl der Proben basierend auf der Anforderung.</li>
		<li>Klicken Sie auf Messen , um die quantitativen Daten der Grafiken für die weitere Berechnung zu erhalten.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Zellkultur- und Fluoreszenzbildgebung
HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Ratten verwendet. Die Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Kultur der Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit L-Glutamin (DMEM/F-12), 10% (v/v) fetalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. Die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.</li>
	<li>Passieren Sie die Ratten-BMSCs in einem Verhältnis von 1: 2, nachdem Sie 90% des Zusammenflusses erreicht haben.</li>
	<li>Führen Sie die Zelladhäsion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Die PLGA-HOPMs mit Ethylalkohol (5 ml, 70%, v/v) inkubieren und bei 500 x g für 10 min bei RT sterilisieren.</li>
		<li>Die sterilisierten PLGA-HOPMs zweimal mit Phosphatpufferlösung waschen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die HOPMs (fünf an der Zahl) mit der Zellsuspension (5 ml, 1 x 105 Zellen/ml) in einem sterilen Zentrifugenröhrchen (50 ml) unter dynamischer Kultur für die Haftung von BMSCs an PLGA-HOPMs.</li>
		<li>Führen Sie die dynamische Kultur in einem thermostatischen aseptischen Schüttler (37 °C, 90 U/min) durch, indem Sie ein versiegeltes 50-ml-Zentrifugenröhrchen in den Shaker legen (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die dynamische Kultur zielt darauf ab, die Adhärenzrate von BMSCs auf den Gerüsten zu erhöhen, anstatt die PMs und Zellen direkt auf die Kunststoffplatte zu inkubieren. Die Zellen und PLGA PMs werden in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen gegeben, wobei das Röhrchen an einem thermostatischen aseptischen Schüttler (37 °C, 90 U/min) inkubiert und das Medium alle 2 Tage gewechselt wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie den Live- und Dead-Dual-Färbe-Assay durch.<ol><li>Spülen Sie die zellbeladenen PMs dreimal aus, um BMSCs ohne Befestigung an PLGA-HOPMs freizusetzen.</li>
		<li>Legen Sie die zellbeladenen PMs auf die 35 mm Glasbodenplatte. Fügen Sie der PBS-vorgewaschenen Probe 1 ml Färbepuffer (siehe Materialtabelle), einschließlich 1 μL Calcein-AM bzw. Propidiumiodid (PI), hinzu.</li>
		<li>Beurteilen Sie die Proben mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (siehe Materialtabelle). Schalten Sie das Anregungslicht von 488 nm und 552 nm am entsprechenden Detektor ein. Stellen Sie für die z-Overlay-Analyse die z-Breite ein, um die verschiedenen Schichten der Probe durch z-Achsenbewegung des Mikroskops zu erfassen. HINWEIS: Es ist erwähnenswert, dass die anderen Flecken angemessen für die Analyse verwendet werden können.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Strategie zur Herstellung von PLGA-basierten Architekturen, nämlich die PLGA-HOPMs. Es ist zu beachten, dass mehrere kritische Schritte sorgfältig unternommen werden müssen, einschließlich der Vermeidung der Lösungsmittelverflüchtigung von PLGA und der sanften Anpassung der Ultraschallleistung an die Zielposition während der Herstellung der Emulsion. Darüber hinaus kann der Flüssigkeitsaustritt der 20-ml-Spritze bis zu einem gewissen Grad eingestellt werden, um die Phasentrennung...

Zellbeladene Mikrosphären bieten günstige Vorteile, wie z. B. eine verbesserte Zellretentionskapazität in situ, eine effiziente Lieferung von Zellen und die anschließende Fähigkeit zur Zellproliferation in vivo1. Bis heute wurden zahlreiche Untersuchungen zur Entwicklung einer erfolgreichen Gerüststruktur durchgeführt, die eine förderliche Umgebung für Zellen für Geweberegeneration oder Drogenscreening-Anwendungen unterstützt2. Die Hypoxie-Umgebung ist jedoch in den Innenräumen aufgrund unzureichender Versorgung mit Nährstoffen / Sauerstoff und der Ansammlung von Stoffwechselabfällen oft unvermeidlich3. Um diese Probleme zu überwinden, wurden hochporöse Mikrosphären (PMs) unter Verwendung verschiedener Biomaterialien 4,5,6 entwickelt. Darüber hinaus leiden die Gerüste in dynamischer Kultur unter übermäßiger Scherspannung7, und der instabile Zustand des Kulturmediums kann die Genauigkeit von PMs brechen. Alternativ könnte Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) verwendet werden, um PMs mit guter mechanischer Festigkeit für die dynamische Kultur1 zu verarbeiten. Zum Beispiel demonstrierten wir die Co-Injektion von Maus-Myoblasten (C2C12)-beladenen hochoffenen PLGA-PMs (HOPMs) und humanen Nabelschnurvenendothelzellen (HUVEC)-beladenen Polyethylenglykol-Hohlstäbchen, um volumetrischen Muskelverlust zu heilen und eine bemerkenswerte Verbesserung der in situ Skelettmuskelregeneration zu erzielen8.
Insbesondere sind PMs durch große Oberflächen und hohe Porositäten gekennzeichnet, was von besonderem Interesse für die Zelladhäsion und das Wachstum in Richtung minimalinvasiver Zellabgabe ist9. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurden verschiedene biokompatible Materialien zur Herstellung der PMs10,11 verwendet. Diese designbaren PMs, die mit Zellen kokultiviert werden, bieten eine ausgezeichnete Adhäsion, eine beträchtliche mechanische Festigkeit und stark miteinander verbundene Fenster, die die Zellproliferation zur Reparatur beschädigter Gewebe verbessern könnten12. In diesem Zusammenhang wurden auch verschiedene Technologien zur Herstellung poröser Kugelnentwickelt 13,14. Zum einen wurden PMs mit gasbildenden Mitteln wieNH4HCO3 hergestellt, die aufgrund unzureichender Interkonnektivität 15,16,17 zurückgehalten wurden. Auf der anderen Seite wurden PMs direkt nach der Emulgierung geschert, was zu polydispersen PMs18 führte. Letztendlich ist die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie, die auf dem Emulsions-Templating-Ansatz basiert, vielleicht eine effiziente Methode zur Konstruktion von PMs, da sie oft zu Partikeln einheitlicher Größe führt19. Insbesondere hängen die morphologischen Eigenschaften der Mikrosphären oft von der Qualität der erzeugten Emulsionströpfchen (d. h. Wasser-in-Öl, W/O, oder Öl-in-Wasser, O/W) ab, was die Eigenschaften der Biomaterialien signifikant beeinflussen kann20. Es ist erwähnenswert, dass die vorgefertigte mikrofluidische Plattform zur Erzeugung der Mikrofasern oder Mikrokugeln eingesetzt werden kann. In einem Fall demonstrierten Yu et al. die Herstellung von zellbeladenen mikrofaserigen Strukturen auf der Grundlage kapillarbasierter mikrofluidischer Plattformen, die verwendet werden könnten, um zelluläre Netzwerke zur Nachahmung natürlicher Gewebe aufzubauen21. In einem anderen Fall stellten Ye et al. photonische Kristallmikrokapseln durch die Schablonenreplikation kolloidaler Siliziumdioxidkristallperlen durch mikrofluidische Technologien her, was viele Einschränkungen aktueller Techniken überwinden könnte, die eine komplexe Markierung und spezifische Vorrichtung erfordern22.
In der Tat ist die Begründung für die Verwendung dieser Technik auf verschiedene Vorteile zurückzuführen, wie z.B. die einfache Natur, die keine ausgeklügelte Ausrüstung erfordert, und die Bequemlichkeit bei der Synthese von PMs einheitlicher Größe für die Zellabgabe und Anwendungen der regenerativen Medizin. In diesem Zusammenhang können PMs mit vorgefertigten Komponenten des Emulsions-Templating bequem aus einem mikrofluidischen Gerät erhalten werden, das aus Polyvinylchlorid (PVC)-Rohren, einer Glaskapillare und einer Nadel zusammengesetzt ist. Ein W/O-Emulsionsvorläufer wird durch Homogenisieren einer wässrigen Lösung von Gelatine und einer organischen Lösung von PLGA hergestellt. Durch selektives Einspritzen des anwendbaren Teils der Emulsion in die mikrofluidische Plattform werden die PMs mit gleichmäßigen Partikelgrößen und miteinander verbundenen Poren in der gesamten Oberfläche zum Inneren hergestellt. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, die PLGA-HOPMs durch Emulsions-Templating in der mikrofluidischen Plattform herzustellen. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll eine reproduzierbare Produktion von PLGA-HOPMs ermöglicht und möglicherweise in den verwandten Bereichen des Tissue Engineering und des Arzneimittelscreenings anwendbar sein wird.

<table><tbody><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td></td><td>5 mL & 50 mL (Sterilität)</td></tr><tr><td>Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland</td><td></td><td>TCS SP8</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China</td><td>20161110</td><td>Dosiernadel in Forschungsqualität</td></tr><tr><td></td><td>Kindly, Shanghai, China</td> 26 G, ID<td></td><td>: 250 &mu; m, AD: 460 &mu; m</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA</td><td>15400054</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) mit L-Glutamin-Ethylalkohol</td></tr><tr><td></td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China</td><td>20210918</td><td>Forschungsqualität</td></tr><tr><td>Ethyl-Endiamintetraessigsäure (EDTA)-Trypsin</td><td>Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra</td><td></td><td>Trypsin (0,25%), EDTA (0,02%)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biological Industries, Kibbuz Beit-Haemek, Isra</td><td></td><td>Gefriertrockner in Forschungsqualität</td></tr><tr><td></td><td>Bilon, Shanghai, China</td><td></td><td>FD-1B-50</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA</td><td>Los # SZBF2870V</td><td>Aus Schweinehaut, Typ A</td></tr><tr><td>Glasbodenplatte</td><td>Biosharp, Hefei, China</td><td></td><td>BS-15-GJM, 35 mm</td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>Huaou, Jiangsu, China</td><td></td><td>0,9-1,1 & mal 120 mm</td></tr><tr><td>Inkubator-Schüttler</td><td>Zhicheng, Shanghai, China</td><td>ZWYR-200D</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungskit für lebende tote Zellen</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>60421211112</td><td>Grüne Fluoreszenz in lebenden Zellen (ex/em 488 nm/515 nm). Rote Fluoreszenz in toten Zellen (ex/em 570 nm/602 nm)</td></tr><tr><td>Niedrigdrehzahlzentrifuge</td><td>Xiangyi, Hunan, China</td><td></td><td>TD5A</td></tr><tr><td>Magnetron-Sputter</td><td>Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China</td><td>MSP-2S Mikroflow-Injektionspumpe</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus, Holliston, USA</td><td></td><td>Harvard-Pumpe 11 Plus</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israelis</td><td>2135250</td><td>Forschungsqualität</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China</td><td>GP21090181556</td><td>PBS 1x, Kulturqualität, kein Calcium, kein Magnesium</td></tr><tr><td>Poly(milchsäure-co-Glykolsäure)</td><td>Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA</td><td>Los# MKCF9651</td><td>66&ndash; 107 kDa, Lactid:Glykolid 75:25</td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol)</td><td>Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA</td><td>Los# MKCK4266</td><td>13-13 kDa, 98% hydrolysiertes PVC-Rohr</td></tr><tr><td></td><td>Shenchen, Shanghai, China</td><td></td><td>Innendurchmesser, ID: 1 mm</td></tr><tr><td>Rattenknochenmark-Mesenchyml-Stammzellen</td><td>Procell, Wuhan, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Phenom pure, Eindhoven, Niederlande</td><td></td><td>Stellen Sie die Beschleunigungsspannung bei 5 kV</td></tr><tr><td>Spritze für medizinische Zwecke</td><td>ein Kindly, Shanghai, China</td><td></td><td>5 mL & 50 mL (mit der Nadel)</td></tr> <tr><td>Temperatur Wasserbad</td><td>Mingxiang, Shenzhen, China</td><td></td><td>36 W</td></tr><tr><td>Transformator</td><td>Riye Electric Co. Ltd, Suzhou, China</td><td>SZ-2KVA</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Zellbrecher</td><td>JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China</td><td></td><td>JY 92-IID</td></tr><tr><td>UV-härtender Kleber</td><td>Zhuolide, Foshan, China</td><td></td><td>D-3100</td></tr></tbody></table>

herstellung hochoffenporiger mikrokugeln (hopms) mittels mikrofluidischer technologie

Fabricating Highly Open Porous Microspheres (HOPMs) via Microfluidic Technology

Im Vergleich zu Massengerüsten und der direkten Injektion von Zellen allein haben die injizierbaren modularen Einheiten aufgrund der Bequemlichkeit bei der Verpackung von Zellen, einer verbesserten Zellretention und minimaler Invasivität ein enormes Interesse an der Reparatur von Fehlfunktionen geweckt. Darüber hinaus könnte die poröse Konformation dieser mikroskaligen Träger den Medienaustausch verbessern und das Niveau der Nährstoffe und Sauerstoffversorgung verbessern. Die vorliegende Studie veranschaulicht die bequeme Herstellung von hochoffenporigen Mikrokügelchen (PLGA-HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) durch die einfache mikrofluidische Technologie für Zellabgabeanwendungen. Die resultierenden monodispersen PLGA-HOPMs besaßen Partikelgrößen von ~400 μm und offene Poren von ~50 μm mit miteinander verbundenen Fenstern. Kurz gesagt, die emulgierten Öltröpfchen (PLGA-Lösung in Dichlormethan, DCM), umwickelt mit der 7,5% (w/v) Gelatine-wässrigen Phase, wurden in die 1% (w/v) kontinuierlich fließende Polyvinylalkohol (PVA) wässrige Lösung durch die Koaxialdüse in der maßgeschneiderten mikrofluidischen Anordnung eingebracht. Anschließend wurden die Mikrosphären Lösungsmittelextraktions- und Lyophilisationsverfahren unterzogen, was zur Herstellung von HOPMs führte. Insbesondere verschiedene Formulierungen (Konzentrationen von PLGA und Porogen) und Verarbeitungsparameter (Emulgierleistung, Nadelstärke und Durchflussrate der dispergierten Phase) spielen eine entscheidende Rolle für die Qualitäten und Eigenschaften der resultierenden PLGA-HOPMs. Darüber hinaus könnten diese Architekturen möglicherweise verschiedene andere biochemische Hinweise wie Wachstumsfaktoren für erweiterte Anwendungen in der Arzneimittelforschung und Geweberegeneration kapseln.

Basierend auf früheren Arbeiten zur Optimierung der Hauptparameter1 wurde PLGA im verdampfbaren DCM-Lösungsmittel gelöst. Die primäre W/O-Emulsion wurde durch Homogenisieren mit Gelatine unter Ultraschallsondenbehandlung hergestellt. Die maßgeschneiderte Co-Flow-Fluidstruktur wurde vereinfacht zusammengesetzt, wobei eine Spritze verwendet wurde, um die Strömungen ständig einzuleiten. Darüber hinaus wurden ausreichende Spülverfahren durchgeführt, um PVA und Gelatine von PLGA-Mikrokugeln zu eliminie...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung von hochoffenen porösen Mikrosphären (HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) mittels der auf einer Einzelemulsionsformulierung basierenden einfachen mikrofluidischen Technologie. Diese Mikrosphären haben potenzielle Anwendungen im Tissue Engineering und im Arzneimittelscreening.

Herstellung hochoffenporiger Mikrokugeln (HOPMs) mittels mikrofluidischer Technologie

Compared to bulk scaffolds and direct injection of cells alone, the injectable modular units have garnered enormous interest in repairing malfunctioned ...

In diesem Protokoll demonstrieren wir ein effektives Verfahren zur Herstellung von PLGA-basierten hochoffenporigen Mikrosphären, die mehrere Vorteile wie den Komfort der Verpackung von Zellen, verbesserte Zellretention und minimale Invasivität bieten. Die resultierenden monodispersen PLGA-basierten hochporösen Mikrokugeln besaßen Partikelgrößen von etwa 400 Mikrometern und offene Poren von etwa 50 Mikrometern mit miteinander verbundenen Fenstern für eine verbesserte Zellretentionswirksamkeit. Diese minimalinvasiven Mikroträger können eine Plattform eines komplizierten 3D-Tumormodells für das Arzneimittelscreening und einfache Werkzeuge zum Aufbau von zellbeladenem Mikrogewebe für die Geweberegeneration unterstützen.Dieser Ansatz ist recht einfach, da das mikrofluidische Gerät aus Polyvinylchloridrohren, einer Glaskapillare und einer Nadel zusammengesetzt werden kann. Das Verfahren wird von Sheng-Chang Luo, einem Doktoranden im Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Bau eines mikrofluidischen Co-Flow-Generators mit einer Glaskapillare, Polyvinylchloridrohren und einer 26-Gauge-Dosiernadel.Verbinden Sie dann die Glaskapillare mit dem Ende des Polyvinylchloridrohrs und durchstechen Sie die Verbindung zwischen den beiden mit einer Nadel. Für die Tröpfchenerzeugung legen Sie das andere Ende des Polyvinylchloridrohrs in die kontinuierliche Phase und härten mit dem UV-Kleber aus, um die Lücken an der Verbindung abzudichten. Nehmen Sie nun eine 50-Milliliter-Spritze, um die kontinuierliche Phase zu laden, und eine Fünf-Milliliter-Spritze für die Emulsionsbildung.Stellen Sie dann die Durchflussraten der kontinuierlichen Phase auf zwei Milliliter pro Minute und die Dispergierphasen auf 0,08 Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie ein 500-Milliliter-Becherglas in ein Eisbad und füllen Sie es mit einer vorgekühlten wässrigen Polyvinylalkohollösung. Um die Emulsion herzustellen, dekantieren Sie sofort die wässrige Gelatinelösung in die DCM-Lösung von PLGA und emulgieren Sie mit dem Ultraschallgerät.Stellen Sie dann die Ultraschallleistung auf 400 Watt und die Gesamtverarbeitungszeit auf 90 Sekunden ein und ändern Sie ständig die Position der Sonde manuell. Stabilisieren Sie die resultierende Emulsion für Spritzenabsaugung und Tröpfchenerzeugung in ca. 20 Minuten. Nach der Ultraschallbehandlung die vorbereitete Emulsion schnell in die Fünf-Milliliter-Spritze in der mikrofluidischen Plattform laden und die instabile Wasserölemulsion als diskontinuierliche Phase in die mikrofluidische Vorrichtung einführen.Gleichzeitig wird die wässrige Lösung von Polyvinylalkohol als kontinuierliche Phase verwendet. Nachdem Sie die richtigen Teile der Emulsion in die mikrofluidische Vorrichtung injiziert haben, sammeln Sie die Mikrokugel mit der Emulsion am Boden des Auffangbechers und legen Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius zur weiteren Stabilisierung. Normalisieren Sie die gelagerten Mikrokugeln auf Raumtemperatur und eliminieren Sie das restliche DCM durch Rühren mit einem Glasstab für eine Stunde bei 60 U/min.Anschließend wird die Sammelphase vorsichtig in einem 500-Milliliter-Becherglas dekantiert und der restliche Polyvinylalkohol dreimal mit entionisiertem Wasser von der Oberfläche poröser Mikrokugeln abgewaschen. Lösen Sie die im PLGA-Rückgrat eingewickelte Gelatine auf, indem Sie die PLGA-Mikrokugeln 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in das Wasserbad legen. Dann entfernen Sie die Restgelatine, indem Sie die resultierenden Mikrokugeln zweimal mit dem entionisierten Wasser spülen, und kühlen Sie sie für die Lyophilisation bei minus 80 Grad Celsius für 24 Stunden vor.Die PLGA-basierten hochoffenen porösen Mikrosphären zeigten Größen von 350 bis 500 Mikrometern mit einer beliebig großen Pore von 10 bis 100 Mikrometern und miteinander verbundene Fenster, die eine hohe Effizienz beim Transport von Sauerstoffstoffwechselabfällen ermöglichen könnten. Die mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks, die in den PLGA-basierten hochporösen Mikrosphären kultiviert wurden, hafteten an einem Tag an den Gerüsten und repräsentierten umfangreiche Adhäsions- und Migrationsfähigkeiten der Zellen. Die Calcium-AM- und Propidiumiodid-Färbung zeigte, dass die Zellen lebend und gleichmäßig verteilt sind.Es ist wichtig, die Ultraschallleistung und die Position der Sonde einzustellen. Die reproduzierbare Herstellung von PLGA-basierten hochoffenporigen Mikrokugeln wird den Weg für die Erstellung von Standardgraphen ebnen, um Regeneration oder Drogenscreening zu induzieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Mikrofluidik-Geräte lassen sich komplexe natürliche Prozesse in Echtzeit und auf der entsprechenden physikalischen Maßstäben zu visualisieren. Wir haben ein einfaches Mikrofluidiksystem, dass wichtige Funktionen des natürlichen porösen Medien nachahmt für das Studium Wachstum und Transport von Bakterien im Untergrund entwickelt.

Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Das Kombinieren der monodispersen Tropfenerzeugung mit Beschleunigungssensoren Anordnung von Zellen und Partikeln, beschreiben wir ein Verfahren, um eine gewünschte Anzahl von Zellen oder Teilchen in einem einzelnen Tropfen mit kHz Preise zu kapseln. Wir demonstrieren die Effizienz zweimal höher sind als die von ungeordneten Kapselung für Single-und Double-Teilchen-Tropfen.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Zwei benachbarte Flüssigkeiten, die durch einen gerillten mikrofluidischen Kanal geleitet werden, können zu einem Mantel um einen Prepolymerkern geleitet werden; dabei sowohl Form als auch Querschnitt bestimmen. Die photoinitiierte Polymerisation, wie die Thiol-Klick-Chemie, eignet sich gut für die schnelle Erstarrung der Kernflüssigkeit in eine Mikrofaser mit vorgegebener Größe und Form.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

Verfahren zur Erzeugung von mikrostrukturierten konkaven Polydimethylsiloxan-Kügelchen werden vorgestellt. Besonders hervorgehoben werden die Auswirkungen der Elektrolytkonzentration und -identität innerhalb der wässrigen Phase.

Mikroblasen Herstellung von Konkav-Porosität PDMS Beads

Die Erzeugung von Mikrofluidik-Doppelemulsionen umfasst typischerweise Geräte mit strukturierter Benetzbarkeit oder speziell angefertigte Glaskomponenten. Hier beschreiben wir die Herstellung und Prüfung eines Doppelemulsionsgenerators aus Polydimethylsiloxan (PDMS), der keine Oberflächenbehandlung oder komplizierte Herstellungsprozesse erfordert und in der Lage ist, Doppelemulsionen bis zu 14 μm herzustellen.

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Eine additive Fertigung für die Verarbeitung von UV-vernetzbarem Hydrogele hat entwickelt. Diese Strategie ermöglicht die Schicht für Schicht Montage Microfabricated Hydrogel Strukturen sowie die Montage von unabhängigen Komponenten mit integrierten Geräte mit beweglichen Komponenten, die auf magnetischen Betätigung reagieren.

Zusatzstoff Herstellungstechnik für die einfache und schnelle Herstellung von Hydrogel-basierte Micromachines mit magnetisch reagieren Komponenten

Diese Arbeit stellt eine Methode für die Herstellung von mikrofluidischen Droplet-basierten Plattformen und die Anwendung von Polyacrylamid Mikrosphären für Mikrosphären-PCR Verstärkung. Die Mikrosphären-PCR-Methode ermöglicht es, einzelsträngigen DNA-Amplifikate ohne Trennung doppelsträngige DNA zu erhalten.

Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von mikrofluidischen Geräten aus MY133-V2000, Artefakte zu beseitigen, die oft in Mikrokanälen durch unpassende Brechungsindizes zwischen Microchannel Strukturen und einer wässrigen Lösung entstehen. Dieses Protokoll verwendet einen Acryl-Halter, um die gekapselte Gerät, Verbesserung der Adhäsion chemisch und mechanisch zu komprimieren.

Herstellung von refraktiven Index passende Geräte für biomedizinische Mikrofluidik

Wasser-in-Öl-Tröpfchen-Assays sind nützlich für die analytische Chemie, die Enzymevolution und die Einzelzellanalyse, erfordern jedoch typischerweise Mikrofluidik, um die Tröpfchen zu bilden. Hier beschreiben wir die Partikel-Template-Emulgierung, einen mikrofluidikfreien Ansatz zur Durchführung von Tröpfchenassays.

Partikel-Template-Emulgierung ermöglicht mikrofluidsäurefreie Tröpfchen-Assays

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Herstellung von vernetzten Natriumalginat-Mikrosphären mit unterschiedlichen Metallionen unter Verwendung der mikrofluidischen Elektrospray-Technologie

Erfahren Sie die Herstellung hochoffenporiger PLGA-Mikrokugeln mittels mikrofluidischer Technologie für Gewebeengineering und Arzneimittelscreening. Diese Methode ermöglicht verbesserte Zellretention und minimale Invasivität.

Herstellung hochoffenporiger Mikrokugeln (HOPMs) mittels mikrofluidischer Technologie

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