RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

RNA FISH-Färbung ist nützlich für die Visualisierung, Identifizierung und Quantifizierung von Mikroben, die C.elegans auf natürliche Weise besiedeln oder infizieren, einschließlich Mikrobiombakterien und intrazellulären Krankheitserregern. Diese Technik ist einfach, schnell und robust und ermöglicht es, Mikroben im Kontext eines ganzen intakten Tieres effektiv zu färben und zu visualisieren. Wir können RNA FISH verwenden, um Darmmikrobiombakterien in wilden C.elegans zu erkennen und sichtbar zu machen.

Dies kann uns helfen, vergleichbare Wechselwirkungen in Säugetiersystemen zu verstehen. Nach dem Transfer von Nematoden mit der gewünschten Mikrobe von NGM-Platten in Mikrozentrifugenröhrchen waschen Sie die Nematoden, indem Sie einen Milliliter 1X PBST zu Mikrofugenröhrchen hinzufügen. Schleudern Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge oder Nanofuge mit der entsprechenden Geschwindigkeit.

Entfernen Sie mit einer Pipette alle bis auf 100 Mikroliter des Überstands. Wiederholen Sie das Waschen mit PBST zwei- bis dreimal. Um die Nematoden mit Paraformaldehyd zu fixieren, geben Sie zunächst 33 Mikroliter 16% Paraformaldehyd in das Mikrofugenrohr, das 100 Mikroliter Überstand über dem Nematodenpellet enthält, für eine Endkonzentration von 4% Paraformaldehyd.

Inkubieren Sie die Proben, die die mit der interessierenden Mikrobe besiedelten oder infizierten Nematoden enthalten, für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung und fügen Sie 0,5 Milliliter PBST zu den Proben hinzu. Schleudern Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge mit der entsprechenden Geschwindigkeit, wie im Textmanuskript angegeben.

Entfernen Sie mit einer Pipette so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie 0,5 Milliliter PBST zu den Proben in den Mikrofugenröhrchen. Wiederholen Sie das Waschen mit PBST zwei- bis dreimal.

Nach der letzten Wäsche die Proben herunterschleudern und den Überstand entfernen, wobei das Pellet ungestört bleibt. Als nächstes bereiten Sie einen Milliliter Hybridisierungspuffer pro Probe vor. Fügen Sie 800 Mikroliter Hybridisierungspuffer zu den Mikrofugenröhrchen hinzu, die das Nematodenpellet enthalten.

Pelletieren Sie die Proben in der Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Pro Probe werden 100 Mikroliter Hybridisierungspuffer mit der gewünschten FISH-Sonde auf eine Endkonzentration von 5 bis 10 Nanogramm pro Mikroliter Sonde und Wirbel zum Mischen vorbereitet.

Fügen Sie jeder Probe 100 Mikroliter Hybridisierungspuffer mit FISH-Sonde hinzu. Mischen Sie, indem Sie die Röhrchen vorsichtig streichen oder umkehren. Inkubieren Sie die Proben über Nacht in einem Trockenbad bei 46 bis 54 Grad Celsius oder einem thermischen Mischer bei 46 bis 54 Grad Celsius bei 1.200 Umdrehungen pro Minute.

Bereiten Sie drei Milliliter Waschpuffer pro Probe vor. Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit. Entfernen Sie den Hybridisierungspuffer mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Nematodenpellet ungestört zu lassen.

Zu jeder Probe wird ein Milliliter vorbereiteter Waschpuffer hinzugefügt. Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit. Entfernen Sie den Waschpuffer mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet ungestört zu lassen.

Zu jeder Probe wird ein Milliliter vorbereiteter Waschpuffer hinzugefügt. Inkubieren Sie die Proben für eine Stunde bei 48 bis 56 Grad Celsius in einem Trockenbad oder Thermomischer bei 48 bis 56 Grad Celsius bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. Wenn Sie in einem trockenen Bad inkubieren, drehen Sie die Röhrchen alle 15 bis 20 Minuten vorsichtig um.

Zentrifugieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit. Entfernen Sie den Waschpuffer mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet ungestört zu lassen. Fügen Sie jeder der Proben 100 bis 500 Mikroliter PBST hinzu.

Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bis zu einer Woche in PBST bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis das Protokoll zur Fortsetzung bereit ist. Pelletieren Sie die Proben mit der entsprechenden Geschwindigkeit. Entfernen Sie so viel PBST wie möglich, ohne das Nematodenpellet zu stören.

Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI zu den Proben hinzu. Laden Sie einen 20-Mikroliter-Pipettier mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze und schneiden Sie die Spitze der Pipette mit einer Schere ab, damit größere Nematoden pipettiert werden können. Mit der geschnittenen Pipettenspitze 5 bis 10 Mikroliter des Pellets auf einen Objektträger übertragen.

Mit einem Deckglas 22 x 22 abdecken. Zur Aufbewahrung der Dias verschließen Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack und bewahren Sie sie in einer dunklen Box bei vier Grad Celsius auf, bis sie für die weitere Verwendung bereit sind. Unter dem differentiellen Interferenzkontrastmikroskop wurde festgestellt, dass ein wilder Caenorhabditis tropicalis-Stamm mit einem Bakterium besiedelt war, das gerichtet am Darmepithel zu haften scheint.

Das Fluoreszenzsignal der grünen universellen 16S rRNA-Sonde und der roten Alphaproteobakterien-Speziessonde überlappt sich vollständig, was darauf hindeutet, dass die meisten Bakterien, die den Darm besiedeln, das anhaftende Alphaproteobakterien-Bakterium sind. Das bipartite RNA-Genom des Orsay-Virus besteht aus RNA1- und RNA2-Segmenten, und FISH-Sonden wurden entwickelt, die auf beide Segmente abzielen. ZIP1-Protein, das mit grün fluoreszierendem Protein markiert ist, ist in den Darmkernen von Zellen lokalisiert, die eine positive Orsay-Virus-FISH-Färbung im Zytoplasma zeigen.

Es wird gezeigt, dass mehrere Tiere, die mit Orsay-spezifischem oder N.parisii-spezifischem FISH gefärbt wurden, die Stärke dieses Signals für eine einfache Quantifizierung anzeigen. Koinfektion von C.elegans mit zwei Mikrosporidien-Parasiten unter Verwendung artspezifischer Sonden, die um die Bindung an die 18S konkurrieren, ermöglicht die Verwendung von DAPI zur Färbung von Kernen eine bessere Lokalisierung der Infektion im Kontext des gesamten Tieres, insbesondere für den Darm, der große, leicht identifizierbare Kerne hat. Infektionen mit N. parisii führen zur Entwicklung von Meronten zu Sporen.

Die resultierende FISH-Färbung zeigt kleine und große stäbchenförmige Strukturen, die wahrscheinlich mit N.parisii-Sporen korrespondieren, die mit N.parisii-spezifischen Sonden rot gefärbt sind. Denken Sie bei der Auswahl des Fixiermittels daran, dass die PFA-Fixierung eine bessere Erhaltung der Morphologie und des transgenen GFP ermöglicht, die Acetonfixierung jedoch für die Visualisierung von Sporoplasmen erforderlich ist. RNA FISH kann verwendet werden, um Bakterien zu identifizieren und sichtbar zu machen, die den Darm von C.elegans besiedeln.

Forscher können dann mehr genetische Screens durchführen, um Faktoren zu identifizieren, die an diesen Wirt-Mikroben-Interaktionen beteiligt sind.