Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration
6. Juli 2022
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.
Dieses Protokoll zeigt, wie wir das JBNm Schicht für Schicht auf molekularer Ebene zusammengesetzt und charakterisiert haben. JBNm kapselt TGF-B1 ein und verhindert seine Freisetzung im umgebenden Gewebe, wodurch die lokalisierte Chondrogenese gefördert wird. Die Bildung des JBNm ist standardisiert, so dass verschiedene JBNms für zukünftige Anwendungen gebildet werden können.
Die einzigartige Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine Wachstumsfaktorverkapselung, wodurch eine stetige lokalisierte Freisetzung entsteht, die Hypertrophie vermeidet und das Wachstum aufrechterhält. JBNm bietet aufgrund seiner Injektionsfähigkeit eine homöostatische Mikroumgebung für die Regeneration von Knorpelgewebe an einem begrenzten Ort, die für verschiedene Szenarien wie unregelmäßig geformte Frakturen oder Hohlräume verwendet werden kann. Um zu beginnen, fügen Sie acht Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter TGF-B1, suspendiert in Wasser zu 32 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter Matrilin-3 in Wasser suspendiert.
Pipetten, um das richtige Mischen dieser Proteine zu gewährleisten. Fügen Sie 80 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Janus Base Nanotubes, oder JBNts suspendiert in Wasser, zur TGF-B1, Matrilin-3 Lösung.
Pipetten Sie wiederholt, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Für die JBNt-Gruppe fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter, JBNts zu 50 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine 90,9 Mikrogramm pro Milliliter Lösung zu erhalten. Für die Matrilin-3-Gruppe fügen Sie 40 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter Matrilin-3 zu 15 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Lösung von 7,3 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.
Für die TGF-B1-Gruppe fügen Sie 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter TGF-B1 zu 45 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Lösung von 1,8 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen. Für die Janus Base Nano-Matrix oder JBNm-Gruppe fügen Sie 40 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter, Matrilin-3 bis 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter TGF-B1 hinzu. Rühren, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten.
Dann fügen Sie der Lösung fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um die Probe zu mischen. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum jeder Gruppe. Kennzeichnen Sie den TGF-B1 mit einem Proteinmarkierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Fügen Sie 20 Mikroliter von 20 Mikrogramm pro Milliliter, gekennzeichnet mit TGF-B1, zu 25 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine 8,9 Mikrogramm pro Milliliter Testlösung zu erhalten. Beschriften Sie den Matrilin-3 mit einem separaten Beschriftungskit. Fügen Sie 20 Mikroliter von 80 Mikrogramm pro Milliliter markiertem Matrilin-3 zu 25 Mikrolitern Wasser hinzu, um eine Testlösung von 36 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.
Mischen Sie 20 Mikroliter von 80 Mikrogramm pro Milliliter markiertem Matrilin-3 mit 20 Mikrolitern von 20 Mikrogramm pro Milliliter markiertem TGF-B1 und fünf Mikrolitern Wasser, was zu einer markierten TGF-B1, Matrilin-3-Verbindung führt. Pipetten Sie die Mischung mehrmals, um sie zu mischen. Fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts zu 40 Mikrolitern Wasser hinzu, was zu einer Lösung von 111 Mikrogramm pro Milliliter führt.
Dann fügen Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter JBNts zu der markierten TGF-B1, Matrilin-3-Lösung hinzu und pipetten Sie wiederholt, um die Verbindung zu mischen. Übertragen Sie jede Probengruppe in die Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Platte. Laden Sie die Platte in einen Multimode-Mikroplattenleser und messen Sie bei Anregungswellenlängen von 488 und 555 Nanometern gemäß den Protokollen des Herstellers.
Unter physiologischen Bedingungen war das Zetapotentialspektrum von Matrilin-3 aufgrund seines isoelektrischen Punktes negativ geladen. Nach der Zugabe des TGF-B1 zum Matrilin-3 stieg das Zetapotential der TGF-B1 Matrilin-3-Verbindung auf einen nahezu neutralen Wert. Das Zetapotential von JBNm war das höchste unter den drei Gruppen.
Die UV-sichtbaren Absorptionsspektren bestätigten die Bildung der hierarchischen Schicht-für-Schicht-Innenstruktur des JBNm, der aromatischen Ringe der Lysinseitenketten und der JBNts trugen mit 220 bzw. 280 Nanometern zu den Absorptionsspitzen bei. TEM wurde verwendet, um die Morphologie der JBNts und JBNm zu charakterisieren. Nach der Kombination mit Proteinen wurden dicke Bündel von JBNm beobachtet, die eine Gerüststruktur bildeten.
Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte das Vorhandensein der Schichtstruktur und demonstrierte den Querschnitt des JBNm. Nach der Markierung umhüllte das rot fluoreszierende Matrilin-3 die JBNt-Bündel und bildete die äußere Schicht des JBNm, während das grün fluoreszierende TGF-B1 eine innere Schicht bildete. Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zeigte Emissionsspitzen bei 520 Nanometern für markierte TGF-B1-Gruppen und 570 Nanometer für Matrilin-3-Gruppen.
Die Wirkung von JBNm auf die Adhäsion und Zellproliferation von HMSC wurde untersucht. Der JBNm zeigte, dass HMSCs zusammen mit sich selbst gruppiert waren, während weniger Zellen an JBNts hafteten. Die Ausrichtung der Zellen und die Größe der Zellen auf dem JBNm zeigten, dass JBNts eine Rolle bei der Zelladhäsion spielten, während die Proteine die Affinität der Zelladhäsion erhöhten.
Nach dem ersten Tag der Zellkultur zeigten die JBNm- und TGF-B1-Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen eine signifikante Zellproliferation. Wenn die Zellstrukturdauer auf drei und fünf Tage erhöht wurde, zeigten die JBNm- und TGF-B1-Gruppen eine noch erhöhte Zellproliferation. Bei der fluoreszierenden Markierung des JBNm ist es wichtig, dass TGF-B1 und Matrilin-3 vor dem Hinzufügen der JBNts einzeln markiert und gemischt werden, um eine korrekte Bildung der Schichtstruktur zu ermöglichen.
Eine weitere Beurteilung des Gerüsts kann ein Verständnis dafür liefern, wie sie bei therapeutischen Behandlungen wirksam sind. Genauer gesagt kann ein Hochdurchsatz-Proliferationstest die optimale Dosierung in vitro und später in vivo bestimmen. Diese neuartige NanoMatriX-Kreation ermöglicht es Forschern, ein injizierbares Gerüst auf Nanomaterialbasis zur Regeneration von Knorpel zu verwenden.
Dieser Poly-Nachahmungsansatz ermöglicht eine verbesserte Androgenese und die Verbreitung von Gegenstellen.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert die Herstellung und Charakterisierung eines schichtweise aufgebauten Janus-Basis-Nanomatrizes (JBNm)-Trägers. Der JBNm inkorporiert TGF-β1, fördert eine lokalisierte Chondrogenese und schafft eine homöostatische Mikroumgebung für die Regeneration von Knorpelgewebe.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomaterialien
- Gewebetechnik
- Regenerative Medizin
Hintergrund
- Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts) werden bei der Gerüstkonstruktion verwendet.
- TGF-β1 ist entscheidend, um zelluläre Funktionen zu fördern.
- Die JBNm-Struktur ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung von Wachstumsfaktoren.
- Die Injizierbarkeit von JBNm ermöglicht die Anwendung bei unregelmäßig geformten Defekten.
Zweck der Studie
- Erstellung eines Gerüsts zur Unterstützung der Regeneration von Knorpelgewebe.
- Standardisierung der Bildung von JBNm für verschiedene Anwendungen.
- Verkapselung von Wachstumsfaktoren zur kontinuierlichen Freisetzung und Vermeidung von Hypertrophie.
Verwendete Methoden
- Schrittweise Zugabe von TGF-β1 und Matrilin-3 zur Bildung von JBNm.
- Charakterisierung des Gerüsts auf molekularer Ebene.
- Beurteilung der Bioaktivität in Bezug auf Zelladhäsion und -proliferation.
- Bewertung der Injizierbarkeit des Gerüsts für praktische Anwendungen.
Hauptergebnisse
- Die JBNm wiesen eine hervorragende Bioaktivität auf und förderten zelluläre Funktionen.
- Es wurde eine lokalisierte Freisetzung von TGF-β1 erreicht, wodurch die Chondrogenese verstärkt wurde.
- Der Scaffold bot eine homöostatische Umgebung für die Geweberegeneration.
- Durch die standardisierte Bildung ergeben sich vielseitige Anwendungen in der Gewebeengineering.
Schlussfolgerungen
- Das schichtweise aufgebaute JBNm-Gerüst ist wirksam für die Regeneration von Knorpelgewebe.
- Die Einschließung von Wachstumsfaktoren ist vorteilhaft für die lokal begrenzte Reparatur von Gewebe.
- Diese Methode kann an verschiedene klinische Szenarien angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die schichtweise aufgebaute Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ermöglicht eine präzise Lokalisation von Wachstumsfaktoren und eine dauerhafte Kontrolle des Mikromilieus und löst damit eine zentrale Herausforderung in der regenerativen Medizin und Gewebeengineering. Diese Plattform unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der frühen Biomaterial-Screening-Phase und verringert das Risiko für die translationale Weiterentwicklung, indem sie Nebenwirkungen und Hypertrophie minimiert. Durch ihre standardisierte Herstellung und Injizierbarkeit stellt sie eine wiederverwendbare Lösung für verschiedene präklinische Knorpelreparaturmodelle dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der wachstumsfaktorvermittelten Chondrogenese in kontrollierten Mikroumgebungen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch die Isolierung der Effekte von TGF-β1 in begrenzten Gerüsten.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von Biomaterial-Protein-Wechselwirkungen für die Geweberegeneration.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares Gerüst für quantitative Zelladhäsions- und Proliferationsassays.
- Ermöglicht die hochdurchsatzfähige Bewertung der Zusammensetzung des Gerüsts und der Einschließung von Wachstumsfaktoren.
- Liefert konsistente, quantifizierbare Ergebnisse zur vergleichenden Beurteilung von Biomaterialkandidaten.
Translationale und präklinische Forschung
- Passt zu krankheitsrelevanten Modellen, da es die lokalisierte Knorpelregeneration in vitro und in vivo unterstützt.
- Erhält die translationale Kontinuität durch injizierbare, anpassbare Gerüstformate für irreguläre Defekte.
- Verringert das Risiko von Hypertrophie und Nebenwirkungen an nichtzielgerichteten Geweben und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die JBNm-Plattform integriert den Prozess von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung und ermöglicht die Hypothesenprüfung, Assay-Entwicklung sowie translationsorientierte Forschung in Arbeitsabläufen zur Knorpelreparatur.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die hypothesengetriebene Evaluierung von Wachstumsfaktorwirkungen in konstruierten Mikroumgebungen.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Messgrößen für Zelladhäsion und -proliferation.
- Analytik: Ermöglicht UV-Vis-, Fluoreszenz- und Zetapotentialmessungen zur Charakterisierung von Gerüsten.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Kontinuität von in-vitro-Screenings hin zu in-vivo-Modellen der Knorpelregeneration.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Standardisierte Konstruktion ermöglicht die Anpassung über verschiedene Biomaterial- und Gewebetechnikprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der gerüstvermittelten Geweberegeneration und Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, skalierbare Protokolle für die reproduzierbare Herstellung und Analyse von Gerüsten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen, indem unerwünschte Wirkungen von Wachstumsfaktoren minimiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Biomaterialkandidaten für regenerativmedizinische Entwicklungsprozesse.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Biomaterial-Assembly, Proteinmarkierung und Gerüstcharakterisierungstechniken.
- Benötigt Zugang zu Spektrophotometrie, Fluoreszenzmikroskopie und TEM-Infrastruktur.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg für die reproduzierbare Herstellung und Analyse von Gerüsten voraus.
- Einsatz in verschiedenen Modellsystemen möglich, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für spezifische Gewebeziele.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die exakte Kontrolle der Komponentenverhältnisse und die Effizienz der Markierung.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
