Name: Erleichterung der zerebralen Organoidkultur durch seitliche Weichlichtbeleuchtung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie optimierte Methoden zur Kultivierung zerebraler Organoide mit seitlicher Weichlichtbeleuchtung. Dieses Protokoll verbessert Sichtbarkeit, Mediumwechsel und Transfer für die Neurowissenschaft.

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Diese Studie wurde von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2020A0505100062), dem Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) und dem Guangzhou City Postdoctoral Research Grant Project (an Bangzhu Chen) unterstützt.

Das Protokoll wurde im Anschluss an die Erklärung von Helsinki durchgeführt. Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Dritten angeschlossenen Krankenhauses der Guangzhou Medical University erteilt (Medizinische und ethische Überprüfung [2021] Nr. 022). Vor dem Experiment wurde jedes Medium nach Jürgen A. Knoblichs Formel12 (Ergänzende Tabellen 1-4) hergestellt oder ein kommerziell erhältliches Cerebral Organoid Kit verwendet (siehe Materialtabelle). Die in dieser Studie verwendeten iPSCs wurden zuvor von unserem Labor festgelegt und haben eine informierte Ausnahme erhalten. Die SCA3-iPS-Zellen wurden von einer 31-jährigen weiblichen spinozerebellären Ataxie-Typ-3-Patientin (SCA3) generiert, die als 26/78-CAG-Wiederholungen im ATXN3-Gen13 genotypisiert wurde (Ergänzende Abbildung 1A). Die in einem früheren Artikel erwähnten normalen menschlichen iPSCs wurden als NC-iPSCs 14 ausgewählt, und das ATXN3-Gen wurde mit 14/14 CAG-Wiederholungen identifiziert (Ergänzende Abbildung 1B).
1. Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)
<ol><li>Sammeln Sie 3 ml peripheres Blut durch Venenpunktion mit der informierten Zustimmung von Freiwilligen und Patienten.</li>
	<li>Isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen nach der Ficoll-Paque-Methode15.</li>
	<li>Richten Sie iPSCs gemäß dem Protokoll des Sendai Reprogramming Kit ein (siehe Materialverzeichnis).<ol>
<li>Kultivieren Sie die iPSCs mit mTeSR1-Medium in 35 mm Petrischale, die mit Matrigel (einer Basalmembranmatrix, siehe Materialtabelle) bedeckt sind. Wechseln Sie das Medium jeden Tag. Die iPSC-Wachstumsdichte darf 75% nicht überschreiten.</li>
		<li>Verdauen Sie die Zellen mit PSC-Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und subkulturieren Sie sie alle 3-5 Tage im Verhältnis 1:5. ACHTUNG: Sendai-Virus wird hier verwendet. Es muss in der Biosicherheitskabine betrieben werden, und es müssen Selbstschutzmaßnahmen ergriffen werden. Es sollte klar sein, ob es im lokalen Land legal verwendet werden kann. Lokale Gesetze und Vorschriften zur biologischen Sicherheit müssen bei der Anwendung strikt befolgt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. EB-Vorbereitung (Tage 0-1)
<ol><li>Entfernen Sie das mTeSR1-Medium mit einer Pipette aus den iPSCs und waschen Sie es 2x mit 1 ml 1x PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette und fügen Sie 300 μL Zellablösungslösung hinzu (siehe Materialtabelle), um die iPSCs für 3-4 min bei 37 °C in einzelne Zellen zu verdauen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml EB-Bildungsmedium (Ergänzende Tabelle 1) und zentrifugieren Sie die Probe dann für 5 min bei 300 x g (Raumtemperatur).</li>
	<li>Behandeln Sie die spezielle 24-Well-Platte 5 Minuten lang mit Anti-Adhärenz-Spüllösung (500 μL / Well) vor (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Anti-Adhärenz-Spüllösung ist für eine optimale EB- und Sphäroidbildung unerlässlich.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in EB-Bildungsmedium, das Y-27632 enthält (Endkonzentration, 10 μM, siehe Materialtabelle), mit einer Zelldichte von 1,5 x 106 Zellen/ml.</li>
	<li>Entfernen Sie die Anti-Adhärenz-Spüllösung und spülen Sie jede gut mit 2 ml EB-Bildungsmedium ab.</li>
	<li>Fügen Sie die Zellen zu den spezialisierten 24-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 106 Zellen/Well hinzu (Abbildung 1A, links). HINWEIS: Normalerweise können in jedem Brunnen 300 EBs zubereitet werden. Diese Methode kann große Mengen von EBs der gleichen Größe vorbereiten.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Platte bei 100 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Verteilen Sie die Zellen in jeder Kammer gleichmäßig am unteren Rand der Platte (Abbildung 1A, rechts). HINWEIS: Wenn es keine geeignete Zentrifuge gibt, kann die Platte auch direkt in den Inkubator für statische Kultur gelegt werden, aber die Formationszeit der EB-Kugel wird einige Stunden später sein als die unter normaler Zentrifugation.</li>
	<li>Die Proben werden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert. Wenn im vorherigen Schritt keine Zentrifugation verwendet wurde, 36 h inkubieren. Halten Sie die Probe ruhig und nehmen Sie sie während dieser Zeit nicht aus dem Inkubator.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Soft-Light-Lampe (Tag 1)
<ol><li>Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3-0,5 cm in der Größe von A5-Papier. Kleben Sie weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte.<ol>
<li>Installieren Sie eine Reihe von LED-Weißleuchten am Rand der Platte, so dass die Lichter von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können (Ergänzende Abbildung 2A-F, Abbildung 1B). HINWEIS: Da die Durchmesser von EBs im Frühstadium etwa 200 μm bis 300 μm betragen, ist es schwierig, sie mit bloßem Auge unter der Leuchtstofflampe sauberer Bänke deutlich zu beobachten. Im Gegensatz dazu können wir aufgrund der Verstärkung der diffusen Reflexion die EBs deutlich erkennen, indem wir seitlich beleuchtetes weiches Licht verwenden (Abbildung 1B, C). Eine 6-Well-Platte wird für EB-Kulturen in nachfolgenden Experimenten empfohlen. Um jedoch die visuelle Wirkung von weichem Licht besser zu zeigen, wird in dieser Studie manchmal Geschirr verwendet, um Bilder und Videos anstelle von Tellern aufzunehmen, also bitte nicht falsch verstehen. Die seitlich beleuchtete Weichlichtlampe kann auch für die 6-Well-Platte verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EB-Übertragung und mittlerer Austausch (Tage 2-5)
<ol><li>Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung vor und fügen Sie jedem Bohrloch 2 ml EB-Formationsmedium hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie die EBs zusammen mit dem Medium mit einer 1000 μL Breitrohr-Pipettenspitze (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie auf die 6-Well Low Adhäsion Platte (~100 EBs/Well). HINWEIS: Der Betriebsprozess verwendet eine Weichlichtlampe (in Schritt 3 erwähnt), um die Beobachtung der EBs zu erleichtern. Schalten Sie andere Innenlichtquellen aus, um den visuellen Effekt des weichen Lichts besser zu erzielen.</li>
	<li>Jeden Tag durch die gleiche Menge an frischem EB-Formationsmedium ersetzen. Verwenden Sie den sekundären Fluss, um die EBs in der Mitte zu sammeln und das Medium zu wechseln.<ol>
<li>Saugen Sie das alte Medium ab, indem Sie langsam an den Rand des Brunnens pipettieren. Nicht zu stark saugen; Andernfalls werden die EBs zusammen entfernt. Fügen Sie dann frisches Medium hinzu, um die EBs wieder anzuhalten. HINWEIS: Der prinzipielle Sekundärfluss (Abbildung 1D). Induzieren Sie einen Drallfluss, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Aufgrund der Drallströmung wird eine sekundäre Strömung induziert, die auf das Zentrum gerichtet ist. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund des durch Rotation erzeugten Sekundärflusses zum Zentrum des Bohrlochs, wonach der Mittelwechsel oder der Embryodentransfer leicht durchgeführt werden können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Überprüfung der Pluripotenz durch Etikettierung mit Pluripotenzmarker OCT4 (Tag 4)
HINWEIS: Wenn der Durchmesser der EBs größer als 300 μm ist, nehmen Sie mehrere EBs für die OCT4-Marker-Immunfluoreszenzfärbung, um ihre Pluripotenz zu erkennen.
<ol><li>Fixieren Sie die EBs in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 30 min, gefolgt von 1x PBS 3x für 10 min jedes Mal.</li>
	<li>Übertragen Sie die EBs auf Raumtemperatur PBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% BSA für 2 h, gefolgt von Waschen in PBS 3x für jeweils 10 Minuten. HINWEIS: Nach der Behandlung mit Triton X-100 schwimmen die EBs auf der Flüssigkeitsoberfläche und können während der Reinigung leicht mit der Flüssigkeit abgesaugt werden. Eine Operation unter einem Stereomikroskop wird empfohlen.</li>
	<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper OCT4 (siehe Materialtabelle) mit 1 ml 1x PBS, das 1% BSA enthält, in einem Verhältnis von 1:200 und fügen Sie den EBs für die Inkubation bei 4 °C über Nacht hinzu, dann waschen Sie in PBS 3x für jedes Mal 10 Minuten.</li>
	<li>Verdünnen Sie den jeweiligen Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) mit 1x PBS bei 1:500 und geben Sie 1 ml zu den EBs.</li>
	<li>Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden waschen Sie die Zellen in 1x PBS 3x für jeweils 10 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS, fügen Sie 2 ml 1x PBS-Lösung hinzu, die 1 μg / ml DAPI enthält, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten und waschen Sie dann PBS 3x für jedes Mal für 10 Minuten.</li>
	<li>Bewegen Sie den EB mit einer kleinen Menge Flüssigkeit auf den Objektträger, versiegeln Sie den Objektträger mit einem Deckglas, das mit handelsüblichem Vaseline (siehe Materialtabelle) am Rand beschichtet ist, und beobachten und sammeln Sie das Bild dann unter dem Fluoreszenz-Konfokalmikroskop. HINWEIS: Der OCT4-Ausdruck steht für EB-Pluripotenz12. Wenn der Ausdruck von OCT4 weniger als 90% beträgt, sollten die EBs verworfen werden, und EBs sollten erneut vorbereitet werden.</li>
</ol>6. Neuronale Induktion (Tage 5-7)
<ol><li>Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung vor und fügen Sie 3 ml neuronales Induktionsmedium (Ergänzende Tabelle 2) zu jeder Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein (in Schritt 3 erwähnt) und schalten Sie andere Innenlichtquellen aus.</li>
	<li>Übertragen Sie die EBs auf die 6-Well-Platte mit zugesetztem neuronalem Induktionsmedium (~ 100 EBs / Well). Fügen Sie dem neuen Brunnen so wenig wie möglich vom ursprünglichen Medium hinzu. HINWEIS: Führen Sie einfache Fähigkeiten des Organoid-Transfers ein. Natürlich sinken die resuspendierten EBs unter Schwerkraft und mit einer relativ höheren Dichte als das Medium allmählich ab, indem sie die in Abbildung 1E gezeigte Operation anwenden. Somit können die EBs bequem übertragen werden. Da freie Zellen und abgestorbene Zellfragmente im Vergleich zu EBs langsamer absinken, können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente durch diese Sedimentationsmethode entfernt werden (Abbildung 1F).</li>
	<li>Die Proben werden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert. HINWEIS: Unter dem Mikroskop betrug der Durchmesser der EBs ungefähr 500 μm und der Rand war durchscheinend, was darauf hindeutet, dass sich eine neuroepitheliale Schicht gebildet hat.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.</li>
</ol>7. Einbettung in die Basalmembranmatrix (Tage 7-10)
<ol><li>Legen Sie die Membranmatrix 60 Minuten im Voraus in einen 4 ° C-Kühlschrank, um sich aufzulösen. Berechnen Sie die Menge der benötigten Matrix im Voraus. Etwa 100 EBs wurden in 1,5 ml der Membranmatrix eingebettet.</li>
	<li>Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein und schalten Sie die Lichtquelle auf der Oberseite der Konsole aus.</li>
	<li>Halten Sie die Membranmatrix auf Eis, um eine Erstarrung zu verhindern.</li>
	<li>Geben Sie jedes Mal eine kleine Menge EBs in eine 60-mm-Schale mit frischem Expansionsmedium (Ergänzende Tabelle 3). Reduzieren Sie die Anzahl der EBs, um das Entfernen eines einzelnen EBs zu erleichtern.</li>
	<li>Verwenden Sie dann eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung. Saugen Sie jedes Mal eine einzelne EB (mit ca. 10 μL Medium) mit einer 200 μL Breitrohr-Pipettenspitze (siehe Materialtabelle) und fügen Sie sie dann auf den Boden der 6-Well-Platte hinzu, um Tröpfchen herzustellen. Verwenden Sie fünf Tröpfchen pro Well. HINWEIS: Der Schlüssel besteht darin, den Bereich der Pipettenpistole auf 50 μL einzustellen und einen EB zu saugen und dann auf den Betrieb von Abbildung 1E zu verweisen. Wenn sich der EB an der Bohrung der Pipettenspitze absetzt, berührt die Spitze schnell den Brunnenboden der Platte und drückt etwa 10 μL Flüssigkeit aus, um ein Tröpfchen zu bilden.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Tropfen, der EB enthält, 15 μL der Membranmatrix hinzu und mischen Sie ihn schnell. Betten Sie den EB-Ball in die Mitte des Tröpfchens ein. HINWEIS: EBs dürfen nicht mit einer Standardpipettenspitze abgesaugt werden, die die EB beschädigt. Stattdessen muss die 200-μL-Breitrohr-Pipettenspitze verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie die 6-Well-Platte für 30 min in einen 37 ° C-Inkubator und erstarren Sie die Membranmatrixtröpfchen, die EBs enthalten.</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml des Erweiterungsmediums zu jeder Vertiefung hinzu und blasen Sie die in die Matrix eingebetteten EBs vorsichtig auf, um sie zu suspendieren.</li>
	<li>3 Tage bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren. HINWEIS: Wenn Knospen auf der Oberfläche von EB beobachtet werden, bedeutet dies, dass ein expandiertes Neuroepithel gebildet wurde16.</li>
</ol>8. Organoidreifung (Tage 10-40)
<ol><li>Entfernen Sie vorsichtig das ursprüngliche Medium und fügen Sie 3 ml Reifemedium (Ergänzende Tabelle 4) zu jeder Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die Organoidplatte auf einen horizontalen Schüttler in einem 37 °C Inkubator.</li>
	<li>Fahren Sie fort, die Kultur horizontal zu drehen. Stellen Sie den Shaker auf die entsprechende Geschwindigkeit ein. HINWEIS: Bei der Kultivierung von zerebralen Organoiden auf einer 6-Well-Platte ist eine relative Zentrifugalkraft (RCF) von 0,11808 x g nach Angaben des Herstellers des horizontalen Schüttlers angemessener (siehe Materialtabelle). Gemäß der Umrechnung zwischen der relativen Fliehkraft und der Drehzahl17,18 ist RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2, wobei RCF = relative Zentrifugalkraft (g), rpm = Umdrehungen pro Minute (r/min) und R = Rotationsradius (cm), auch als Schüttelwurf bezeichnet. Die Schüttelwurfparameter verschiedener Shaker können unterschiedlich sein. Daher kann geschätzt werden, dass die Drehzahl rpm = 299 x (RCF/R)1/2 beträgt.</li>
	<li>Wechseln Sie das frische Reifungsmedium alle 2-3 Tage.</li>
	<li>Nach 20-30 Tagen die zerebralen Organoide allmählich bis zur Reife kultivieren. HINWEIS: Während dieser Zeit können Organoide für Experimente und Nachweise verwendet werden, wie z.B. neuronale Markererkennung und Transkriptomsequenzierung 19,20,21.</li>
</ol>9. Gefrorene Abschnitte und Immunfluoreszenz von zerebralen Organoiden
<ol><li>Fixieren Sie die Organoide in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 16 h und waschen Sie sie dann 3x mit 1x PBS für jeweils 10 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS und tauchen Sie die Organoide über Nacht bei 4 ° C in 30% Saccharose.</li>
	<li>Die Organoide in 10%/7,5% Gelatine/Saccharose bei 37 °C für 1 h einbetten und dann schnell in die Einbettform überführen.</li>
	<li>Fügen Sie Trockeneis zu 100% Ethanol hinzu, um eine Trockeneis- / Ethanolschlammung herzustellen, und legen Sie die Organoidproben zum schnellen Einfrieren hinein.</li>
	<li>Lagern Sie die gefrorenen Proben in einem −80 °C Gefrierschrank. Bei Bedarf machen Sie gefrorene Abschnitte mit einer Dicke von 20 μm.</li>
	<li>Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 5.3.-5.5. für Immunfluoreszenz. Verwenden Sie den PAX6-Antikörper, um apikale Vorläuferzellen zu markieren, den TUJ1-Antikörper (siehe Materialtabelle), um neuronale Zellen22,23,24 zu markieren, und DAPI für die Kern-DNA-Färbung.</li>
</ol>

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<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communications. 12 (1), 2581(2021).</li>
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<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).</li>
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<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Zerebrale Organoide eröffnen neue Wege für die medizinische Forschung. Viele nützliche Anwendungen dieser Technologie beginnen erst zu erforschen28. Diese Forschung ergab, dass die Ergebnisse der Transkriptomsequenzierung von genetisch kranken zerebralen Organoiden und normalen zerebralen Organoiden die Unterschiede zwischen Krankheit und Gesundheit widerspiegeln können. Zum Beispiel stimmen die Ergebnisse der RNA-seq-Datenanalyse (Abbildung 3B) mit vielen berichteten...

Im Vergleich zu zweidimensionalen (2D) Kultursystemen haben dreidimensionale (3D) Kultursysteme mehrere Vorteile, darunter die echte Replikation und effiziente Reproduktion komplexer Strukturen bestimmter Organe1. Daher sind zerebrale Organoide eine der wichtigen Hilfsmethoden für die Forschungsfelder Entwicklung des menschlichen Gehirns und Krankheit2, Wirkstoffscreening und Zelltherapie.
Die Kultivierung zerebraler Organoide durch die rotierende Suspensionsmethode ist förderlich für ihre Entwicklung und Reifung3. Obwohl zerebrale Organoid-Kultursysteme große Erfolge erzielt haben, stehen sie immer noch vor kritischen Herausforderungen, die ihre Anwendung einschränken. Beispielsweise ist die manuelle Kultivierung mit komplizierten Manipulationsschritten verbunden und stellt Hindernisse für die Erzielung großflächiger Anwendungen dar. Darüber hinaus sind in jedem Entwicklungsstadium der Kultur der zerebralen Organoide Veränderungen in verschiedenen Medien und Zytokinen erforderlich4. Im Frühstadium haben die Organoide oder EBs jedoch winzige Größen (ca. 200 μm bis 300 μm) und sind ohne entsprechende Apparatur visuell nahezu unzugänglich. Zwangsläufig wird eine gewisse Menge wertvoller Organoidproben weggespült, wenn das Medium gewechselt wird. Viele Techniken wurden erforscht, um dies in anderen Arten von Organoidkulturen zu überwinden, und einige Beispiele umfassen das Eintauchen ganzer Organoidchips in ein Kulturmedium für 3 Tage ohne Intervention5; Hinzufügen eines frischen Mediums durch das Deckglas, nachdem das alte Medium mit saugfähigem Papierabsorbiert wurde 5; oder die Anwendung komplexer mikrofluidischer Rohrleitungen für den Flüssigkeitsaustausch 6,7,8. Ein weiteres Hindernis, das im frühen Stadium der Organoidkultivierung auftritt, ist die Schwierigkeit, direkte Beobachtungen mit bloßem Auge zu erreichen, was zu schlechten Operationen führen kann, die zu Organoidschäden und -verlusten während der Organoidtransferschritte führen. Daher ist es notwendig, ein praktikableres Protokoll zu etablieren, das den Mediumswechsel und die Organoidübertragung zur Erzeugung von Organoiden erleichtert.
Um diese Probleme zu überwinden, wird ein entsprechend optimierter Betrieb auf der Grundlage von Engineering-Prinzipien vorgeschlagen, der viele Organoid-Verfahren erheblich und bequem erleichtert. Wenn in der Natur die Sonne durch einen Fensterspalt in ein Haus scheint, kann das bloße Auge den Staub sehen, der im Lichtstrahl tanzt. Aufgrund der diffusen Reflexion von Sonnenlicht auf Staub wird etwas Licht in den Augapfel gebrochen, um ein visuelles Bild zu erzeugen. Inspiriert vom Prinzip dieses Phänomens 9,10 machte diese Studie eine weiche Lichtlampe und beleuchtete die EBs seitlich. Es wurde festgestellt, dass EBs visuell klar sein können, ohne den Betrachtungsumfang zu beeinträchtigen. Eine zum Zentrum zeigende Sekundärströmung wird in der Flüssigkeit erzeugt, indem die Kulturplatte aufgrund von Wirbelströmen11 gedreht wird. Ursprünglich verstreute EBs sammeln sich in der Mitte der Platte an. Auf dieser Grundlage und dem Phänomen, dass die Sedimentationsgeschwindigkeit von Organoiden schneller ist als die von Zellen, wird eine einfache Operationsmethode des Mittelwechsels und des Organoidtransfers ohne Zentrifugation vorgeschlagen. Die Organoide im Kulturmedium können durch diesen Transfervorgang effektiv von freien Zellen und toten Zellfragmenten getrennt werden.
Hier wird ein Protokoll vorgeschlagen, das einfach zu bedienen ist, um zerebrale Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Die Betriebstechnologie wurde durch die Anwendung des Engineering-Prinzips optimiert, wodurch Operationen in der 3D-Kultur so einfach und machbar wie in der 2D-Kultur wurden. Die verbesserte Flüssigkeitsaustauschmethode und der Organoidtransferbetrieb sind auch für andere Arten von Organoidkulturen und das Design von automatischen Kulturmaschinen hilfreich.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Filter</td><td>NEST Biotechnology, China</td><td>331001</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu; L Pipettenspitze mit breitem Durchgang</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>9405163</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettenspitze mit breiter Bohrung</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>9405020</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Merck, Deutschland</td><td>8057400005</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Servicebio, China</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte mit geringer Adhäsion</td><td>NEST Biotechnology, China</td><td>703011</td><td>Es wird für EBs-Suspensionskulturen verwendet</td></tr><tr><td>Aaccute Zellablösungslösung</td><td>STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>07920</td><td>Es wird verwendet, um iPSC in einzelne Zellen zu verdauen.</td></tr><tr><td>AggreWell800 24-Well-STEMCELL</td><td>Technologies, Kanada</td><td>34811</td><td>Mikroporöse Kulturplatte für die EBs-Vorbereitung.</td></tr><tr><td>Anti-Adhärenz-Spüllösung</td><td>STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>07010</td><td>Spüllösung für Kulturgefäße zur Verhinderung der Zelladhäsion</td></tr><tr><td>B27-vit. Eine Ergänzung</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech, USA</td><td>GMP100-18B</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime Biotechnology, China</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>5810 R</td><td>Es kann zum Zentrifugieren verschiedener Arten von Zentrifugenröhrchen, Reagenzflaschen und Arbeitsplatten verwendet werden.</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Shitai Laboratory Equipment, China</td><td>10212020C</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology, China</td><td>C1002</td><td>Wird für nukleare Färbungen verwendet. Nachdem DAPI mit doppelsträngiger DNA kombiniert wurde, betrug die maximale Anregungswellenlänge 364 nm und die maximale Emissionswellenlänge 454 nm.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>ES-Qualität FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>General Electric Company, USA</td><td>17-5442-02</td><td>Isolieren Sie die mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach der Ficoll-Paque-Methode.</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sangon Bioteach, China</td><td>A609764 Glutamax-Ergänzung</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>35050061 Glutamax-Ergänzung</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Hühner-IgY&nbsp; Sekundärantikörper</td><td>Abcam, UK</td><td>ab150171</td><td>Ziege Anti-Hühner-IgG. Konjugation: Alexa Fluor 647. Bsp.: 652 nm, Em: 668 nm. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper</td><td>Abcam, UK</td><td>ab150120</td><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG. Konjugation: Alexa Fluor 594. Bsp.: 590 nm, Em: 617 nm. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden.</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper</td><td>Abcam, UK</td><td>ab150077</td><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG. Konjugation: Alexa Fluor 488. Bsp.: 495 nm, Em: 519 nm. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck, Deutschland</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Horizontalschüttler</td><td>Servicebio, China</td><td>DS-H200</td><td>Die relative Zentrifugalkraft (RCF) von 0,11808 x g ist laut Hersteller INFORS HT (Schweiz) besser geeignet.</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Merck, Deutschland</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, USA</td><td>354277</td><td>Matrigel verfestigt sich in der Umgebung über 4 & Grad; C, daher sollte es bei niedriger Temperatur unterverpackt werden.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>85850</td><td>iPSC-Kulturmedium</td></tr><tr><td>N2-Ergänzung</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OCT4 Primärantikörper</td><td>Abcam, UK</td><td>ab19857</td><td>Gastgeber: Hase. Auflösen mit 500 &mu; L PBS. Bei einer Verdünnung von 1:200 verwenden.</td></tr><tr><td>Pathologischer Gefrier-Slicer</td><td>Leica, Deutschland</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 Primärantikörper</td><td>Abcam, UK</td><td>ab78545</td><td>Wirt: Maus. Bei einer Verdünnung von 1:100 verwenden.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>37350</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PSC-Dissoziationslösung</td><td>Beijing Saibei Biotechnology, China</td><td>CA3001500</td><td>Enzymfreie Dissoziationslösung kann für den Verdau und die Passage von iPSCs verwendet werden.</td></tr><tr><td>Sendai Reprogramming Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>A16518</td><td>Etablieren Sie iPSC gemäß dem Protokoll des Sendai Reprogramming Kit.</td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Shitai Laboratory Equipment, China</td><td>188105W</td><td></td></tr><tr><td>Softlight-Lampe</td><td>NUT</td><td>NUT NUT Ein</td><td>einfaches selbstgebautes Gerät, siehe ergänzende Abbildung 2 zur Vorbereitung.</td></tr><tr><td>STEMdiff Cerebral Organoid Kit</td><td>STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>8570</td><td>enthalten: 1. EB-Bildungsmedium; 2. Induktionsmedium; 3. Expansionsmedium; 4. Reifemedium.</td></tr><tr><td>STEMdiff Cerebral Organoid Maturation</td><td>Kit STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>8571</td><td>Reifungsmedium</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sangon Bioteach, China</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck, Deutschland</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1 Primärantikörper</td><td>Abcam, UK</td><td>ab41489</td><td>Wirt: Huhn. Bei einer Verdünnung von 1:1000 verwenden.</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Sangon Bioteach, China</td><td>A510146</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies, Kanada</td><td>72302</td><td>Bereiten Sie eine 5 mM Stammlösung in PBS vor, resuspendieren Sie 1 mg in 624 & micro; L von PBS.</td></tr><tr><td>Weblink</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rohsequenzierungsdaten</td><td>Genome Sequence Archive (Genomik, Proteomik & Bioinformatik 2021) im National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of</td><td>Sciences GSA-Human: HRA002430</td><td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td></tr></tbody></table>

erleichterung der zerebralen organoidkultur durch seitliche weichlichtbeleuchtung

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

Gegenwärtig ist die Technologie der zerebralen Organoidkultur noch kompliziert zu bedienen und in großem Maßstab schwer anzuwenden. Es ist notwendig, eine einfache und praktische Lösung zu finden. Daher wird in der vorliegenden Studie ein praktikables zerebrales Organoidprotokoll vorgeschlagen. Um die unvermeidbaren Unannehmlichkeiten beim Medienwechsel und Organoidtransfer in der Frühphase zu lösen, optimiert die aktuelle Forschung die Betriebstechnik durch Anwendung des Engineering-Prinzips. Eine Soft-Light-Lampe wurde verwendet, um die Proben des embryonalen Körpers (EB) seitlich zu beleuchten, so dass die EBs durch den verstärkten diffusen Reflexionseffekt mit bloßem Auge gesehen werden können. Unter Verwendung des Prinzips der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung sammeln sich die Organoide in Richtung der Mitte des Bohrlochs, was die Durchführung eines Mediumwechsels oder Organoidtransfers erleichtert. Im Vergleich zur zerstreuten Zelle setzt sich der embryonale Körper schneller in der Pipette ab. Mit diesem Phänomen können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente auf einfache Weise effektiv entfernt werden, wodurch verhindert wird, dass EBs durch die Zentrifugation beschädigt werden. Diese Studie erleichtert die Operation der zerebralen Organoidkultur und hilft, die Anwendung von Gehirnorganoiden zu fördern.

Die vorliegende Studie induzierte iPS-Zellen (Abbildung 2B) in zerebrale Organoide (Abbildung 2C). Die in der Frühphase kultivierten EBs drückten den OCT4-Marker aus (Abbildung 2A), der auf eine gute Pluripotenz hindeutete. Im späteren Stadium entwickelten sich die EBs zu reifen zerebralen Organoiden (Abbildung 2D). Die Forschung kultivierte iPS-Zellen von normal gesunden Personen und SCA3-Patienten zu ...

Zerebrale Organoide bieten beispiellose Möglichkeiten zur Untersuchung der Organentwicklung und der Pathologie menschlicher Krankheiten. Obwohl mit zerebralen Organoid-Kultursystemen große Erfolge erzielt wurden, gibt es immer noch operative Schwierigkeiten bei der Anwendung dieser Technologie. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein zerebrales Organoidverfahren, das den Mediumswechsel und den Organoidtransfer erleichtert.

Erleichterung der zerebralen Organoidkultur durch seitliche Weichlichtbeleuchtung

At present, cerebral organoid culture technology is still complicated to operate and difficult to apply on a large scale. It is necessary to find a simple ...

Das Protokoll erleichtert den Betrieb der zerebralen Organoidkultur und hilft, die Anwendung von Gehirnorganoiden zu fördern. Das Organoid des früheren Stadiums kann mit bloßem Auge gesehen werden, indem eine seitliche Weichlichtlampe verwendet wird, die für viele Operationen geeignet ist. Die verbesserten Medium-Change-Methoden und Organoid-Transfer-Operationen sind auch für andere Arten von Organoidkulturen und das Design von automatischen Kulturmaschinen hilfreich.Zu Beginn werden die iPSCs mit mTeSR1-Medium in einer mit Matrigel überzogenen 35-Millimeter-Petrischale kultiviert und das Medium täglich gewechselt. Die iPSC-Wachstumsdichte darf 75% nicht überschreitenDann pipettieren Sie das mTeSR1-Medium aus den iPSCs und waschen es zweimal mit einem Millimeter PBS. Nachdem Sie das PBS herausgepipettiert haben, fügen Sie 300 Mikroliter Zellablösungslösung hinzu, um die iPS-Zellen für drei bis vier Minuten bei 37 Grad Celsius in einzelne Zellen zu verdauen.Später suspendieren Sie die Zellen in zwei Millimetern EB-Bildungsmedium und zentrifugieren die Probe fünf Minuten lang bei 300 mal g. Behandeln Sie die spezielle 24-Well-Platte fünf Minuten lang mit 500 Mikrolitern Anti-Adherenc

facilitating-cerebral-organoid-culture-via-lateral-soft-light

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Ibanez-Rios, M.I., et al., A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt die Injektion von fluoreszenzmarkierten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in menschliche zerebrale Organoide unter Verwendung eines Zell-Matrix-Gemisches. Die Methode ist reproduzierbar und tierversuchsfrei und ermöglicht eine Transplantation mit minimalem Organoid-Bruch. Es bietet eine wertvolle Plattform für die Modellierung von neuronalen Transplantationen...

Injektion von fluoreszierenden neuralen Vorläuferzellen in humane zerebrale Organoide zur Transplantationsmodellierung

Dieses Video zeigt einen Assay zur Erzeugung von zerebralen Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Humane iPSCs werden dazu angeregt, Embryoidkörper (EBs) zu bilden. Die EBs werden unter Verwendung eines Induktionsmediums über einem Polymergerüst kultiviert, wodurch die Differenzierung in neurale Stammzellen, Vorläuferzellen und unreife Neuronen gefördert wird. Schließlich werden die EBs in eine Matrix eingebettet und in ein Erhaltungsmedium für die Bildung von zerebralen...

Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten zerebralen Organoiden

Dieses Video beschreibt die Herstellung und Kultivierung von Hirntumor-Organoiden aus Einzelzellsuspension. Durch die Verwendung einer lamininreichen extrazellulären Matrix als Gerüst und Nährmedium für Nährstoffe werden die Zellen in die Lage versetzt, sich innerhalb des Organoids zu vermehren und selbst zu organisieren. Folglich werden ex vivo Organoide erzeugt, die die zelluläre Vielfalt und die Mikroumgebung von Hirntumoren nachahmen.

Erzeugung einer Organoidkultur aus einer Suspension von Hirntumorzellen

Dieses Video zeigt die Verwendung einer lateralen Soft-Light-Beleuchtungstechnik, um die Visualisierung von Embryoidkörpern mit bloßem Auge zu verbessern und dadurch deren Manipulation und Übertragung während der zerebralen Organoidkultur zu erleichtern. Es werden der Aufbau der sanften Lichtbeleuchtung, Methoden für Medienveränderungen und Embryoidkörpertransfer sowie das Verfahren zur Induktion der neuronalen Differenzierung in Embryoidkörpern für die Entwicklung zerebraler Organoide...

Eine Technik zur Optimierung der zerebralen Organoidkultur unter Verwendung von lateraler Soft-Light-Beleuchtung

Zerebrale Organellen repräsentieren eine neue Modellsystem, frühe menschliche Gehirn Entwicklung in Vitrozu untersuchen. Dieser Artikel enthält die detaillierte Methodik um homogene dorsalen Vorderhirn-Typ Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen einschließlich kritische Charakterisierung und Validierung Schritte effizient zu generieren.

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

Das vorliegende Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren für die reproduzierbare Generierung, Aufrechterhaltung und Alterung von zerebralen Organoiden, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung und Reifung zerebraler Organoide über längere Zeiträume, was die Modellierung von Prozessen erleichtert, die an der Alterung des Gehirns und der altersbedingten Pathogenese beteiligt sind.

Robuste Gewebeherstellung für die Langzeitkultur von iPSC-abgeleiteten Hirnorganoiden für die Alternsforschung

Hier skizzieren wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und Verwendung von labortechnisch hergestellten Glioblastom-Organoiden (LEGO), um Genotyp-Phänotyp-Abhängigkeiten zu untersuchen und potenzielle Medikamente für die Glioblastombehandlung zu screenen.

Labortechnische Glioblastom-Organoidkultur und Wirkstoffscreening

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die hochauflösende, markierungsfreie und dreidimensionale Bildgebung von Organoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie vor. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Organoidkulturen, die Aufnahme von Bildern und die computergestützte Bildanalyse und ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der strukturellen Dynamik und des Wirkstoffansprechens in lebenden Organoiden.

Markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung und maschinelle Lernanalyse von Darmorganoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie

Wir zeigen die Herstellung eines Low-Cost-Kryo-Stadium entwickelt, um die meisten Auflichtmikroskope fit. Dieses Labor gebaut kryogenen Stufe ermöglicht eine effiziente und zuverlässige korrelative Bildgebung zwischen Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

Erfahren Sie optimierte Methoden zur Kultivierung zerebraler Organoide mit seitlicher Weichlichtbeleuchtung. Dieses Protokoll verbessert Sichtbarkeit, Mediumwechsel und Transfer für die Neurowissenschaft.

Erleichterung der zerebralen Organoidkultur durch seitliche Weichlichtbeleuchtung

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