Name: Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Abstammungsverfolgung induzierbarer fluoreszenzmarkierter Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Aktivierung, Proliferation und Migration in vivo.

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<p class="jove_content">Die Autoren danken Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) und Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) zur Orientierung unter Verwendung von mTert-rtTA-Tieren.</p>

<p class="jove_content">Die Autoren haben nichts offenzulegen.</p>

<p class="jove_content">Eine Methode zur Erzeugung, Nutzung und Analyse einer dreifachen transgenen Linienverfolgung von Mauslinienmarkierungsstammzellen im erwachsenen Mäusegehirn <em>in vivo</em> wird beschrieben. In Kombination mit Immunverfärtung oder Gehirnreinigung kann die Identifizierung und Charakterisierung von Fluoreszenzzellen im gesamten Gehirn erreicht werden. Diese Technik bietet die Fähigkeit, das plastische/regenerative/Umbaupotenzial markierter Stammzellen zu verstehen, wenn sie sich aktivieren, migrieren, differenzieren oder ...

<table><tbody><tr><td>Antikörperverdünnungsmittel</td><td>Agilent</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval Solution</td><td>Agilent</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A2311</td><td>Verwendung bei 1:500-1:000</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:007676</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Solution (IHC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Blunt needle</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>Koronale Hirnblockade</td><td>Braintree</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzylether</td><td>Millipore Sigma</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin-Hyclat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz aus der Schweineschleimhaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Molekularbiologie Gewebefixiermittel</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>Dieses Produkt wurde inzwischen nicht mehr hergestellt, kann aber durch Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Westward</td><td>0143-95095-10</td><td>ersetzt werden. Für die Lagerung und Verwendung dieses Produkts ist eine DEA-Lizenz erforderlich.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Milipore Block</td><td>Millipore</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Millipore Sigma</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur Lösung</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS Lösung (10X)</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Sagittale Hirnblockade</td><td>Braintree</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Braun</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sudan (Typogen) Schwarze</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>186562</tr><tr><td>Taschentuchpatrone</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Millipore Sigma</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten stammzellen im erwachsenen mäusegehirn

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

<p class="jove_content" fo:break-after="page">Eine Telomerase-Reverse-Transkriptase (Tert) -Linie zur Verfolgung der Maus wurde entwickelt, um das Verhalten und Schicksal von adulten Gewebestammzellen zu untersuchen, indem das "Tet-On" -System der Tet-Cre-Maus mit einem neuartigen Reverse-Tetracyclin-Transaktivator-Transgen (rtTA) gekreuzt wurde, das mit dem Tert-Promotor verbunden ist, von dem wir gezeigt haben, dass es eine neuartige Population von adulten Hirnstammzellen markiert. Hier markiert die Verabreichung des Tetracyclinderivats Doxycyclin an mTert-rtTA::oTet-Cre-Mäuse unauslöschlich eine Population von Zellen, die ein 4,4 kb Fragment der Promotorregion des Gens Tert exprimieren. In Kombination mit dem Rosa-mTmG-Reporter exprimieren mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäuse die Membran tdTomato (mTomato), bis die Doxycyclin-Behandlung den Ersatz der mTomato-Expression durch Membran-EGFP (mGFP) in Zellen induziert, die auch Tert exprimieren. Wenn diese dreifach transgenen Linienverfolgungsmäuse Doxycyclin erhalten (die "Pulsperiode", in der TERT-exprimierende Zellen markiert werden), werden diese Zellen zu unauslöschlich markierten mGFP + -Zellen, die nach der Doxycyclinentfernung (der "Chase" -Periode) für jede wünschenswerte Zeit verfolgt werden können, selbst wenn die Tert-Expression anschließend verloren geht. Gehirne werden dann perfusionsfixiert und für Immunfluoreszenz und andere nachgelagerte Anwendungen verarbeitet, um Veränderungen der Stammzellaktivierung, Proliferation, Abstammungsbindung, Migration zu verschiedenen Gehirnnischen und Differenzierung zu reifen Zelltypen zu interpretieren. Mit diesem System kann jede rtTA-Maus mit oTet-Cre und einem Rosa-Reporter verbunden werden, um Doxycyclin-induzierbare "Pulse-Chase" -Lineage-Tracing-Experimente mit Markern von Stammzellen durchzuführen.</p>

<p class="jove_content">Während das Fluoreszenzsignal, das sich aus einem Tet-On-System mit einem fluoreszierenden Reporter ergibt, je nach Interessenträger und verwendetem Fluorophor(en) variiert, werden wir beschreiben, wie die Ergebnisse mit mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Tieren analysiert wurden. Die Analyse von erwachsenen Gehirnen nach einer Pulsjagd führte zu Membran-GFP-exprimierenden Zellen in verschiedenen anatomischen Nischen. Der Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen verschiedenen Zelltypen muss beachtet werden. Eine Va...

<p class="jove_content">Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung <em>in vivo</em>. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.</p>

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

<p>Die Markierung von Stammzellen und ihren Nachkommen mit einer induzierbaren transgenen Abstammungsverfolgungs-Mauslinie ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse der Aktivierung, Proliferation, Migration und/oder Differenzierung von adulten Stammzellen im Gehirn in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken. Zu den Vorteilen transgener Linienverfolgungsansätze gehören die Spezifität der Rückverfolgung einer bestimmten Zelllinie, die unauslöschliche Expression des fluoreszierenden Proteins unabhängig vom Zellumsatz oder der Zelldifferenzierung, die geringe Toxizität von Doxycylin, die bedingte Aktivierung und die Benutzerfreundlichkeit bei gängigen nachgelagerten Assays auf Abstammungsspurengeweben, einschließlich Immunfärbung und Immunfluoreszenz.</p><p>Aufgrund der breiten Implikation von Plastizität und Zelle im erwachsenen Gehirn wird die Charakterisierung und Analyse von adulten Stammzellen dazu beitragen, über die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen, metabolische Auswirkungen auf die Plastizität des Gehirns, das Altern und andere verwandte Erkrankungen zu i</p>

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Genetische Inducible Fate Mapping (GIFM) markiert und verfolgt Zellen mit feinen räumlichen und zeitlichen...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells<em> In Vivo</em

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Färben neu proliferierter neuraler Stammzellen in Hirngewebeschnitten mittels EdU-Inkorporation, gefolgt von Immunfluoreszenz zur Visualisierung spezifischer Proteine, was das Verständnis der Zelldynamik und -proliferation verbessert.

Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung proliferierter neuraler Stammzellen in Hirnschnitten von Mäusen

Quelle: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Live-Bildgebung mit anschließender Einzelzellverfolgung zur Überwachung der Zellbiologie und des Verlaufs der Abstammungslinie mehrerer neuronaler Populationen. J. Vis. Exp. (2017) Die Das Video zeigt den Prozess der Vorbereitung, Bildgebung und Verfolgung adulter neuronaler Stammzellen in Echtzeit, um zelluläres Verhalten, einschließlich Teilung und Differenzierung, zu untersuchen.

 Live-Bildgebung und Einzelzell-Tracking zur Überwachung der neuronalen Abstammung in adulten neuralen Stammzellen

Quelle: Daynac, M., et. al. Zellsortierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone adulter Mäuse und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklusdynamik. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Zeitraffer-Bildgebung von neuralen Stammzellen (NSCs) aus einem transgenen Mausgehirn unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops. NSCs fluoreszieren während der G1-Phase rot und sind in anderen Zellzyklusphasen nicht fluoreszierend. Eine adhärente NSC-Kultur wird in...

Zeitraffer-Bildgebung der neuralen Stammzellteilung von Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

In diesem Artikel beschreiben wir die Prinzipien für das Entwerfen und Durchführen eines mehrfarbigen Abstammungsverfolgungsexperiments mit R26R-Confetti-Mäusen. Wir bieten ein spezifisches Protokoll für die Verfolgung von Hornhautepithelzellen an, das für andere Gewebe von Interesse modifiziert werden kann.

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Ein robustes Protokoll zum neuronalen Populationen von Time-Lapse Video-Mikroskopie, gefolgt von Post-Processing Software-basierte Überwachung wird beschrieben. Diese Methode stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur biologischen Ereignisse in einer ausgewählten Population während live-imaging-Experimente zu identifizieren.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Es wird ein Protokoll zur Verfolgung und funktionellen genetischen Analyse von Kandidatengenen auf Einzelzellebene mithilfe von Mosaikanalysen mit Doppelmarkern (MADM) vorgestellt. Die CLonale MADM-Analyse bietet einen quantitativen Rahmen, um das proliferative Verhalten, die zelluläre Leistung und die Abstammungsbeziehung einzelner Vorfahren und ihrer Tochterzellen zu messen.

Lineage Tracing und Clonal Analysis bei der Entwicklung von Zerebralparese mit Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM)

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Erfahren Sie die Abstammungsverfolgung induzierbarer fluoreszenzmarkierter Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Aktivierung, Proliferation und Migration in vivo.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

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