Name: Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Lernen Sie einen qualitativen Assay zur Untersuchung von Adhäsion und Agar-Invasion bei S. cerevisiae. Diese Methode ermöglicht die Bewertung invasiver Phänotypen verschiedener Mutanten.

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Wir möchten Lisa Schneper und Katrin Duevel für ihre Einsichten danken bei der Entwicklung dieses Tests.

<ol><li> Legen Sie 200 &amp;mgr; l der wachsenden Kulturen von Interesse auf synthetischen Medien Platten mit den erforderlichen Hunger Bedingungen (SC mit 2% Glucose im Vergleich zu SC mit 0,2% Glucose, zum Beispiel) Wenn die Dichte der Kulturen zu verschieden von einander sind, passen Zellzahl pro 200 &amp;mgr; l Kultur so dass jeder Tropfen hat etwa die gleiche Anzahl von Zellen. </li><li> Vergewissern Sie sich, Aufzeichnungen über die Drop auf den Platten, die Kultur ist zu halten. </li><li> Halten Sie die Platte Deckel angelehnt und entweder bei Raumtemperatur oder bei 30 ° C bis Tropfen trocken sind. </li><li> Seal-Platten mit Parafilm und Plastikfolie (optional) und in 30 ° C für 3-7 Tage zu verlassen. </li><li> Document das Wachstum von Zellen auf Platten (durch Scannen, wobei ein digitales Bild, etc) </li><li> Wash-Zellen aus der Agar-Oberfläche mit hohem Druck Wasser (vorzugsweise VE-Wasser) für etwa eine Minute unter Betreuung der Agar nicht zu heben und die Ausrichtung ändern. </li><li> Befreien Sie sich von überschüssigem Wasser, indem Platten auf Küchenpapier und lassen sie offen, um zu trocknen. </li><li> Sobald die Platten trocken Dokument Haftung auf jeder Platte (durch Scannen oder das Fotografieren) </li><li> Mit einem behandschuhten Finger sanft abreiben Zellen bilden die Agar-Oberfläche unter fließendem Wasser für etwa eine Minute. </li><li> Trocknen Sie die Platten wie zuvor. </li><li> Wenn Sie ein Binokular, entfernen Sie die Nadel, bevor Platten auf den Mikroskop-Plattform. </li><li> Document Invasion mit 10x oder 40x Vergrößerung. Vergewissern Sie sich auf den mittleren Teil jedes Kreises zu konzentrieren, für die Kanten zu voll wird es sein, einzelne Zellmorphologien sehen. Die Kanten können wird der Grad der filamentösen Wachstum und kann zum späteren Nachschlagen dokumentiert werden. Scannen oder unter ein digitales Foto von der gesamten Platte kann auch hilfreich sein. </li></ol>

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</ol>

Hefezellen zeigen verschiedene Modi Differenzierung nach Verfügbarkeit von Nährstoffen und ökologischen Bedingungen, einschließlich Sporenbildung unter Hunger und Stress-Bedingungen, Filamentierung unter verschiedenen Nährstoffen betont, und Flockung. Verschiedene Hefen, einschließlich S. cerevisiae und C. albicans, kann auch in Biofilmen durch eine vielfältige Reihe von Mikroorganismen gebildet gefunden werden. Zwar gibt es eine gewisse Korrelation mit Filamentierung und invasive Verhalten, es ist nicht klar, wie Filamentierung könnte Inva...

<table><tbody><tr><td>Moticam 350</td><td>Kamera</td><td>Motic</td><td>eingestellt (neues Modell: Moticam 352)</td><td>Eine vergleichsweise kostengünstige Kamera, die an Okulare von Mikroskopen angebracht wird und digitale Bilder für PC oder Mac aufnimmt.</td></tr></tbody></table>

assay für adhäsion und agar invasion in s. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Hefen sind in natürlichen Biofilmen, wo viele Mikroorganismen besiedeln Oberflächen gefunden. In künstlichen Umgebungen, wie z. B. Oberflächen von künstlichen Objekten können Biofilme vermindern die Produktivität der Industrie, zu zerstören Strukturen und bedrohen Menschenleben. 1-3 auf der anderen Seite kann sich die Leistung von Biofilmen zu helfen reinigen Sie die Umwelt und die Erzeugung nachhaltiger Energie. 4-8 Die Fähigkeit von S. cerevisiae, um Oberflächen zu besiedeln und an komplexen Biofilmen wurde meist bis zur Wiederentdeckung der Differenzierung Programme von verschiedenen Signalwegen und Umweltreize in diesem Organismus ausgelöst ignoriert. 9, 10 Die anhaltende Interesse an der Verwendung von S. cerevisiae als Modellorganismus, um das Zusammenspiel und die Konvergenz der Signalwege, wie die Ras-PKA, KSS1 MAPK und Hog1 Osmolarität Wege, schnell platziert S. cerevisiae in der Kreuzung der Biofilm verstehen Biologie und Signaltransduktion Forschung. 11-20 Zu diesem Zweck wurde die Differenzierung von Hefezellen in lange, Kleber, pseudohyphal Filamente eine bequeme Ablesung für die Aktivierung der Signalwege auf verschiedene Veränderungen der Umwelt. Allerdings ist Filamentierung eine komplexe Sammlung von Phänotypen, die für ihn Testen macht, als ob es eine einfache Phänotyp irreführend waren. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Tests erfolgreich von bakterieller Biofilm Studien zur Hefe Forschung, wie MAT Bildung Assays zur Kolonie verteilt auf weichem Agar und Kristallviolettfärbung quantitativ zu messen Zelloberfläche Einhaltung getroffene Maßnahme. 12, 21 Allerdings gab es einige Verwirrung in Assays entwickelt, um qualitativ bewerten die Klebstoff-und invasive Phänotypen der Hefe in Agar. Hier präsentieren wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Klebstoff-und invasive Qualität der Hefestämme mit leicht verständlichen Schritten, um die Haftung Beurteilung der Invasion Beurteilung zu isolieren. Unsere Methode, aus früheren Studien, 10, 16 angenommen beinhaltet wachsenden Zellen in flüssigen Medien und Plattierung auf Differential Nährstoff Bedingungen für das Wachstum von großen Flecken, die wir dann mit Wasser zu waschen, um die Haftung zu beurteilen und reiben Zellen vollständig von der Agar-Oberfläche zur Invasion in beurteilen Agar. Wir beseitigen die Notwendigkeit für Schlieren Zellen auf Agar, der die Invasion von Zellen wirkt sich in den Agar. In der Regel beobachteten wir, dass haploide Stämme, die Agar-Invasion immer Kleber, aber nicht alle Kleber Stämme können Agarmedium einzudringen. Unser Ansatz kann in Verbindung mit anderen Assays verwendet werden, um sorgfältig zu sezieren die Differenzierung Schritte und Anforderungen der Hefe Signaltransduktion, Differenzierung, Quorum Sensing und Biofilmbildung.

Wir beschreiben eine qualitative Tests für Hefe Haftung und Agar-Invasion als Maß für die invasive und pseudohyphal Differenzierung. Dieser einfache Test kann verwendet werden, um den invasiven Phänotyp der verschiedenen Mutanten sowie die Auswirkungen Umweltreize zu bewerten und Signalwege auf Hefe Differenzierung.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Hefen kommen in natürlichen Biofilmen vor, in denen viele Mikroorganismen Oberflächen besiedeln. In künstlichen Umgebungen, wie beispielsweise auf Oberflächen von menschengemachten Objekten, ...

Entnehmen Sie 200 Mikroliter Ihrer gewünschten Kultur und tragen Sie einfach einen Tropfen auf. Normalerweise können bis zu sechs Proben auf einer Platte platziert werden, falls gewünscht. Anschließend lasse ich die Platte geöffnet stehen, damit sie trocknet. Das hier sind zwei Platten.Eine davon weist Schimmel auf, aber das ist in Ordnung, da es unseren Versuch nicht beeinträchtigt. Und eine davon befindet sich in komplettem Medium, eine davon in Medium mit niedrigem Glucosespiegel. Wir werden also Adhärenz und Invasion untersuchen und prüfen, ob ein Unterschied besteht.Nehmen Sie die Platte einfach so heraus. Und Sie können sehen, wie sich etwas verändert. Ich werde spülen.Sie können die Bläschen unter dem Bohrer sehen, und das liegt daran, dass Wasser unter den Bohrer gelangt ist, was in Ordnung ist, solange der Bohrer nicht aus der Platte herausrutscht. Ich würde daher sagen, dass beide Stämme, obwohl einige Zellen abgelöst wurden, adhäsiv sind. Die Zellen haften an anderen Zellen, die möglicherweise an dem Agar haften.Andernfalls würden viele der Zellen abgelöst werden, was nicht der Fall war. Nachdem wir nun die Adhäsion dokumentiert haben, werden wir nun die Invasion dokumen

assay-for-adhesion-and-agar-invasion-in-s-cerevisiae

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Forschung

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Biologie

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zur Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe und die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Solche Phänotypen können anschließend genutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele zu erläutern.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Invasion von Wirtszellen durch eine bakterielle Erreger, die sich...

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Dieses Protokoll ist eine einfache bakterielle Adhäsion Assay aus der Zählung die Zahl der bakteriellen Kolonie bildende Einheiten, die auf kultivierten Zellen eingehalten werden. Der Test ist robust, studierte unabhängig von der Adhäsin und zahlreiche Variationen sind in den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

Hier stellen wir eine kostengünstige Methode zur Definition chemisch-genetischer Interaktionen in knospenden Hefen vor. Der Ansatz baut auf grundlegenden Techniken der Hefemolekularbiologie auf und eignet sich gut für die mechanistische Abfrage kleiner bis mittlerer Ansammlungen von Chemikalien und anderen Medienumgebungen.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

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Im Folgenden stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der oralen Candida-Infektion bei Patienten mit primärem Sjögren-Syndrom vor, das für eine rechtzeitige Behandlung und danach zur Vermeidung damit verbundener Komplikationen verwendet werden kann.

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GFP-Fusionsproteine ​​sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.

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