Untersuchung von Treibern von Anti-Belohnung im Suchtverhalten mit anatomisch spezifischen Einzelzell-Genexpressionsmethoden
4. August 2022
Die Kombination von Laser-Capture-Mikrodissektion und mikrofluidischer RT-qPCR bietet anatomische und biotechnische Spezifität bei der Messung des Transkriptoms in einzelnen Neuronen und Glia. Die Anwendung kreativer Methoden mit dem systembiologischen Ansatz auf psychiatrische Erkrankungen kann zu Durchbrüchen im Verständnis und in der Behandlung führen, wie z.B. die Neuroinflammation-Anti-Belohnungs-Hypothese bei Sucht.
Das Protokoll ist hochempfindlich und ermöglicht die Erfassung des Genexpressionsprofils mit hohem Durchsatz bei Einzelzellauflösung. Die Technik bietet sowohl anatomische räumliche als auch molekulare Spezifität bei Einzelzellauflösung. Nach der Ernte des Gehirns, der Auswahl der einzelnen Zellen und der Vorbereitung der mRNA injizieren Sie Kontrollleitungsflüssigkeit in den qPCR-Chip für das Priming.
Setzen Sie den qPCR-Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung ein. Wählen Sie das Prime-Skript aus und führen Sie das Programm aus. Entfernen Sie nach Abschluss des Programms den grundierten qPCR-Chip und pipettieren Sie sechs Mikroliter der Reaktion von der PCR-Probenplatte in die entsprechende Probenmulde im grundierten qPCR-Chip.
Pipettieren Sie nun sechs Mikroliter der Reaktion von der PCR-Assayplatte in die entsprechende Assay-Vertiefung im primierten qPCR-Chip. Stecken Sie dann den Chip in die mikrofluidische Mischvorrichtung. Wählen Sie das Load Mix-Skript aus und führen Sie das Programm aus.
Schalten Sie die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform ein und wärmen Sie die Lampe auf. Entfernen Sie den qPCR-Chip von der mikrofluidischen Mischvorrichtung und ziehen Sie den Schutzaufkleber von der Unterseite des Chips. Öffnen Sie die mikrofluidische RT-qPCR-Plattform und laden Sie den qPCR-Chip in die Plattform.
Starten Sie die Datenerfassungssoftware, indem Sie auf Neue Ausführung starten klicken. Überprüfen Sie den Chip-Barcode und den Chip-Typ. Klicken Sie dann auf Weiter.
Wählen Sie die Chiplaufdatei aus und durchsuchen Sie den Dateispeicherort für den Datensammlungsspeicher. Klicken Sie dann auf Anwendungstyp und wählen Sie Genexpression. Wählen Sie ROX für eine passive Referenz, eine einzelne Sonde und EVAGreen für den Sondentyp.
Wählen Sie das Temperaturwechselprogramm und dann Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2 aus. PCL-Datei. Laden Sie die Datenanalysesoftware herunter.
Starten Sie die Software, um das mikrofluidische RT-qPCR-Experiment zu analysieren. Klicken Sie auf Chip Run und öffnen Sie ChipRun. BML-Datei, die vom Experimentator erstellt wurde.
Ein Fenster mit den experimentellen Details, einschließlich der passiven Referenz, der Sonde und des PCR-Wärmeprogramms, wird angezeigt. Klicken Sie auf der Registerkarte Chip Explorer auf Sample Plate Setup (Probenplatten-Setup), und erstellen Sie eine neue Probenplattenvorlage. Kopieren Sie die Beispielbeschriftungen und fügen Sie sie gemäß dem experimentellen Design in die Softwaretabelle ein.
Geben Sie den Probennamen und die für die Standardproben verwendete RNA-Konzentration ein. Ordnen Sie nun das Setup des Beispiels zu, indem Sie im Taskmenü auf Zuordnung klicken und SBS96-Left.dsp auswählen. Wählen Sie als Nächstes Detailansichten aus, um diese Änderungen in der Datei zu aktualisieren, und klicken Sie auf Analysieren.
Wählen Sie Detector Plate Setup (Detektorplatten-Setup) und erstellen Sie eine neue Assay-Platte. Wählen Sie den entsprechenden Containertyp und das entsprechende Containerformat aus. Fügen Sie die Assay-Namen gemäß dem experimentellen Design ein und klicken Sie auf Analysieren.
Klicken Sie im Bereich der Analyseeinstellungen auf Benutzer, und legen Sie die Anpassung auf automatisch fest. Überprüfen Sie nun manuell jede Reaktion im 96x96-Chip. Visualisieren Sie die Amplifikations- und Schmelzkurven, um festzustellen, ob jede Reaktion dem erwarteten qPCR-Muster folgte.
Wenn die Verstärkungs- oder Schmelzkurve nicht mit dem übereinstimmt, was erwartet wird, schlägt diese Reaktion fehl. Exportieren Sie nach der Qualitätssicherung die Daten, indem Sie Datei auswählen, auf Exportieren klicken und den Datensatz als CSV-Datei speichern. Da die exportierte CSV-Datei sowohl eine Pass-Fail-Matrix als auch eine Matrix mit unformatierten CT-Werten enthält, verwenden Sie die Pass-Fail-Matrix, um alle fehlgeschlagenen Zellen im Dataset durch NA zu ersetzen. Laden Sie die aktuelle Version der Open Source R-Software herunter und laden Sie dann die R Studio-Anwendung herunter.
Verwenden Sie für die mediane Zentrierung die R-Software, um den mittleren CT-Wert zu berechnen, der aus allen CT-Werten für eine einzelne Probe berechnet wird, und subtrahieren Sie dann alle einzelnen CT-Werte von diesem Medianwert, um einen Minus-Delta-CT-Wert zu erhalten. Für die Normalisierung des Housekeeping-Gens berechnen Sie die durchschnittliche Expression der Housekeeping-Gene für jede Probe und subtrahieren Sie mit diesem Wert die einzelnen CT-Werte. Um einen Minus-Delta-Delta-CT-Wert zu generieren, führen Sie den Code in der R-Software aus.
Laden Sie das normalisierte Dataset in R hoch und analysieren Sie die Daten mithilfe der Skalierungsfunktion, generieren Sie die skalierten Daten, und verwenden Sie dann die R-Heatmap-Funktion oder eine separate Software, um eine Heatmap zu generieren. Um den Datensatz für andere Funktionen zu organisieren, berechnen Sie die Pearson-Korrelationen zwischen jedem Gen, gefolgt von der Schmelzfunktion. Exportieren Sie diese Daten und laden Sie sie in eine Genkorrelationsnetzwerk-Software hoch.
Neuronen zeigten eine erhöhte Expression von NeuN und Mikrogliaproben zeigten eine signifikante Expression der Mikrogliamarker Cd34 und Cx3xr1. Die Th+-neuronalen Proben zeigten eine signifikant erhöhte Expression von Th im Vergleich zu Th-neuronalen und Mikroglia-Proben. Die Th-Neuronen zeigten eine signifikante Expression von Gcg, was darauf hindeutet, dass Th-neuronale Proben mit Neuronen angereichert sind, die Glp1 als Neurotransmitter verwenden.
Die lineare Diskriminationsanalyse zeigte, dass diese drei Zelltypen unterschiedliche Genexpressionsprofile über alle 65 Gene hinweg aufwiesen. Zelluläre Subphänotypen von Glp1-angereicherten Neuronenproben durch eine Alkoholentzugszeitreihe wurden mittels Heatmaps dargestellt. Der Subphänotyp A, der den entzündlichen Gencluster eins stark exprimiert, nimmt am achtstündigen Entzugszeitpunkt im Verhältnis zu und erreicht bei 32 Stunden Entzug ein Maximum.
Der entzündliche Subphänotyp wird normalisiert, um den Entzug von 176 Stunden zu kontrollieren. Subphänotyp B, der den GABA-Rezeptor-Gencluster zwei stark exprimiert, zeigt eine allgemeine Unterdrückung der Expression dieses Genclusters durch die 176-stündige Entzugsbedingung. Die Genexpression einzelner Proben wurde zu Mittelwerten kombiniert, so dass die Expression von Genclustern und der Proteinort dieses Gentranskripts über die Zeitreihen hinweg visualisiert werden konnten.
Diese Technik kann auf jedes biologische System oder Gewebe angewendet werden, um die zelluläre Reaktion auf eine Krankheit oder eine Störung zu verstehen. Das heißt, die molekulare Antwort bei Einzelzellauflösung in Bezug auf die räumliche und die anatomische Architektur des Gewebes zu entschlüsseln.
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Übersicht
Diese Studie nutzt die Laser-Mikrodissektion und mikrofluidische RT-qPCR, um Transkriptomprofile einzelner Neuronen und Gliazellen zu analysieren. Dabei wird auf die hohe Empfindlichkeit und Spezifität der Methode hingewiesen, die unser Verständnis psychiatrischer Erkrankungen, die mit Neuroinflammation assoziiert sind, insbesondere im Kontext von Sucht, voranbringen kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Transkriptionsanalyse
- Psychiatrische Erkrankungen
Hintergrund
- Das Verständnis der RNA-Expressionsmuster in Neuronen und Gliazellen ist entscheidend, um psychiatrische Erkrankungen aufzuklären.
- Bisherige Methoden wiesen weder räumliche anatomische noch molekulare Spezifität auf.
- Neuroinflammation wurde im Zusammenhang mit der Antirewards-Hypothese der Sucht diskutiert.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer empfindlichen Methode zur Erfassung von Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung.
- Untersuchung, wie diese molekularen Veränderungen mit Verhaltensreaktionen bei psychiatrischen Erkrankungen zusammenhängen.
- Bewertung der Rolle von Neuroinflammation in suchtabsiedierenden Mechanismen.
Verwendete Methoden
- Es wurde die mikrofluidische RT-qPCR eingesetzt, die eine Hochdurchsatz-Datenerfassung aus Einzelzellen ermöglicht.
- Einzelzellen wurden aus Gehirngewebe nach der Entnahme zur mRNA-Präparation und -Analyse isoliert.
- Es wurden detaillierte Protokolle für das Anlegen der Chips, die Datenerfassung und die Analyse durchgeführt.
- Die Genexpressionsdaten wurden mit statistischer Software validiert und analysiert.
Hauptergebnisse
- Neuronen wiesen eine erhöhte Expression von NeuN auf, während Mikroglia eine signifikante Expression von Cd34 und Cx3xr1 zeigten.
- Unterschiedliche Subtypen wurden basierend auf Genexpressionsprofilen identifiziert, insbesondere im Hinblick auf die Reaktion auf Entzug und Neuroinflammation.
- Zentrale Schlussfolgerungen bezüglich Genclustern und deren Regulation während Stress durch Entzug wurden aus Heatmap-Analysen abgeleitet.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt, dass die Kombination dieser Methoden ein vertieftes Verständnis der zelltypspezifischen Reaktionen auf Neuroinflammation ermöglicht.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten bei der Entwicklung gezielter therapeutischer Ansätze für psychiatrische Erkrankungen mit Suchtproblematik helfen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Genexpressionsanalyse auf Einzelzellniveau mit anatomischer Spezifität ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Entdeckung neuropsychiatrischer Zielstrukturen, insbesondere für Sucht- und Bestrafungspfade. Dieser Ansatz liefert hochauflösende Einblicke in neuroinflammatorische Treiber und stärkt die Vorhersagekraft an der Schnittstelle zwischen molekularer Pathologie und Verhaltensphänotypen. Die Integration dieser Methoden in frühe Entdeckungsprozesse verbessert die Portfolioauswahl und die translationale Kohärenz für die Entwicklung von Arzneimitteln für das zentrale Nervensystem.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung neuroinflammatorischer und Antireward-Hypothesen mit Einzelzell-Auflösung.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Verknüpfung der Genexpression mit anatomischer und phänotypischer Spezifität.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung für im Zentralnervensystem beteiligte Zielstrukturen, die bei Sucht und Entzug eine Rolle spielen.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die Weiterentwicklung neuropsychiatrischer Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Zellsysteme für die nachgeschaltete transkriptomische und phänotypische Untersuchung vor.
- Liefert quantitative, reproduzierbare Genexpressionsdaten zur Standardisierung von Assays.
- Ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse von Gennetzwerken in definierten Zelltypen.
- Unterstützt die zuverlässige Bewertung der Wirkung von Substanzen auf neuroinflammatorische Signalwege.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt molekulare Befunde mit krankheitsrelevanten neuroanatomischen Systemen in Suchtmodellen.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung neuroinflammatorischer Biomarker.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung zentralnervöser Therapieprogramme.
- Verbessert die translationale Biomarkerentwicklung, indem Genexpression mit Entzugsphänotypen verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Forschung, indem sie eine hochdurchsatzfähige, anatomisch präzise Analyse der Genexpression in ZNS-Geweben ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen bei Neuroinflammation und Antibelohnungsmechanismen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Genexpressionsdaten für die Assay-Entwicklung und Verbindungsscreenings.
- Analytik: Erzeugt skalierbare Datensätze für Netzwerkanalysen, Heatmapping und statistische Vergleiche zellulärer Phänotypen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Signaturprofile mit krankheitsrelevanten Entzugszuständen und der Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für Einzelzell-Transkriptomik über verschiedene ZNS- und Krankheitsmodelle hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung zentralnervöser Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Workflows zur Genexpression-Analyse auf Einzelzell-Ebene.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management in der neuropsychiatrischen Forschung und Entwicklung.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Wirkstoffkandidaten für das zentrale Nervensystem.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Expertise in der Laser-Mikrodissektion und Mikrofluidik-basierten RT-qPCR-Plattformen.
- Benötigt eine leistungsstarke analytische Infrastruktur für die Hochdurchsatz-Datenverarbeitung und Netzwerkanalyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenvorbereitung und Daten-Normalisierung voraus.
- Kann bei entsprechender Optimierung auf verschiedene ZNS-Gewebe und Krankheitsmodelle angewendet werden.
- Hängt vom Zugang zu spezialisierten Geräten und bioinformatischer Unterstützung ab.
