Name: In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Lernen Sie die Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln für Biophysik und Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die Kapselung von Proteinen mit hoher Ausbeute.

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Wir bestätigen die Finanzierung von ARO MURI W911NF-14-1-0403 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 und die Fördernummer RGY0073/2018 des Human Frontiers Science Program (HFSP) an M.P.M. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der ARO, NIH oder HFSP wider. S.C. würdigt fruchtbare Gespräche mit V. Yadav, C. Muresan und S. Amiri.

1. Herstellung von Puffern und Proteinlösungen
<ol><li>Bereiten Sie den wässrigen inneren Nichtpolymerisationspuffer (INP) in einem Gesamtvolumen von 5 ml durch Mischen von 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM Saccharose und0,2 mM ATP vor.</li>
	<li>Bereiten Sie den Proteinmix (PM) vor, indem Sie dem INP-Puffer bei 4 °C Proteine mit folgenden Konzentrationen hinzufügen: 11,2 μM nicht-fluoreszierendes G-Aktin, 2,8 μM fluoreszenzmarkiertes Aktin und 0,24 μM Arp2/3 (Materialtabelle). Um eine F-Aktin-Schicht zu bilden, fügen Sie dem PM 100 nM Gelsolin, 4 μM Cofilin und 2,2 μM VCA-His hinzu. Als Kontrollexperiment PM durch 100 μg/ml Fluoreszenzfarbstoff ersetzen (Table of Materials).</li>
	<li>Der wässrige innere Polymerisationspuffer (IP) (wässrig) wird in einem Gesamtvolumen von 5 mL durch Mischen von 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP und 80 mM Saccharose hergestellt.</li>
	<li>Bereiten Sie den Endpuffer (FB) vor, indem Sie INP-Puffer (mit PM) und IP-Puffer in einem Volumenverhältnis von 1: 1 mischen, um die innere wässrige Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 μL zu erhalten, das im Liposom verkapselt wird.</li>
	<li>Bereiten Sie den wässrigen Außenpuffer (OB) in einem Gesamtvolumen von 150 μL durch Mischen von 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM Glucose und0,1 mg/ml β-Kasein vor. HINWEIS: Die Osmolarität des OB kann mit Glukose eingestellt werden, um sicherzustellen, dass der osmotische Druck des OB etwas größer ist als der des FB (20-60 mOsm). Die Dichte des FB sollte etwas höher sein als der OB.</li>
</ol>2. Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik
<ol><li>Lipid-Öl-Mischung vorbereiten<ol><li>100 μL 25 mg/ml L-α-Phosphatidylcholin (nicht fluoreszierendes Ei-PC, auch EPC genannt, einschließlich 1% DHPE) in eine Durchstechflasche aus Glas geben. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas, wobei ein trockener fester Lipidfilm (2,5 mg) am Boden der Durchstechflasche verbleibt.<ol><li>Um eine F-Aktinschicht zu bilden, wird 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaessigsäure]succinyl}-nickelsalz (DOGS-NTA-Ni) im Verhältnis 10:1 von EPC zu DOGS-NTA-Ni gegeben und vor dem Verdampfen von Chloroform gemischt.</li>
		</ol></li>
		<li>Fügen Sie 2 ml Mineralöl hinzu und beschallen Sie das Lipid-Öl-Gemisch bei Raumtemperatur in einem Bad für 1 h, um die Lipide wieder zu suspendieren. HINWEIS: Das Lipid-Öl-Gemisch nach der Beschallung kann 1 Woche bei 4 °C aufbewahrt werden. Eine Beschallung wird vor dem Gebrauch empfohlen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine Final Buffer in Öl (FB / Öl) Emulsion zur Herstellung von Monolayer-Lipidtröpfchen vor, die das interessierende Protein enthalten.<ol><li>Zu 100 μL Lipid-Öl-Gemisch in einem Kunststoffröhrchen 10 μL FB hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass sich FB in einem Tröpfchen befindet.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Glasspritze, ziehen Sie die Lipid-Öl-FB-Mischung und saugen Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab, um sie zu emulgieren. Ziehen Sie zuerst eine kleine Menge Lipid-Öl-Gemisch und dann das FB-Tröpfchen, indem Sie die Spitze der Spritze an den Rand des Tröpfchens legen, um es in winzige Tröpfchen aufzubrechen. Wiederholen Sie die Auf- und Abaspiration, bis sich eine weißliche und trübe Emulsion gebildet hat.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie 30 μL OB in ein separates Kunststoffröhrchen. Geben Sie 30 μL der Lipid-Öl-Mischung auf OB und lassen Sie sie ~10 Minuten ruhen, um eine Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zu entwickeln. HINWEIS: Wenn die Lipide geladen sind oder das Protein eingebaut ist, sollte die Dauer dieses Schritts verlängert werden38.</li>
	<li>Liposomen vorbereiten<ol><li>Geben Sie vorsichtig 50 μL der FB/Ölemulsion (Schritt 2.2) in die obere Ölphase des Röhrchens aus Schritt 2.3.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Kunststoffröhrchen bei 100 x g für 15 Minuten bei 4 °C. Variieren Sie Zeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die Liposomenbildung zu optimieren. HINWEIS: Nach der Zentrifugation sollte die obere Ölphase klar sein und der untere OB (mit Liposomen) sollte leicht trüb sein.</li>
		<li>Entfernen Sie die Ölphase vorsichtig per Pipette. Bei Bedarf zusätzliches Volumen absaugen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitze nicht an die Seite des Röhrchens legen, um zu vermeiden, dass ein Meniskus aus Öl auf der Liposomenphase entsteht.</li>
		<li>Mit einer neuen Pipette stecken Sie die Pipettenspitze langsam in die verbleibende untere Phase und saugen Sie das wässrige Volumen ab, um Liposomen zu sammeln. HINWEIS: Es ist besser, Volumen zu verlieren, als das Öl einzuarbeiten. Der Einschluss von Öl führt dazu, dass Liposomen reißen und die internen Komponenten in den externen Puffer freigesetzt werden. Schneiden Sie die Spitze einer Pipette ab, um die Scherung zu reduzieren.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mikroskopische Beobachtung
<ol><li>Gießen Sie 100 μL OB in die Vertiefung einer Inkubationskammer (4-Well-Platte mit 12 mm runden Deckgläsern). Die gesammelten Liposomen (Schritt 2.4.4) werden vorsichtig in OB gegeben und dann ein weiteres Deckglas auf die Kammer gelegt. HINWEIS: Der OB enthält das β-Kasein, um die Glasoberfläche zu passivieren und das Anhaften zwischen den Liposomen20 zu minimieren.</li>
	<li>Beobachten Sie Liposomen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Öl-Immersionsobjektiv. Verwenden Sie 488 nm, 647 nm und 561 nm Laserlinien, um fluoreszenzmarkiertes Lipid, verkapselten Fluoreszenzfarbstoff bzw. verkapseltes fluoreszierend markiertes Aktin zu beobachten. Erfassen Sie die gewünschten Frames und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format.</li>
	<li>Verarbeiten und analysieren Sie Bilder in ImageJ/Fiji39. Für neue Benutzer von ImageJ/Fiji steht ein Online-Tutorial zur Verfügung (siehe Materialtabelle).<ol><li>Öffnen Sie die TIFF-Datei mit der ImageJ/Fiji-Software.</li>
		<li>Gehen Sie zu Bild > passen Sie > Helligkeit/Kontrast an. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes auf den gewünschten Maßstab an, indem Sie die Einstellungen Minimum und Maximum sowie die Schieberegler Helligkeit und Kontrast anpassen.</li>
		<li>Klicken Sie in der Symbolleiste auf das Auswahlwerkzeug Rechteck und wählen Sie den gewünschten Bereich (ROI) aus. Gehen Sie zu Bild > Zuschneiden , um den ROI zu erhöhen.</li>
		<li>Wechseln Sie zu Analysieren > festgelegten Maßstab. Geben Sie im Popup-Fenster 1.0 in das Feld Pixel-Seitenverhältnis ein und legen Sie μm als Längeneinheit fest. Geben Sie im Feld Abstand in Pixel die Bildbreite in Pixel ein. Geben Sie im Feld Bekannte Entfernung die tatsächliche Bildbreite in Mikrometern ein.</li>
		<li>Um die Größe des Liposoms zu messen, zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug "Oval " in der Symbolleiste einen Kreis entlang der Kante des Liposoms. Gehen Sie zu Analysieren > Messen , um die Fläche des Kreises zu messen, aus der der Durchmesser des Liposoms berechnet werden kann.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg einer hohen Ausbeute an Liposomen während des Herstellungsprozesses. Um den Lipidfilm im Öl vollständig aufzulösen, muss die Probe beschallt werden, bis der Lipidfilm am Boden der Glasdurchstechflasche vollständig verschwindet. Nach der Beschallung muss das Lipid-Öl-Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen gelagert werden, damit sich die Lipidmoleküle weiter verteilenkönnen 29. Die Mischung kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelag...

Das Aktinzytoskelett spielt eine grundlegende Rolle beim Aufbau der intrazellulären Architektur der Zelle, indem es die Kontraktilität auf molekularer Ebene und die Krafterzeugung koordiniert 1,2,3. Infolgedessen vermittelt es zahlreiche essentielle zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zelldeformation4,5, Division6, Migration 7,8 und Adhäsion9. Die in vitro Rekonstitution von Aktinnetzwerken hat in den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erlangt 10,11,12,13,14,15,16,17. Das Ziel der Rekonstitution ist es, ein Minimalmodell der Zelle ohne die komplexe biochemische Regulation zu erstellen, die in lebenden Zellen existiert. Dies bietet eine kontrollierbare Umgebung zur Untersuchung spezifischer intrazellulärer Aktivitäten und erleichtert die Identifizierung und Analyse verschiedener Komponenten des Aktinzytoskeletts18,19. Darüber hinaus bietet die Verkapselung von in vitro Aktinnetzwerken in Phospholipid-Riesen-Unilamellenvesikeln (GUVs, Liposomen) einen begrenzten, aber deformierbaren Raum mit einer semipermeablen Grenze. Es ahmt die physiologische und mechanische Mikroumgebung der Aktinmaschinerie innerhalb der Zelle 9,20,21,22 nach.
Unter verschiedenen Methoden zur Herstellung von Liposomen ist die Lipidfilmhydratationsmethode (auch bekannt als Quellmethode) eine der frühesten Techniken23. Der trockene Lipidfilm hydratisiert unter Zugabe von Puffern und bildet membranöse Blasen, die schließlich zu Vesikeln werden24. Um größere Vesikel mit einer höheren Ausbeute zu erzeugen, wendet ein verbessertes Verfahren, das von der Filmhydratationsmethode fortschreitet, bekannt als Elektrobildungsmethode25, ein elektrisches Wechselstromfeld an, um den Hydratationsprozess26 effizient zu fördern. Die Haupteinschränkungen dieser hydratationsbasierten Methoden zur Aktinverkapselung bestehen darin, dass sie eine geringe Verkapselungseffizienz von hochkonzentrierten Proteinen aufweist und nur mit spezifischen Lipidzusammensetzungen kompatibel ist24. Die invertierte Emulsionstechnik hat im Vergleich dazu weniger Einschränkungen für Lipidkomponenten und Proteinkonzentrationen20,27,28,29. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung von Proteinen zur Verkapselung in den inneren wässrigen Puffer gegeben, der später in einer lipidhaltigen Mineralöllösung emulgiert wird, wobei Lipid-Monoschicht-Tröpfchen gebildet werden. Die einschichtigen Lipidtröpfchen durchqueren dann durch Zentrifugation eine weitere Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche, um zweischichtige Lipidvesikel (Liposomen) zu bilden. Diese Technik hat sich als eine der erfolgreichsten Strategien zur Aktinverkapselung24,30 erwiesen. Unabhängig davon gibt es einige mikrofluidische Gerätemethoden, einschließlich gepulstes Jetting31,32, transienten Membranauswurf 33 und das cDICE-Verfahren 34. Die Ähnlichkeiten zwischen der inversen Emulsionsmethode und der mikrofluidischen Methode sind das verwendete Lipidlösungsmittel (Öl) und die Einführung einer Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche für die Bildung des äußeren Blattes von Liposomen. Im Gegensatz dazu erfordert die Erzeugung von Liposomen durch das mikrofluidische Verfahren einen Aufbau mikrofluidischer Vorrichtungen und wird von Öl begleitet, das zwischen den beiden Blättchen der Doppelschicht eingeschlossen ist, was einen zusätzlichen Schritt zur Ölentfernung erfordert35.
In diesem Manuskript verwendeten wir die invertierte Emulsionstechnik, um Liposomen herzustellen, die ein polymerisiertes F-Aktin-Netzwerk einkapseln, wie zuvor verwendet22. Die Proteinmischung für die Verkapselung wurde zunächst in einen Puffer mit nichtpolymerisierenden Bedingungen gegeben, um Aktin in seiner globulären (G) Form zu erhalten. Der gesamte Prozess wurde bei 4 °C durchgeführt, um eine frühe Aktinpolymerisation zu verhindern, die später ausgelöst wurde, indem die Probe auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Bei Raumtemperatur polymerisiert das Aktin in seine filamentöse (F) Form. Eine Vielzahl von Aktin-bindenden Proteinen kann der inneren wässrigen Pufferlösung hinzugefügt werden, um Proteinfunktionalitäten und -eigenschaften zu untersuchen und so weitere Einblicke in ihre Interaktion mit dem Aktinnetzwerk und der Membranoberfläche zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch auf die Verkapselung verschiedener Proteine von Interesse36 und großer Objekte (Mikropartikel, selbstfahrende Mikroschwimmer usw.) nahe der Größe der endgültigen Liposomen 28,37 angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickelsalz (DOGS-NTA-Ni)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>231615773</td><td>Nickel Lipid</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane</td><td>Sigma</td><td>D27802-25G</td><td>DABCO</td></tr><tr><td>Aktinprotein (>99% rein): Kaninchen Skelettmuskel</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AKL99-D</td><td>nicht fluoreszierendes G-Aktin</td></tr><tr><td>Aktin Protein (Rhodamin): Kaninchen Skelettmuskel</td><td>Cytoskeleton, Inc</td><td>AR05</td><td>fluoreszierend markiertes</td></tr><tr><td>Aktin Adenosin 5&prime;-triphosphat Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma</td><td>A2383-10G</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Farbstoff</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Fluoreszenzfarbstoff</td></tr><tr><td>Andor iQ3</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>Steuerungs- und Erfassungssoftware für konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Arp2/3 Proteinkomplex: Porcine</td><td>Brain Cytoskeleton, Inc</td><td>RP01P-A</td><td>Arp 2/3</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>10035048</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Chamlid-Kammern (4-fach für 12 mm rundes Deckglas)</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>Inkubationskammer</td></tr><tr><td>Cofilin-Protein: humanes rekombinantes</td><td>Zytoskelett, Inc</td><td>CF01-C</td><td>Cofilin-Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>(63-faches Öl-Immersionsobjektiv)</td><td>Andor Technologies</td><td>LEICA DMi8</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glukose Dithiothreitol</td><td>DOT Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>DSD11000-10</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Gelsolin Protein: Homo sapiens rekombinantes</td><td>Zytoskelett, Inc</td><td>HPG6</td><td>Gelsolin</td></tr><tr><td>Hamilton 1750 gasdichte Spritze, 500 & Mikro; L, zementierte Nadel, 22 G, 2" konische Spitze</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-07940-53</td><td>Glasspritze</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/tutorials/</td></tr> <tr><td>L-alpha-Phosphatidylcholin</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>97281442</td><td>EPC</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>7786303</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Mineralöl, BioReagenz, für die Molekularbiologie, Leichtöl</td><td>Sigma</td><td>8042475</td><td>Mineralöl</td></tr><tr><td>N-WASP Fragment WWA (aa400&ndash; 501, VCA-His)</td><td></td><td></td><td>VCA-His wird unter Verwendung eines Laborprotokolls gereinigt. Das Protokoll kann auf begründete Anfrage zur Verfügung gestellt werden</td></tr><tr><td>: Oregongrün 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin (Oregongrün 488 DHPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>O12650</td><td>DHPE</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>7447407</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td>Saccharose</td></tr><tr><td>&beta;-Kasein aus Rindermilch</td><td>Sigma</td><td>C6905-250MG</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro rekonstitution des aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren vesikeln

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Das Aktinzytoskelett, die wichtigste mechanische Maschinerie in der Zelle, vermittelt zahlreiche wesentliche physikalische zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zellverformung, Teilung, Migration und Adhäsion. Die Untersuchung der Dynamik und Struktur des Aktinnetzwerks in vivo wird jedoch durch die biochemische und genetische Regulation innerhalb lebender Zellen erschwert. Um ein minimales Modell ohne intrazelluläre biochemische Regulation zu erstellen, wird Aktin in riesige unilamellare Vesikel (GUVs, auch Liposomen genannt) eingekapselt. Die biomimetischen Liposomen sind zellgroß und ermöglichen einen quantitativen Einblick in die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zytoskelett-Netzwerks, was einen gangbaren Weg für die synthetische Bottom-up-Biologie eröffnet. Um Liposomen für die Verkapselung zu erzeugen, wird die invertierte Emulsionsmethode (auch als Emulsionstransfermethode bezeichnet) verwendet, eine der erfolgreichsten Techniken zur Verkapselung komplexer Lösungen in Liposomen, um verschiedene zellnachahmende Systeme herzustellen. Bei dieser Methode wird dem inneren Puffer eine Mischung interessanter Proteine zugegeben, die später in einer phospholipidhaltigen Mineralöllösung zu einschichtigen Lipidtröpfchen emulgiert wird. Die gewünschten Liposomen werden aus einschichtigen Lipidtröpfchen erzeugt, die eine Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche kreuzen. Diese Methode ermöglicht die Verkapselung konzentrierter Aktinpolymere in die Liposomen mit gewünschten Lipidkomponenten und ebnet den Weg für die in vitro Rekonstitution eines bioimitierenden Zytoskelett-Netzwerks.

Die Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik ist in Abbildung 1 grafisch und schematisch dargestellt.
Zunächst wurden leere (nackte) Liposomen (~5-50 μm Durchmesser) hergestellt, die aus Phospholipid (EPC) und fluoreszierendem Lipid (DHPE) zusammengesetzt waren. Ein heller, tiefroter Fluoreszenzfarbstoff wurde als Kontrollexperiment in nackte Liposomen eingekapselt. Ob sich eine Lipidmonoschicht erfolgreich in der Peripherie des Tröpfchens...

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Diese Maßnahme erstellt ein Minimalmodell der Zelle ohne komplexe biochemische Vorschriften. Die verwendete Technik kann eine hohe Ausbeute an Liposomen erzeugen und eine hohe Verkapselungseffizienz für Zytoskelettproteine aufweisen. Diese Maßnahme kann auf die Verkapselung einer Vielzahl von Proteinen und großen Objekten wie Mikropartikeln und selbstvorbereitenden Mikroschwimmern angewendet werden.Ein Individuum kämpft darum, die Liposomenausbeute für die ersten Versuche zu erhöhen. Es wird empfohlen, regelmäßig einen Abschnitt des Manuskripts zu diskutieren, um weitere Details zu erhalten, um die Ausbeute zu erhöhen. Zu Beginn wird der wässrige innere Nichtpolymerisationspuffer in einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter hergestellt, indem 0,1 Millimolar CACL zwei, 10 Millimolar HEPES, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DAPCO, 320 Millimolar Saccharose und 0,2 Millimolar ATP gemischt werden.Bereiten Sie die Proteinmischung vor, indem Sie Proteine in den inneren Nichtpolymerisationspuffer bei vier Grad Celsius geben. Um eine Aktinschicht zu bilden, fügen Sie der Proteinmischung 100 nanomolares Gellcalin, vier mikromolare Hustensäure und 2,2 mikromolare VCA HEZ hinzu. Als Kontrollexperiment ersetzen Sie die Proteinmischung durch 100 Mikrogramm pro Milliliter Fluoreszenzfarbstoff.Bereiten Sie den wässrigen inneren Polymerisationspuffer in einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter durch Mischen von 100 Millimolarkaliumchlorid vor. Vier Millimolar Magnesiumchlorid, 10 Millimolar HEPES, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DABCO, 10 Millimolar ATP und 80 Millimolar Saccharose. Bereiten Sie den endgültigen Puffer vor, indem Sie den inneren Nichtpolymerisationspuffer und den inneren Polymerisationspuffer in einem Volumenverhältnis von eins zu eins mischen, um die innere wässrige Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern zu erhalten, das im Liposom eingekapselt wird.Bereiten Sie den wässrigen Außenpuffer in einem Gesamtvolumen von 150 Mikrolitern vor, indem Sie 10 Millimolar HEPES, 50 Millimolar Kaliumchlorid, zwei Millimolar Magnesiumchlorid, 0,2 Millimolar Calciumchlorid, zwei Millimolar ATP, ein Millimolar DTT, 0,5 Millimolar DAPCO, 212 Millimolar Glucose und 0,1 Milligramm pro Milliliter Beta-Gehäuse mischen. Um die Lipidölmischung vorzubereiten, beginnen Sie mit der Zugabe von 100 Mikrolitern von 25 Milligramm pro Milliliter EGGPC in eine Glasdurchstechflasche. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas und hinterlassen Sie einen trockenen festen Lipidfilm am Boden der Durchstechflasche.Um eine Aktinschicht zu bilden, fügen Sie Nickellipid in einem Verhältnis von 10 zu eins von EGGPC zu Nickellipid hinzu und mischen Sie es, bevor Chloroform verdampft wird. Fügen Sie zwei Milliliter Mineralöl hinzu. Verdampfen Sie das Chloroform und beschallen Sie die Lipidölmischung bei Raumtemperatur in einem Bad für eine Stunde, um die Lipide zu resuspendieren.Bereiten Sie eine abschließende Puffer-in-Öl-Emulsion zur Herstellung von Monolayer-Lipidtröpfchen vor, die das interessierende Protein enthalten. Beginnen Sie mit der Einnahme von 100 Mikrolitern der Lipidölmischung in einem Kunststoffröhrchen und fügen Sie der Lipidölmischung 10 Mikroliter Endpuffer hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich der letzte Puffer in einem Tröpfchen befindet.Ziehen Sie mit einer Glasspritze zuerst eine kleine Menge Lipidölgemisch und dann den endgültigen Puffertropfen, indem Sie die Spitze der Spritze an die Peripherie des Tröpfchens legen, um es in winzige Tröpfchen aufzubrechen. Mehrmals vorsichtig auf und ab saugen, bis sich eine trübe Emulsion bildet. Geben Sie 30 Mikroliter Außenpuffer in ein separates Kunststoffrohr.Legen Sie 30 Mikroliter der Lipidölmischung auf den äußeren Puffer und lassen Sie sie etwa 10 Minuten ruhen, um eine Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zu entwickeln. Um Liposomen herzustellen, fügen Sie vorsichtig 50 Mikroliter der endgültigen Pufferölemulsion in die oberste Ölphase des Röhrchens hinzu. Zentrifugieren Sie das Kunststoffröhrchen bei 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Variieren Sie Zeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die Liposomenbildung zu optimieren. Entfernen Sie vorsichtig die Ölphase, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Volumen absaugen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitze nicht an die Seite des Röhrchens legen, um zu vermeiden, dass ein Meniskus aus Öl auf der Liposomenphase entsteht.Schneiden Sie mit einer neuen Pipette die Spitze der Pipette ab. Stecken Sie die Pipette langsam in die verbleibende untere Phase und saugen Sie das wässrige Volumen ab, um Liposomen zu sammeln. Gießen Sie 100 Mikroliter Außenpuffer in den Brunnen einer Inkubationskammer.Legen Sie die gesammelten Liposomen vorsichtig in den äußeren Puffer ab und legen Sie dann einen weiteren Abdeckstreifen auf die Kammer. Beobachten Sie Liposomen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Öl-Tauchobjektiv. Verwenden Sie 488, 647 und 561 Nanometer Laserlinien.Zur Beobachtung fluoreszierend markierter Lipide, verkapselter Fluoreszenzfarbstoff bzw. verkapseltes fluoreszenzmarkiertes Aktin. Erfassen Sie die gewünschten Frames und speichern Sie die Bilder im TIF-Format. Verarbeiten und analysieren Sie Bilder in Bild J.Start, indem Sie die TIF-Datei mit der Image J-Software öffnen.Gehe zum Bild und klicke dann auf "Anpassen". Passen Sie anschließend den Helligkeitskontrast an Helligkeit und Kontrast des Bildes an den gewünschten Maßstab an, indem Sie die minimalen und maximalen Einstellungen sowie die Helligkeits- und Kontrastregler anpassen. Klicken Sie auf das Rechteckauswahlwerkzeug in der Symbolleiste und wählen Sie den gewünschten Bereich aus.Gehen Sie zum Bild und klicken Sie dann auf Zuschneiden, um den ROI zu beschneiden. Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie dann auf Maßstab festlegen. Geben Sie im Popup-Fenster 1,0 in das Feld Pixel-Seitenverhältnis ein und legen Sie Mikrometer als Längeneinheit fest.Geben Sie im Feld Abstand in Pixel die Bildbreite in Pixel ein. Geben Sie im Feld Bekannte Entfernung die tatsächliche Bildbreite in Mikrometern ein. Um die Größe des Liposoms zu messen, zeichnen Sie mit dem ovalen Auswahlwerkzeug in der Symbolleiste einen Kreis entlang der Kante des Liposoms.Gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie dann auf Messen, um die Fläche des Kreises zu messen, aus der der Durchmesser des Liposoms berechnet werden kann. Die erfolgreiche Liposomenerzeugung wird durch die Visualisierung des dünnen kreisförmigen Rings, der grün fluoreszierenden Lipiddoppelschicht, verifiziert. Unter einem 488-Nanometer-Laser mit konfokaler Mikroskopie zur Bestätigung der Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs.Die innere Umgebung der Liposomen sollte unter einem 647-Nanometer-Laser gleichmäßig fluoreszierend sein. Die Bildung von Liposomen konnte durch die dünnen grünen kreisförmigen Ringe sichtbar gemacht werden. Die rekonstituierten Affekte in Netzwerken innerhalb von Liposomen sind heterogen und manifestieren sich als verzweigte Netzwerkstrukturen von Aktinfilamenten.Die Zweigarchitektur wurde durch die Einführung des ARP two three complex ausgelöst, der zusammen mit VCA HEZ gleichzeitig die Keimbildung und Verzweigung von Aktinfilamenten steuert. Am inneren Blättchen der Doppelschicht von Liposomen entsteht eine dünne, aber dicht verzweigte Aktinschicht, die als fluoreszierender Schicht sichtbar gemacht werden kann. Die Lipid-Audio-Endpuffermischung muss im Allgemeinen durch eine Glasspritze hin und her gepumpt werden, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden.Die Mischung muss nach dem Prozess weißlich sein. Diese Technik ebnete den Weg für den Aufbau eines Minimalmodells der Zelle, frei von komplexen biochemischen Vorschriften. Mit diesem zellnachahmenden System können Forscher die mechanischen und dynamischen Eigenschaften von Zytoskelettproteinen, Nukleator und molekularem Motor erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

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Dieses Protokoll beschreibt das invertierte Emulsionsverfahren, das zur Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems (CFE) in einem riesigen unilamellären Vesikel (GUV) zur Untersuchung der Synthese und des Einbaus eines Modellmembranproteins in die Lipiddoppelschicht verwendet wird.

Rekonstitution des bakteriellen Glutamatrezeptorkanals durch Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems

In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von zusammengesetzten Riesen-Unilamellären Vesikeln (cGUVs) mit einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur mit angepasster elektrischer Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich vorgestellt. Bei der Elektroformation werden einfache GUVs synthetisiert, die durch osmotischen Schock in Stomatozyten und cGUVs umgewandelt werden, was ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Biophysik kernhaltiger Zellen darstellt.

Synthese von zusammengesetzten Riesen-Unilamellenvesikeln: Ein biomimetisches Modell von Keimzellen

In diesem Artikel wird eine einfache Ein-Topf-Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken innerhalb von phasengetrennten Riesenvesikeln vorgestellt. Die Methode kann verallgemeinert und auf die Verkapselung oder den Einschluss einer Vielzahl von Biomolekülen angewendet werden.

In vitro Rekonstitution von Zytoskelett-Netzwerken in phasengetrennten riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs)

Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen.

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

Lernen Sie die Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln für Biophysik und Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die Kapselung von Proteinen mit hoher Ausbeute.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

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