Eine halbautomatische und reproduzierbare biologisch basierte Methode zur Quantifizierung der Kalziumablagerung in vitro

Unsere Methode ermöglicht es, die Verkalkungsneigung von Patientenproben mit humanen vaskulären glatten Muskelzellen zu messen. Dies wird dazu beitragen, die Erforschung von Gefäßverkalkungsstörungen voranzutreiben und die Entwicklung neuer Therapien zu unterstützen. Diese Technik verwendet eine fluoreszierende Detektion, die die Empfindlichkeit erhöht und es ermöglicht, Proben im Laufe der Zeit zu messen, wodurch der Bedarf an Replikaten reduziert und die Robustheit erhöht wird.

Zu Beginn kultivieren Sie menschliche glatte Gefäßmuskelzellen auf unbeschichteten Zellkulturkolben bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Teilen Sie die Zellen bei Erreichen von 70 bis 90%Konfluenz. Zum Spalten die HVSMCs zweimal mit PBS waschen.

Trypsin hinzufügen und 2 bis 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Hemmen Sie die Trypsinreaktion, indem Sie ein serumhaltiges Medium hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 4 Minuten bei 350 RCF und resuspendieren Sie das Pellet in einem Wartungsmedium.

Nachdem Sie die Zellen wie gezeigt für eine Spaltung vorbereitet haben, zählen und säen Sie die Zellen in eine 48-Well-Platte, um das Verkalkungsexperiment zu starten. Nach nächtlicher Inkubation bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen und nach der zweiten Wäsche alle verbleibenden PBS vorsichtig absaugen. Verkalkungsmedium vorsichtig zugeben und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid weiter inkubieren.

Überprüfen Sie täglich mit einem Lichtmikroskop, bis eine Verkalkung auftritt. Um Verkalkungen durch Bildgebung zu erkennen, öffnen Sie die Software und wählen Sie Protokolle und Neu erstellen. Wählen Sie Verfahren und klicken Sie auf Temperatur einstellen.

Stellen Sie die Temperatur im Popup-Fenster auf 37 Grad Celsius und den Farbverlauf auf 1 Grad Celsius ein und klicken Sie auf OK. Wählen Sie den gewünschten Plattentyp aus dem Dropdown-Menü aus. Fügen Sie den Imaging-Schritt hinzu, indem Sie auf Image klicken. Wählen Sie den Inverted Imager aus und klicken Sie auf OK. Fügen Sie drei Bildkanäle hinzu und stellen Sie sie auf DAPI, RFP und Hellfeld ein.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Montage und legen Sie die gewünschte Anzahl und Position der Bilder fest. Ändern Sie die Überlappung, um eine bessere Abdeckung jedes Bohrlochs darzustellen. Wählen Sie aus, welche Vertiefungen abgebildet werden sollen.

Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die interessierenden Brunnen ausgewählt werden können. Klicken Sie auf Fokusoptionen, um den Fokusmodus festzulegen. Es öffnet sich ein neues Fenster.

Stellen Sie jeden Kanal einzeln ein. Im Allgemeinen werden Wells automatisch auf den DAPI-Kanal fokussiert. Stellen Sie alle anderen Kanäle vom ersten Kanal auf Festbrennweite ein und legen Sie sie fest, indem Sie auf OK klicken. Schließen Sie das Fenster.

Starten Sie die Schritte zur Voreinstellung der Datenreduktion, indem Sie auf Datenreduktion klicken und Bildvorverarbeitung auswählen. Übernehmen Sie die Standardeinstellungen, indem Sie OK auswählen. Richten Sie einen Schritt zum Zählen der Zellen ein, indem Sie Zellanalyse auswählen. Wählen Sie TsF DAPI Images aus dem Kanal-Dropdown-Menü aus.

Stellen Sie weitere Details ein, nachdem die Bildgebung durchgeführt wurde. Bereiten Sie die Analyse des RFP-Signals vor, indem Sie im Popup-Fenster Beschriftungsschritt Statistik auswählen und TsF RFP als Eingangskanal auswählen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Oberer Wert und Unterer Wert.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Gesamtfläche in der unteren Liste. Wählen Sie in der Spalte Farbeffekt die Option Keine aus. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Benutzerdefiniert und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hintergrund.

Drücken Sie OK. Für eine faire Anzeige normalisieren Sie das RFP-Signal pro Zelle, indem Sie Ratio auf der linken Seite drücken. Wählen Sie im Popup-Fenster RFP-Quantifizierungsgesamtfläche aus. Wählen Sie für Dateneingabe 1 aus dem Dropdown-Menü Zellenanzahl als Dateneingabe 2 aus.

Wählen Sie abschließend einen neuen Datensatznamen aus und drücken Sie zweimal OK. Wählen Sie Farbeffekt wie zuvor gezeigt, klicken Sie OK.In der oberen linken Ecke, wählen Sie Datei und speichern Sie die Datei als Protokolldateityp. Zeichnen Sie Beobachtungen für jeden Zeitpunkt nach dem ersten Verkalkungsfall auf.

Drücken Sie in der Startsoftware auf Jetzt lesen und klicken Sie auf Vorhandenes Protokoll. Wählen Sie das im vorherigen Schritt erstellte Protokoll aus. Das Programm fordert Sie auf, das Experiment zu speichern.

Dies kann zu diesem Zeitpunkt oder später manuell erfolgen, indem Sie oben links auf die Schaltfläche Speichern klicken. Ein Popup-Fenster fordert Sie auf, zu warten, bis sich das System erwärmt hat. Schalten Sie den Kohlendioxid-Gasregler ein und stellen Sie ihn auf 5% einSobald das System die eingestellte Temperatur erreicht hat, wird eine Aufforderung angezeigt, eine Platte einzulegen und zu lesen.

Drücken Sie Abbrechen. Transportieren Sie die Platte vom Inkubator zum Imager in einem Safe, um Bruch und Verschütten zu vermeiden, und entspricht den lokalen Biosicherheitsvorschriften für den Transport lebender Zellen im Falle eines Unfalls. Legen Sie die Platte in das Plattenlesegerät.

Klicken Sie auf Verfahren. Wählen Sie im Popup-Fenster Preset Imaging Step aus. Passen Sie zuerst den Fokus und die Belichtung auf dem DAPI-Kanal an.

Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Automatische Belichtung" bei allen Kanälen, und klicken Sie dann auf das Mikroskopsymbol neben dem DAPI-Kanal. Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie die Vertiefung aus, um den Fokus zu lenken.

Wenn bereits ein Signal sichtbar ist, klicken Sie zuerst auf Autofokus und dann auf Automatische Belichtung. Wenn nicht, erhöhen Sie zuerst die Belichtung und wiederholen Sie den Autofokus und die automatische Belichtung. Die Belichtung kann manuell angepasst werden, indem Sie das Dropdown-Menü Belichtung auswählen.

Überprüfen Sie die Einstellungen für mehrere Bohrlöcher und speichern Sie dann die Einstellungen. Stellen Sie die Belichtung für alle Kanäle auf die gleiche Weise ein. Stellen Sie für den RFP-Kanal sicher, dass Sie mit einem Bohrloch mit mittlerer bis hoher Verkalkung beginnen.

Schließen Sie das Prozedurfenster und wählen Sie die grüne Schaltfläche Jetzt lesen in der oberen Taskleiste. Speichern Sie das Experiment wie von der Software angegeben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zeitpunkt.

Während das System die Platte liest, werden alle Bilder automatisch im Hintergrund verarbeitet. Passen Sie die Einstellungen für die Zellanzahl an, indem Sie TsF-DAPI-Bilder auswählen, die angezeigt werden sollen. Wählen Sie den Brunnen Ihrer Wahl durch Doppelklick aus.

Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie eines der Bilder aus. Wählen Sie im Popup-Fenster die Registerkarte Analyse aus.

Wählen Sie Cell Analysis Cell Count (Zellanalyse-Zellanzahl) und klicken Sie auf OK. Deaktivieren Sie die Kanäle RFP und Hellfeld. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Objekte hervorheben. Klicken Sie auf Optionen, um das Menü zu öffnen.

Passen Sie den Schwellenwert für Größe und Intensität an, um alle Kerne einzubeziehen, aber Schmutz auszuschließen, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie unten links auf Änderungen übernehmen, um die Einstellungen auf alle Bilder anzuwenden. Wählen Sie auf ähnliche Weise ein Well-End-Bild mit einer mittleren bis hohen Menge an Verkalkung. Um das Signal-Rausch-Verhältnis optimal anzupassen, klicken Sie im Menü Task auf die Registerkarte Analyse.

Wählen Sie Bildstatistik aus. Deaktivieren Sie den DAPI- und Hellfeldkanal. Klicken Sie auf Optionen, um das Menü zu öffnen.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Schwellenwertausreißer. Um den nicht subjektiven Schwellenwert für das Signal über dem Hintergrund festzulegen, wählen Sie in der Taskleiste das Linienwerkzeug aus. Es öffnet sich ein Fenster.

Zeichnen Sie eine Linie durch ein Signalfeld, während Sie einen Bereich des Hintergrunds einschließen. Passen Sie die oberen und unteren Werte der Schwellenwerte an. Zählen Sie nur das Signal über dem Hintergrund und schließen Sie aus, wenn Trümmer oder Artefakte vorhanden sind.

Klicken Sie auf OK und übernehmen Sie die Änderungen, um die Einstellungen auf alle anderen Bohrlöcher zu übertragen. Vergewissern Sie sich, dass der Schwellenwert in den anderen Vertiefungen genau ausgewählt ist. Sobald die Zellzahl und die RFP-Schwellenwerte festgelegt sind, exportieren Sie die Daten.

Klicken Sie auf die Excel-Schaltfläche neben dem Dropdown-Menü, um die Daten direkt in eine Tabelle zu exportieren. Verschiedene Verkalkungsstadien von niedrig bis hoch wurden detektiert und analysiert. Verkalkungen wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie als schwarze Sprenkel entdeckt, die für die primäre Beurteilung und die Bestimmung des Zeitpunkts für den Beginn der Bildgebung nützlich waren.

Für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis wurden die verarbeiteten RFP-Bilder analysiert, um die Verkalkung zu quantifizieren. Die Daten wurden durch den Vergleich von zwei oder mehr Bedingungen zum gleichen Zeitpunkt erhalten. Die Daten wurden auf die Zellzahl als Verkalkungsfläche pro Zelle normalisiert.

Die Daten wurden auch als Zeitreihe dargestellt, die den gleichen Zustand zu verschiedenen Zeitpunkten zeigt. Es ist wichtig, dass die Ergebnisse nach Datenreduktion und Analyse immer noch das widerspiegeln, was man vor der Bildtransformation und Schwellenwertbildung sehen kann.