Name: Herstellung und Verwendung von trockenen makroporösen Alginatgerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Drydux-Alginsäuregerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen. Diese Methode erreicht über 85% Effizienz und bietet eine kostengünstigere Alternative zu RetroNectin-beschichteten Platten für CAR-T-Zelltherapien.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health durch die Grant Award Nummern R37-CA260223, R21CA246414 unterstützt. Wir danken dem NCSU-Durchflusszytometrie-Kern für die Schulung und Anleitung zur Durchflusszytometrie-Analyse. Schaltpläne wurden mit Biorender.com erstellt

Alle Verfahren mit menschlichen Primacy-Zellen und retroviralen Vektoren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für biologische Sicherheit der North Carolina State University durchgeführt und vom Environmental Health and Safety Office genehmigt. Menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden als Buffy-Mäntel aus kommerziellen Quellen gekauft. Primäre menschliche Zellen müssen aus menschlichen Buffy-Fellfraktionen isoliert werden und erfordern eine Freigabe der Biosicherheitsstufe 2 sowie detaillierte Standardarbeitsanweisungen und die Genehmigung der Institution, in der die Arbeit stattfinden soll. Virale Vektoren, einschließlich der retroviralen Vektorüberstände, die für die zuvor beschriebene Transduktion verwendet werden19, können je nach kodiertem Protein entweder als Biosicherheitsstufe 1 oder Biosicherheitsstufe 2 eingestuft werden und bedürfen der Genehmigung durch den zuständigen institutionellen Ausschuss für biologische Sicherheit.
1. Herstellung der makroporösen Alginatgerüste
<ol><li>Eine Stammlösung von 0,4% (Gewicht pro Volumen) Calcium-D-Gluconat wird durch Zugabe von steril gefiltertem entionisiertem Wasser zu Calcium-D-Gluconat in einem Becherglas hergestellt. Bei mittlerer Geschwindigkeit umrühren, bis sich das Calciumgluconat aufgelöst hat (~1,5 h), steril filtern und bei Raumtemperatur lagern. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den pH-Wert der Lösung zu überprüfen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung von 2% (Gewicht pro Volumen) Alginat in einer Durchstechflasche oder einem Becherglas mit Schraubverschluss vor. Geben Sie das hochreine Alginat vorsichtig in das Gefäß und fügen Sie dem Alginat steril gefiltertes entionisiertes Wasser hinzu. Wählen Sie den größtmöglichen Rührstab, der das Mischen nicht behindert, und fügen Sie ihn dem Gefäß hinzu. HINWEIS: Informationen über die Art des hochreinen Alginats, das für dieses Protokoll verwendet wird, finden Sie in der Materialtabelle und auf der Novamatrix-Website20. Verschiedene Alginate wurden für diese Gerüste nicht untersucht, da sie zu unerwünschten Veränderungen der Porosität und Biokompatibilität der Gerüste führen können 9,10,11.</li>
	<li>Rühren Sie die Lösung auf hoher Geschwindigkeit, bis sich das Alginat auflöst (~ 1 h). Wenn sich an den Seiten des Gefäßes große Klumpen befinden, neigen Sie das Gefäß, um sie zu entfernen. Kleine Mengen Alginat an den Seiten lösen sich beim Rühren auf und sind kein Grund zur Besorgnis. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, den pH-Wert der Lösung zu überprüfen.</li>
	<li>Wenn sich das Alginat auflöst, reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit, fügen Sie der Alginatlösung langsam ein gleiches Volumen von 0,4% Calcium-D-Gluconat hinzu, um die Bildung von Vernetzungsklumpen zu verhindern, und rühren Sie kräftig für 15 min.</li>
	<li>Neigen Sie das Becherglas oder die Durchstechflasche zur Seite, um eventuell gebildete Klumpen zu entfernen. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Homogenisator zu verwenden. Die endgültige Lösung sollte optisch klar sein.</li>
	<li>Pipettieren Sie das gewünschte Volumen der Lösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte oder 24-Well-Platte. Verwenden Sie 300 μL/Welle für eine 48-Well-Platte und 1 ml/Welle für eine 24-Well-Platte. Gießen Sie langsam und wechseln Sie die Spitzen häufig, da die Lösung viskos ist und an der Spitze haften bleibt.</li>
	<li>Die Teller mit Deckeln abdecken und über Nacht bei -20 °C einfrieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Platte für den Gefriertrockner vor, indem Sie den Deckel entfernen und die Oberseite mit Tüchern und Gummibändern sichern. Legen Sie die Platten in 750 ml bis 2.000 ml Gefriertrocknungskolben und legen Sie sie für 72 h auf den Gefriertrockner.</li>
	<li>Nach 72 h die Platte aus dem Gefriertrockner nehmen und den Deckel wieder einsetzen. Die Platte verschließen und bei 4 °C lagern. Für eine Langzeitlagerung vakuumverschließen Sie die Platte vor der Lagerung bei 4 °C. Trocken lagern, bis sie benötigt werden. HINWEIS: Stellen Sie aufgrund eines Volumenfehlers eine zusätzliche Calcium-Alginat-Lösung her (einige kleben an den Wänden der Durchstechflasche, Pipettenspitzen). Zum Beispiel, um vier Gerüste in einer 24-Well-Platte herzustellen, sind 4 ml kombinierte Lösung (2 ml Alginat + 2 ml Calcium-D-Gluconat) erforderlich, aber es wird empfohlen, 2,5 ml 2% ige Alginatlösung und 2,5 ml 0,4% ige Calcium-D-Gluconatlösung herzustellen.</li>
</ol>2. Transduktion
<ol><li>Konzentration des viralen Überstands mit 100 kDa-Filtern<ol><li>Hydratisieren Sie den Zentrifugalfilter für 2 min mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Verwerfen Sie den PBS.</li>
		<li>Die virale Suspension wird konzentriert, indem Sie 2 ml Virussuspension (1 × 106 TU/ml) zugeben und durch den Zentrifugalfilter bei 1.500 × g für 10 min in einem schwingenden Schaufelrotor zentrifugieren. HINWEIS: Pro Gerüst werden ein bis zweihundert Mikroliter konzentriertes Virus benötigt.</li>
		<li>Für einige zusätzliche Minuten drehen, wenn das Volumen der konzentrierten Virussuspension größer als 200 μL ist.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.3 für jedes Gerüst. HINWEIS: Es ist auch akzeptabel, einen großen Virusvorrat zu konzentrieren und 100-200 μL Aliquots aus dem konzentrierten Bestand zu entnehmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Samenaktivierte Zellen und Virus zusammen.<ol><li>Bereiten Sie für jedes Gerüst ein Aliquot vor, indem Sie 1 × 106 aktivierte mononukleäre Blutzellen (PBMCs) in 50 μL vollständiger Zellkulturmedien (250 ml Click-Medien + 250 ml RPMI 1640 Medien + 50 ml fetales Rinderserum + 5 ml Glutaminersatz + 5 ml Penicillin / Streptomycin) suspendieren. Hinweis: Ein Protokoll zur Aktivierung von PBMCs finden Sie in der Zusatzdatei 1 .</li>
		<li>Fügen Sie den konzentrierten viralen Überstand (~2 × 106 TU, MOI 2) zur Zellsuspension hinzu. Das Gesamtvolumen der Zellvirussuspension sollte 200 μL für ein 48-Well-Gerüst oder 350 μL für ein 24-Well-Gerüst nicht überschreiten.</li>
		<li>Fügen Sie die Zell-Virus-Mischung tropfenweise auf die Oberseite des trockenen Gerüsts hinzu. Verwenden Sie für Negativkontrollexperimente vollständige Zellkulturmedien anstelle des konzentrierten Virus. Fügen Sie die Zellsuspension oben auf das trockene Gerüst ein.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.3 für jedes Gerüst.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Gerüste in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 45-60 min. Entfernen Sie die Gerüste aus dem Inkubator; Die Gerüste absorbieren die Lösung während dieser Zeit vollständig.</li>
		<li>Um die Proliferation zu induzieren, fügen Sie vollständige Zellkulturmedien, ergänzt mit IL-15 (5 ng / ml) und IL-7 (10 ng / ml) zu jeder Vertiefung; IL-2 kann auch verwendet werden. Fügen Sie 500 μL zu jedem 48-Well-Gerüst oder 1 ml zu jedem 24-Well-Gerüst hinzu.</li>
		<li>Die Gerüste bei 37 °C 72 h inkubieren. Wenn sich die Zellen vermehren, werden die Medien orange.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolieren Sie Zellen aus den Gerüsten für die Analyse.<ol><li>0,5 M EDTA in 1x PBS auf 0,25 M EDTA verdünnen.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges Medium aus jeder Vertiefung und sammeln Sie es in separaten 15-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Um Zellen aus dem Gerüst zu isolieren, fügen Sie 0,25 M EDTA zu jedem Gerüst hinzu. Fügen Sie 300 μL zu 48-Well-Gerüsten oder 1 ml zu 24-Well-Gerüsten hinzu. Lassen Sie den Teller 3-4 min ruhen oder rühren Sie ihn vorsichtig um.</li>
		<li>Sobald das Gerüst größtenteils aufgelöst ist, pipettieren Sie vorsichtig im Inneren des Brunnens. Ein paar ein- und ausgehende Pipettierschritte können notwendig sein, um das Gerüst vollständig aufzulösen. Wenn es sich nicht in 10 min auflöst, fügen Sie weitere 200 μL 0,25 M EDTA hinzu.</li>
		<li>Sobald sich das Gerüst vollständig aufgelöst hat, geben Sie die Lösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.4 und 2.3.5 für jedes Gerüst.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 12 ml PBS in jedes Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 × g für 5 min zentrifugieren. Am Boden jedes Röhrchens bildet sich ein Zellpellet. Saugen Sie den Überstand ab und wiederholen Sie die Wäsche. Achten Sie darauf, den Überstand bei jeder Wäsche vollständig abzusaugen, da es wichtig ist, das gesamte EDTA zu entfernen.</li>
		<li>Nach der zweiten Wäsche mit PBS ist das Zellpellet nun bereit für die Analyse. Befolgen Sie das entsprechende Protokoll, das für die Analyse erforderlich ist.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

P.A. und Y.B. sind Erfinder von Patenten im Zusammenhang mit der Verwendung von Biomaterialien zur Erzeugung von CAR-T-Zelltherapeutika. Y.B. erhält ein von der Industrie gesponsertes Forschungsstipendium im Zusammenhang mit der therapeutischen CAR-T-Zelltechnologie (unabhängig von dieser Arbeit). Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.

Die CAR-T-Zelltherapie gewinnt weiterhin an Interesse sowohl für die Forschung als auch für kommerzielle Anwendungen. Trotz des Erfolgs der CAR-T-Zelltherapie bei der Behandlung von Blutkrebs schränken die hohen Kosten des Verfahrens seine Verwendung ein. Das hier vorgestellte Protokoll stellt eine neue Methode für den viralen Gentransfer von T-Zellen vor, ohne dass eine Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten erforderlich ist. Die Herstellung trockener makroporöser Alginatgerüste zur Vermittlung der Transdukt...

Die Immuntherapie hat sich aufgrund ihrer Fähigkeit, Tumore spezifisch anzugreifen, die Off-Target-Zytotoxizität zu begrenzen und einen Rückfall zu verhindern, zu einem revolutionären Krebsbehandlungsparadigma entwickelt. Insbesondere die chimäre Antigenrezeptor-T (CAR-T) -Zelltherapie hat aufgrund ihres Erfolgs bei der Behandlung von Lymphomen und Leukämien an Popularität gewonnen. Die FDA hat die erste CAR-T-Zelltherapie im Jahr 2017 zugelassen und seitdem vier weitere CAR-T-Zelltherapien 1,2,3,4,5 zugelassen. CARs haben eine Antigenerkennungsdomäne, die normalerweise aus einem einkettigen variablen Fragment eines monoklonalen Antikörpers besteht, der spezifisch für ein tumorassoziiertes Antigen 3,4 ist. Wenn eine CAR mit ihrem tumorassoziierten Antigen interagiert, werden die CAR-T-Zellen aktiviert, was zu einer Antitumorreaktion mit Zytokinfreisetzung, zytolytischer Degranulation, Transkriptionsfaktorexpression und T-Zellproliferation führt. Um CAR-T-Zellen zu produzieren, wird Blut vom Patienten gesammelt, um seine T-Zellen zu erhalten. CARs werden den T-Zellen des Patienten mit Hilfe eines Virus genetisch hinzugefügt. Die CAR-T-Zellen werden in vitro gezüchtet unddem Patienten 2,3,4,6 wieder infundiert. Die erfolgreiche Erzeugung von CAR-T-Zellen wird durch die Transduktionseffizienz bestimmt, die die Anzahl der T-Zellen beschreibt, die genetisch zu CAR-T-Zellen verändert werden.
Derzeit ist der Goldstandard für die CAR-T-Zellerzeugung die Spinokulation von aktivierten T-Zellen und Viren auf retronektinbeschichteten Platten 7,8. Die Transduktion beginnt, wenn Viruspartikel mit der Oberfläche der T-Zellen interagieren. Retronectin fördert die Kolokalisierung von Virus und Zellen, indem es die Bindungseffizienz zwischen den Viruspartikeln und den Zellen erhöht und die Transduktion verbessert 7,8. Retronectin allein wirkt nicht gut und muss von einer Spinokulation begleitet werden, die den Gentransfer verbessert, indem sie die Viruspartikel konzentriert und die Oberflächenpermeabilität der T-Zelle erhöht, was eine leichtere Virusinfektion ermöglicht8. Trotz des Erfolgs der Spinokulation auf retronektinbeschichteten Platten ist es ein komplexer Prozess, der mehrere Spinzyklen und teure Reagenzien erfordert. Daher sind alternative Methoden für den viralen Gentransfer, die schneller und billiger sind, sehr wünschenswert.
Alginat ist ein natürliches anionisches Polysaccharid, das in der biomedizinischen Industrie aufgrund seiner niedrigen Kosten, seines guten Sicherheitsprofils und seiner Fähigkeit, Hydrogele beim Mischen mit zweiwertigen Kationen 9,10,11,12 zu bilden, häufig verwendet wird. Alginat ist ein GMP-konformes Polymer und wird von der FDA13 allgemein als sicher (GRAS) anerkannt. Die Vernetzung von Alginat mit Kationen erzeugt stabile Hydrogele, die häufig in der Wundheilung, der Abgabe kleiner chemischer Medikamente und Proteine und des Zelltransports verwendetwerden 9,10,11,12,14,15,16. Aufgrund seiner hervorragenden Geliereigenschaften ist Alginat das bevorzugte Material zur Herstellung poröser Gerüste durch Gefriertrocknung10,17. Diese Eigenschaften von Alginat machen es zu einem attraktiven Kandidaten für die Herstellung eines Gerüsts, das den viralen Gentransfer aktivierter Zellen vermitteln kann.
Hier wird ein Protokoll zur Herstellung trockener makroporöser Alginatgerüste, bekannt als Drydux-Gerüste, beschrieben, die T-Zellen statisch durch viralen Gentransfer transduzieren17,18. Der Prozess zur Herstellung dieser Gerüste ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Gerüste machen die Spinokulation retronektinbeschichteter Platten überflüssig. Die makroporösen Alginatgerüste fördern die Interaktion von Viruspartikeln und T-Zellen, um einen effizienten Gentransfer in einem einzigen Schritt zu ermöglichen, ohne die Funktionalität und Lebensfähigkeit der technisch hergestellten T-Zellen zu beeinträchtigen17. Bei korrekter Befolgung haben diese makroporösen Alginatgerüste eine Transduktionseffizienz von mindestens 80%, was den viralen Transduktionsprozess vereinfacht und verkürzt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung und Zeitleiste des Protokolls . (A) Zeitplan für die Herstellung der trockenen makroporösen Alginatgerüste. Alginat wird mit Calcium-D-gluconat vernetzt und über Nacht eingefroren. Die gefrorenen Gerüste werden für 72 h lyophilisiert, um die Drydux-Gerüste herzustellen. (B) Zeitplan für die virale Transduktion aktivierter Zellen. Aktivierte Zellen und Viren (MOI 2) werden auf dem Gerüst ausgesät und in kompletten Medien inkubiert, ergänzt mit IL-7 und IL-15. Die Gerüste absorbieren die Mischung und fördern den viralen Gentransfer. EDTA wird verwendet, um die Gerüste aufzulösen und die transduzierten Zellen zu isolieren. Nach zweimaligem Waschen mit PBS kann das Zellpellet zur Analyse verwendet werden. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBMCs = periphere mononukleäre Blutzellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8,0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Kein Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>3% Essigsäure mit Methylenblau</td><td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Aktivierte periphreale Blutzellen Mononukleäre Zellen</td> <td>-</td><td></td> <td>Frisches oder gefrorenes</td></tr><tr><td>Calcium-D-Gluconat</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 Antikörper</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>CD3 Antikörper</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Click's Media</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Wasser</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Media</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut</td> <td>-</td><td></td> <td>Frisch oder gefroren</td></tr><tr><td>PRONOVA UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>Natriumalginat</td></tr><tr><td>Rekombinant human IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng/ml</td></tr><tr><td>rekombinant human IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Retrovirus</td> <td>-</td><td></td> <td>1 x 106 TU/ Ml</td></tr></tbody></table>

herstellung und verwendung von trockenen makroporösen alginatgerüsten für die virale transduktion von t-zellen

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Die Gentechnik von T-Zellen für die CAR-T-Zelltherapie ist in den letzten Jahren in den Vordergrund der Krebsbehandlung gerückt. CAR-T-Zellen werden durch viralen Gentransfer in T-Zellen hergestellt. Der derzeitige Goldstandard des viralen Gentransfers beinhaltet die Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten, was teuer und zeitaufwendig ist. Es besteht ein erheblicher Bedarf an effizienten und kostengünstigen Methoden zur Erzeugung von CAR-T-Zellen. Hier wird ein Verfahren zur Herstellung kostengünstiger, trockener makroporöser Alginatgerüste, bekannt als Drydux-Gerüste, beschrieben, die die virale Transduktion aktivierter T-Zellen effizient fördern. Die Gerüste sind so konzipiert, dass sie anstelle der Goldstandard-Spinokulation von retronektinbeschichteten Platten, die mit Viren besät sind, verwendet werden und den Prozess zur Übertragung von Zellen vereinfachen. Alginat wird mit Calcium-D-Gluconat vernetzt und über Nacht eingefroren, um die Gerüste zu bilden. Die gefrorenen Gerüste werden in einem Gefriertrockner für 72 h gefriergetrocknet, um die Bildung der trockenen makroporösen Gerüste zu vervollständigen. Die Gerüste vermitteln den viralen Gentransfer, wenn Virus- und aktivierte T-Zellen auf dem Gerüst zusammengesät werden, um genetisch veränderte Zellen zu produzieren. Die Gerüste erzeugen >85% primäre T-Zell-Transduktion, was mit der Transduktionseffizienz der Spinokulation auf retronektinbeschichteten Platten vergleichbar ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass trockene makroporöse Alginatgerüste eine kostengünstigere und bequemere Alternative zur herkömmlichen Transduktionsmethode darstellen.

Diese makroporösen Alginatgerüste sind einfach herzustellen und sollten als poröse, flauschige und weiße Scheiben aus dem Gefriertrockner kommen. Obwohl in diesem Experiment nicht untersucht, kann Calcium-Alginat-Lösung in verschiedene Formen gegossen werden, um Gerüste unterschiedlicher Form zu erzeugen, abhängig von den Bedürfnissen des Benutzers 9,10. Die Gerüste sind elektrostatisch und können am Deckel der Well-Platte oder an einem behandschuhten Finger haft...

Hierin ist ein Protokoll zur Herstellung trockener makroporöser Alginatgerüste, die einen effizienten viralen Gentransfer für den Einsatz in der Gentechnik von T-Zellen, einschließlich T-Zellen für die CAR-T-Zelltherapie, vermitteln. Es wurde gezeigt, dass die Gerüste aktivierte primäre T-Zellen mit >85% Transduktion transduzieren.

Herstellung und Verwendung von trockenen makroporösen Alginatgerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

In diesem Video wird ein Protokoll zur Erstellung und Verwendung trockener makroporöser Alginatgerüste beschrieben, die als Drydux bekannt sind und die Transduktion aktivierter T-Zellen effizient fördern. Drydux wurde entwickelt, um anstelle der Goldstandard-Spinokulation von mit Viren beimpften RetroNectin-beschichteten Platten verwendet zu werden und vereinfacht den Prozess der Zelltransducation. Drydux hat eine Transduktionseffizienz, die mit der Spinokulation auf RetroNectin-beschichteten Platten vergleichbar ist, und dient als kostengünstigere und bequemere Alternative zur herkömmlichen Transduktionsmethode.Bereiten Sie zunächst eine 0,4% ige Lösung von Calcium-D-gluconat vor. Fügen Sie steriles gefiltertes DI-Wasser zu Calcium-D-gluconat in einem Becherglas hinzu. Bei mittlerer Geschwindigkeit umrühren, bis sich das Calcium-D-gluconat aufgelöst hat, was ca. 1 1/2 Stunden dauert.Nach dem Auflösen steril filtrieren Sie die Calcium-D-gluconat-Lösung. Diese Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Als nächstes bereiten Sie eine 2% ige Alginatlösung vor.Dies kann mit einem Schraubverschlussfläschchen oder einem Becherglas erreicht werden. Beides wird hier gezeigt. Geben Sie das hochreine Alginat vorsichtig in das Gefäß.Fügen Sie dem Alginat die entsprechende Menge DI-Wasser hinzu. Wählen Sie den größtmöglichen Rührstab, der das Mischen nicht behindert, und fügen Sie ihn dem Gefäß hinzu. Rühren Sie die Lösung hoch, bis sich das Alginat auflöst, was ungefähr eine Stunde dauert.Wenn sich große Alginatklumpen an der Seite des Gefäßes befinden, neigen Sie das Gefäß zur Seite, um sie zu entfernen. Kleine Klumpen lösen sich im Laufe der Stunde auf und sind kein Grund zur Besorgnis. Sobald sich die 2%ige Alginatlösung aufgelöst hat, reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit.Geben Sie langsam ein gleiches Volumen der Calcium-D-gluconat-Lösung in die Alginatlösung. Wenn Sie es langsam hinzufügen, können Sie verhindern, dass sich vernetzende Klumpen bilden. Wenn die Calciumgluconatlösung hinzugefügt wurde, erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit und rühren Sie 15 Minuten lang kräftig um.Neigen Sie das Gefäß zur Seite, um eventuell gebildete Klumpen zu entfernen. Nach 15 Minuten kräftigem Rühren stellen Sie sicher, dass sich keine Klumpen in der Lösung befinden. Pipetten Sie die Lösung in eine 48- oder 24-Well-Platte.Für eine 48-Well-Platte pipetten Sie 300 Mikroliter in jede Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass Sie langsam werfen und die Spitzen häufig wechseln, da die Lösung viskos ist und an der Spitze haften bleiben kann. Für eine 24-Well-Platte pipetten Sie einen Milliliter in jede Vertiefung.Wieder langsam gießen und Pipettenspitzen oft wechseln. Die Brunnenplatten mit einem Deckel abdecken und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Bereiten Sie die Platten für den Gefriertrockner vor, indem Sie die Deckel entfernen und die Oberseite mit Tüchern und Gummibändern sichern.Legen Sie die Platten in das Gefriertrocknungsrohr und legen Sie den Gefriertrockner für 72 Stunden auf. Entfernen Sie nach 72 Stunden die Platte aus dem Gefriertrockner. Die Gerüste sind nun bereit für die Transduktion.Wenn Sie die Gerüste nicht sofort verwenden, verschließen Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Für die Langzeitlagerung empfiehlt es sich, die Platte zusätzlich zur Versiegelung mit Parafilm vakuumversiegeln. Viralüberstand konzentrieren, indem zwei Milliliter Viruslösung durch einen Zentrifugalfilter bei 1.500 g für 10 Minuten zentrifugiert werden.Pro Gerüst werden 100 bis 200 Mikroliter konzentriertes Virus benötigt. Für einige zusätzliche Minuten drehen, wenn das Volumen der konzentrierten Viruslösung mehr als 200 Mikroliter beträgt. Für jedes Gerüst wird ein Aliquot von 1 Million aktivierter T-Zellen in 50 Mikrolitern kompletter Zellkulturmedien suspendiert.Fügen Sie das konzentrierte Virus der Zellsuspension hinzu. Das Gesamtvolumen der Zellvirussuspension sollte 200 Mikroliter für ein 48-Well-Gerüst oder 350 Mikroliter für ein 24-Well-Gerüst nicht überschreiten. Fügen Sie die Zellvirusmischung tropfenweise auf die Oberseite des trockenen Gerüsts hinzu.Verwenden Sie für Negativkontrollexperimente vollständige Zellkulturmedien anstelle von konzentriertem Virus. Fügen Sie diese Zellsuspension oben auf das trockene Gerüst hinzu. Inkubieren Sie die Gerüste im Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten.Entfernen Sie die Gerüste aus dem Inkubator. Die Gerüste sollten die Lösung während dieser Zeit vollständig absorbieren. Um die Proliferation zu induzieren, fügen Sie jedem Well vollständige Zellkulturmedien hinzu, die mit IL-7 und IL-15 ergänzt wurden.IL-2 kann auch verwendet werden. Für ein 24-Well-Gerüst fügen Sie einen Milliliter hinzu. Für ein 48-Well-Gerüst fügen Sie 500 Mikroliter hinzu.72 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen vermehren sich über die 72 Stunden, was das Medium orange färben kann. Entfernen Sie überschüssige Medien aus jedem Bohrloch.Um Zellen aus dem Gerüst zu isolieren, fügen Sie 0,25 molare EDTA-Lösung zu jedem Gerüst hinzu. Fügen Sie einen Milliliter für 24-Well-Gerüste oder 300 Mikroliter für 48-Well-Gerüste hinzu. Lassen Sie den Teller sitzen oder rühren Sie ihn vorsichtig für drei bis vier Minuten.Nach dem größten Teil aufgelöst pipetten Sie vorsichtig in den Brunnen. Ein paar Ein- und Ausspeiseschritte können notwendig sein, um das Gerüst vollständig aufzulösen. Die Lösung wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie jedem Zentrifugenröhrchen 12 Milliliter PBS hinzu. Bei 400 g fünf Minuten zentrifugieren.Am Boden des Röhrchens bildet sich ein Zellpellet. Die überstehende Lösung absaugen und die Wäsche wiederholen. Achten Sie darauf, den Überstand bei jeder Wäsche vollständig zu entfernen, da es wichtig ist, alle EDTA loszuwerden.Nach einem zweiten Waschen mit PBS ist das Zellpellet bereit für die Analyse. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Transduktionseffizienz jeder Gruppe zu bestimmen. Nicht transduzierte Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet und zeigten keine Transduktion.Zellen, die auf Gerüsten ohne GFP-Retrovirus ausgesät wurden, zeigten ebenfalls keine Transduktion. Die Drydux-Gruppe, die Zellen aktiviert hatte, die auf die trockenen makroporösen Alginatgerüste ausgesät waren, zeigte eine 85%ige Transduktion, knapp niedriger als die RetroNektin-Gruppe. Diese Ergebnisse zeigen, dass Drydux-Gerüste Zellen effektiv durch retroviralen Gentransfer transduzieren, ohne dass eine Spinokulation von RetroNectin-beschichteten Platten erforderlich ist.Drydux-Gerüste weisen eine hohe Transduktionseffizienz auf, die mit RetroNectin vergleichbar ist und eine alternative Methode zur Transduktion von T-Zellen bietet. Aufgrund der niedrigen Herstellungskosten der Drydux-Gerüste hat dieses Verfahren das Potenzial, die Kosten für CAR-T-Zelltherapien deutlich zu senken.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert das Verfahren der Herstellung von Mikrocarriern aus extrazellulärer Matrix durch Elektrospraying. Diese Microcarrier simulieren die native gewebespezifische Mikroumgebung und sind in Langzeit-3D-In-vitro-Zellkulturmodellen stabil.

Herstellung von Biogerüsten durch Elektrospraying: Eine Technik zur Erzeugung von Microcarrier-Gerüsten, die aus der extrazellulären Matrix von dezellularisiertem Gewebe gewonnen werden

Das Ziel dieses Protokolls ist es, pathogenspezifische T-Zellen in klinischer Qualität herzustellen, indem ein automatisiertes Zellanreicherungsgerät der zweiten Generation verwendet wird, das ein geschlossenes Zytokin-Capture-System enthält und kein spezielles Personal oder die Verwendung einer GMP-Einrichtung erfordert. Die erzeugten pp65-spezifischen T-Zellen des Cytomegalievirus können direkt an Patienten verabreicht werden.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

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Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

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Lernen Sie die Herstellung von Drydux-Alginsäuregerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen. Diese Methode erreicht über 85% Effizienz und bietet eine kostengünstigere Alternative zu RetroNectin-beschichteten Platten für CAR-T-Zelltherapien.

Herstellung und Verwendung von trockenen makroporösen Alginatgerüsten für die virale Transduktion von T-Zellen

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