Name: Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Präparation von Nukleosomenkernpartikeln mit DNA-Reparaturfaktoren für Kryo-EM-Studien. Dieses Protokoll ermöglicht strukturelle Analysen chromatinassoziierter Prozesse.

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Wir danken Dr. Mario Borgnia vom Kryo-EM-Kern am National Institute of Environmental Health Sciences und Dr. Joshua Strauss von der University of North Carolina in Chapel Hill für ihr Mentoring und ihre Ausbildung in der Kryo-EM-Netzvorbereitung. Wir danken auch Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende für die technische Unterstützung in der Anfangsphase dieses Projekts. Wir schätzen den wichtigen Beitrag und die Unterstützung des verstorbenen Dr. Samuel H. Wilson und seiner Labormitglieder, insbesondere Dr. Rajendra Prasad und Dr. Joonas Jamsen, für die Reinigung des genetisch fusionierten APE1-Polβ-Komplexes. Die Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm der National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [Förderkennzeichen Z01ES050158, Z01ES050159 und K99ES031662-01] unterstützt.

1. Zusammenbau von Nukleosomenkernpartikeln mittels Salz-Garstoff-Dialyse
ANMERKUNG: Die Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln unter Verwendung rekombinanter Histonproteine für Strukturstudien wurde von anderen ausführlich beschrieben14,15,16. Befolgen Sie die Reinigung der rekombinanten X. laevis-Histone und der Histon-Oktamer-Assemblierung, die von anderen14,15 beschrieben wurden, und bauen Sie das nukleosomale Substrat wie unten beschrieben zusammen.
<ol><li>Kaufen Sie drei Oligonukleotide (aufgeführt in Tabelle 1) in der angegebenen Skala: UND-197mer, 161mer, 35mer.<ol><li>PAGE reinigt Ultramere (197mer und 161mer) wie beschrieben17.<ol><li>Anneale äquimolare Mengen an Oligonukleotiden in 1x Annealing-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Mischen Sie beispielsweise 40 μl 161-mer [166,7 μM]; 8 μl 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μl 197-merer Comp-Strang [408,2 μM]; 10 μl 10x Glühpuffer und 10,9 μldH2O. HINWEIS: Es ist wichtig, die Glühreaktion mit einem Temperaturgradienten zu steuern. In Tabelle 2 finden Sie Details zum Temperaturgradienten.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung von Rekonstitutionen im kleinen Maßstab (Skalierung um den Faktor 1/57 des unten gezeigten Beispiels für ein Endvolumen von 50 μl), um das Verhältnis von DNA zu Histon-Oktamer zu bestimmen (typische Ausgangsverhältnisse von DNA:Oktamer sind wie folgt: 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; dargestellt in Abbildung 2A); Es ist wichtig, dieses Verhältnis empirisch mit kleinräumigen Rekonstitutionen zu bestimmen.<ol><li>Nachdem dieses Verhältnis bestimmt wurde, bereiten Sie eine groß angelegte Rekonstitution vor. Mischen Sie beispielsweise 32,9 μl DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μl TE (1x); 1120 μl 5 M NaCl und 62,3 μl WT-Histon-Oktamer [2,56 μM].</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie Dialysepuffer her: RBniedrig und RBhoch , wie in Tabelle 3 bzw. Tabelle 4 beschrieben; Richten Sie die Rekonstitutionen wie zuvor beschrieben ein14.<ol><li>Das Dialyseröhrchen wird in das Becherglas mitRB high gegeben und die Dialyse unter leichtem Rühren 16 h lang fortgesetzt oder bis 2 L RBlow in das Becherglas überführt wurden.</li>
	</ol></li>
	<li>Das Dialyseröhrchen wird in ein 1-Liter-Becherglas mit RB50 mM Puffer (Tabelle 5) überführt und die Probe mindestens 3 h oder über Nacht dialysieren lassen.<ol><li>Bewerten Sie die Rekonstitutionseffizienz auf einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel, um sicherzustellen, dass weniger als 10% freie DNA und eine einzelne NCP-Bande vorhanden sind. NCPs bei 4 °C lagern. Siehe Abbildung 2A (Spur 5) und Abbildung 2B für repräsentative optimale Rekonstitutionsergebnisse.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bereiten Sie den NCP-DNA-Reparaturfaktor-Komplex (NCP-DRF) vor
<ol><li>Aufreinigung durch präparative Gelelektrophorese HINWEIS: Diese Methode ist die arbeitsintensivste (der beiden beschriebenen) und obwohl sie bei der Entfernung von Spezies mit hohem Molekulargewicht (HMW) (Abbildung 6A) aufgrund des hohen Verdünnungsfaktors kann es zu einer gewissen Demontage kommen, wie in Abbildung 7A (NCP-Vorbereitungszelle aus der Spur), Freisetzung von DNA. Bis zu 25% freie DNA ist jedoch immer noch mit Kryo-EM-Studien kompatibel. Verwenden Sie diese Methode aufgrund der hohen Verdünnung, um nur den NCP und nicht den gesamten Komplex zu reinigen.<ol><li>Bereiten Sie 70 ml 6%ige nicht denaturierende Polyacrylamid-Gellösung in 0,2x TBE unter Verwendung von Polyacrylamid-Gellösung 37,5:1, Acrylamid:Bisacrylamid vor. Gießen Sie ein zylindrisches Gel mit einem Außenradius von 28 mm und polymerisieren Sie über Nacht.</li>
		<li>Montieren Sie die präparative Gellaufvorrichtung unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Cutoff von 6-8 kDa MW. Verwenden Sie 0,25x TBE als Laufpuffer und 1x Elutionspuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Lassen Sie das zylindrische Gel 1 Stunde lang bei konstanten 12 W vorlaufen und sammeln Sie Fraktionen, die die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von ca. 1 ml/min betreiben. HINWEIS: Wenn kein UV-Detektor zur Identifizierung von DNA-haltigen Fraktionen zur Verfügung steht, kann ein Screening-Experiment mit 32P-NCP durchgeführt werden, um die interessierenden Fraktionen zu identifizieren. Unter Beibehaltung aller Bedingungen können unmarkierte NCPs dann ohne UV-Detektor gereinigt werden.</li>
		<li>Die 2,8 ml NCP werden mit einem Zentrifugalfilter (MW-Cutoff 30 kDa) auf 250 μl konzentriert und insgesamt 6 h lang auf das präparative Gel und die Elektrophorese geladen. Nach 2 Stunden, wenn das Xylolcyanol aus dem Gel ausgelaufen ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von 1,5-ml-Fraktionen. HINWEIS: Nach 2,5 h sind die Fraktionen frei von Xylolcyanol; Die DNA (197mer) eluiert nach etwa 3-3,5 h, und es wird erwartet, dass das NCP nach 4,5-5 h eluiert.</li>
		<li>Analysieren Sie die interessierenden Fraktionen auf einem 6% nicht denaturierenden Polyacrylamidgel. Pool-Fraktionen, die das NCP enthalten, und sofort mit einem Zentrifugalfilter (MW-Cutoff 30 kDa) auf 1 mg/ml konzentrieren. Bewerten Sie am nächsten Tag die Qualität des NCP auf einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel, bevor Sie mit dem gewünschten DNA-Reparaturfaktor (DRF) komplexieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie den NCP und den DRF von Interesse 15 Minuten lang auf Eis mit einem optimalen Puffer für den spezifischen Komplex. Mischen Sie beispielsweise 1.000 μl NCP [1,2 μM]; 260 μl 5x Bindungspuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μl 3 M KCl und 18 μl MBP-Pol β-APE1 [338 μM]. HINWEIS: Die Temperatur und die Ionenstärke, bei der der Komplex hergestellt wird, müssen möglicherweise für verschiedene Komplexe optimiert werden.</li>
		<li>Fügen Sie Glutaraldehyd hinzu (frisch geöffnet; EM-Gehalt) bis zu einer Endkonzentration von 0,005 %. Fügen Sie daher zu dieser Reaktion 26,8 μl 0,25% Glutaraldehyd mit 13,2 μl dH2O hinzu. Gut mischen und 13 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Abschrecken mit 1 M Tris-Cl, pH 7,5, bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Konzentrat auf ~50 μL und Austausch des Puffers mit 1x Gefrierpuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 unter Verwendung einer Entsalzungssäule. ACHTUNG: Glutaraldehyd kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen; Es ist schädlich, wenn es verschluckt wird, und es ist giftig, wenn es eingeatmet wird. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille, Handschuhe und behandeln Sie Glutaraldehyd in einem Abzug und tragen Sie eine Maske. HINWEIS: Es ist wichtig, die Vernetzungsreaktion in einem großen Volumen mit dem NCP in dieser niedrigeren Konzentration durchzuführen. Frühere Versuche der Vernetzung, selbst bei dieser Konzentration von Glutaraldehyd, aber bei einem 10-fach höher konzentrierten NCP, führten zu einer Aggregation der Probe und einer Übervernetzung, wie durch SDS PAGE und Größenausschlusschromatographie angezeigt. Diese Gitter hatten keine erkennbaren Partikel mit nur Klumpen (Abbildung 5D, E).</li>
		<li>Bestimmen Sie die Absorptionen bei OD 280 und OD 260 und konzentrieren Sie sich bei Bedarf weiter, um 1,3-3 mg/ml zu erreichen, basierend auf OD 280 (typisches Verhältnis von OD260 / OD 280 = 1,7-2 ergibt gute Partikel). Für dieses kleine Volumen von 50 μl besteht die beste Methode zur Reduzierung des Probenverlusts darin, einen Dialyseknopf mit einem Deckel aus einem 1,7-ml-Röhrchen herzustellen, das von einer Dialysemembran bedeckt ist (6-8 kDa MW Cutoff), den Boden des Röhrchens zu schneiden und den Rand des Röhrchens zu verwenden, um die Membran oben auf dem Deckel abzudichten.</li>
		<li>Legen Sie den Dialyseknopf mit der Probe mit der Membran nach unten auf ein Polyethylenglykolbett (überprüfen Sie den Fortschritt alle 2 Minuten). Diese Methode wird bevorzugt, wenn die erforderliche Konzentration kleiner oder gleich dem 2,5-fachen ist, um eine Verdünnung oder einen Verlust der Probe im Konzentrator zu vermeiden. Es ist wichtig, sofort nach diesem Schritt Kryo-EM-Gitter des Komplexes vorzubereiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufreinigung durch Größenausschlusschromatographie<ol><li>Am Tag vor dem Einfrieren eine Größenausschlusssäule mit 60 ml dH2O, gefolgt von 80 ml Gefrierpuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) über Nacht mit einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/min waschen und äquilibrieren. Bereiten Sie den gleichen Komplex mit NCPs direkt nach der Rekonstitution mit 2,5-mal größeren Mengen wie folgt vor: Mischen Sie 2.500 μl NCP [1,2 μM]; 650 μl 5-facher Bindungspuffer; 45 μl MBP-Pol β-APE1 [338 μM] und 55 μl 3M KCl.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang auf Eis ohne Vernetzer. Fügen Sie dann Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,005% hinzu, wie in der präparativen Gelmethode beschrieben. In diesem Fall wird der Komplex jedoch in einem voräquilibrierten (mit Gefrierpuffer) Zentrifugalfilter auf ca. 120 μL eingeengt.</li>
		<li>Analysieren Sie sofort die Peakfraktionen und konzentrieren Sie die Fraktionen, die die Histone und MBP-Pol β-APE1 enthalten, wie zuvor angegeben. Siehe Abbildung 5A, B, C für erfolgreiche Ergebnisse mit der Größenausschlussmethode und Abbildung 7 mit beiden Methoden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Nukleosomalkomplex einfrieren
<ol><li>Nach dem Einschalten des Gefrierschranks und dem Befüllen des Luftbefeuchters mit 50 ml dH2O stellen Sie die Kammertemperatur auf 22 °C und HR (Luftfeuchtigkeit) auf 98% ein. Stellen Sie den Ethanbecher und den Flüssigstickstoffbecher (mit einer beschrifteten Gitterbox) in die entsprechenden Platzhalter.</li>
	<li>Decken Sie den Ethanbecher mit dem Ethandeckelspender ab und gießen Sie vorsichtig flüssigen Stickstoff (LN2) darüber, während Sie den LN 2-Becher gleichzeitig mit LN2 füllen. Wenn sich der LN2-Füllstand stabilisiert hat und 100 % und eine Temperatur von -180 °C erreicht hat, öffnen Sie vorsichtig das Ethanventil und füllen Sie den Ethanbecher, bis er eine Blase auf dem durchsichtigen Deckel bildet. Entfernen Sie den Ethanspender.</li>
	<li>Legen Sie zwei Filterpapiere auf das Löschgerät und sichern Sie sie mit einem Metallring. Gehen Sie zum Setup und verwenden Sie die folgenden Parameter für das Blotting: 0 Pre-Blot, 3 s Blot, 0 Post-Blot; Wählen Sie A-Plunge und klicken Sie auf OK.</li>
	<li>Klicken Sie auf dem Hauptbildschirm auf Pinzette laden und laden Sie sie mit einem Gitter mit der Carbon-/Anwendungsseite nach links (wie zuvor vorbereitet). Kalibrieren Sie die Pinzette und stellen Sie die Z-Achse ein, um einen festen Fleck zu gewährleisten. Klicken Sie auf Untere Kammer und tragen Sie 3 μl des Komplexes (1,3-3 mg/ml; OD280). Klicken Sie auf Blot/A-plunge. Dadurch wird das Gitter so gedreht, dass es von vorne abdeckt, und es wird eingefroren.</li>
	<li>Übertragen und lagern Sie das Gitter in der Gitterbox in der LN2-Kammer . Wenn alle vier Gitter eingefroren und in die Gitterbox gelegt wurden, drehen Sie den Deckel in die neutrale Position, in der alle Gitter vom Deckel bedeckt sind, und ziehen Sie die Schraube fest. Gitter können in LN2 gespeichert werden, bis die Siebung eingeleitet wird.</li>
</ol>4. Bildschirmraster
<ol><li>Bevor Sie die Proben in das Mikroskop einlegen, legen Sie die verglasten Gitter auf einen Ring und befestigen Sie sie mit einem C-Clip. Führen Sie diesen Clipping-Vorgang unter LN2 in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum durch, um eine Eiskontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie beim Einlegen des Mikroskops die Gitter in eine Kassette mit 12 Steckplätzen ein. Legen Sie die Kassette in eine Nanocab-Kapsel und laden Sie sie in den Autoloader. Der Autoloader-Robotermechanismus leitet den Prozess ein.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gitter von der Kassette auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Tisch auf euzentrische Höhe ein, indem Sie den Tisch um 10° wackeln und gleichzeitig die Z-Höhe verschieben, bis eine minimale planare Verschiebung in den Bildern beobachtet wird.</li>
	<li>Sobald die euzentrische Höhe erreicht ist, beginnen Sie mit der Bildgebung. Erhalten Sie zunächst den Atlas, indem Sie ein 3 x 3-Montagebild des Rasters aufnehmen, in dem jede Montage mit 62-facher Vergrößerung aufgenommen wird. Wählen Sie drei Quadrate unterschiedlicher Größe; Nehmen Sie die euzentrische Höhe und nehmen Sie dann das Bild mit 210-facher Vergrößerung auf.</li>
	<li>Sobald ein Quadrat abgebildet ist, wählen Sie jeweils ein Loch von der Kante, in der Mitte und dazwischen innerhalb der Quadrate. Stellen Sie jedes Loch mit 2600-facher Vergrößerung dar.</li>
	<li>Vor der Aufnahme dieses Bildes mit hoher Vergrößerung erfolgt der Autofokus in einem Versatz des Abbildungsbereichs. Nehmen Sie das Bild mit hoher Vergrößerung aus der Mitte des Lochs mit 36.000-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 7,1 s, 60 Bildern, einer Größe von 1,18 Pixel und einer Unschärfe von 3 μm auf. Repräsentative Bilder des Screenings finden Sie in Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Ein spezifisches Protokoll zur Reinigung des DNA-Reparaturfaktors hängt von dem interessierenden Enzym ab. Es gibt jedoch einige allgemeine Empfehlungen, einschließlich der Verwendung rekombinanter Methoden zur Proteinexpression und -reinigung18; Wenn das interessierende Protein zu klein ist (<50 kDa), war die Strukturbestimmung durch Kryo-EM bis vor kurzem durch den Einsatz von Fusionssystemen19, Nanokörper-bindenden Gerüsten20 und der Optimierung v...

Eukaryotische DNA wird durch Histonproteine organisiert und verdichtet, wobei Chromatin gebildet wird. Das Nukleosomenkernpartikel (NCP) stellt die grundlegende Wiederholungseinheit des Chromatins dar, die den Zugang zu DNA-bindenden Proteinen für die DNA-Reparatur, -Transkription und -Replikation reguliert1. Obwohl die erste Röntgenkristallstruktur des NCP erstmals vor mehr als zwei Jahrzehnten aufgeklärt wurde2 und viele weitere Strukturen des NCP seit 3,4,5,6 veröffentlicht wurden, sind DNA-Reparaturmechanismen in nukleosomalen Substraten noch nicht beschrieben. Die Aufdeckung der molekularen Details, die der DNA-Reparatur im Chromatin zugrunde liegen, erfordert eine strukturelle Charakterisierung der beteiligten Komponenten, um zu verstehen, wie lokale strukturelle Merkmale des NCP die DNA-Reparaturaktivitäten regulieren. Dies ist besonders wichtig im Zusammenhang mit der Basenexzisionsreparatur (BER), da biochemische Studien mit BER-Enzymen auf einzigartige DNA-Reparaturmechanismen in Nukleosomen hindeuten, die von enzymspezifischen strukturellen Anforderungen für die Katalyse und der strukturellen Position der DNA-Läsion innerhalb des Nukleosomsabhängen 7,8,9,10,11,12,13 . Da es sich bei der BER um einen lebenswichtigen DNA-Reparaturprozess handelt, besteht ein erhebliches Interesse, diese Lücken zu schließen und gleichzeitig einen Ausgangspunkt zu schaffen, von dem aus andere technisch realisierbare Strukturstudien mit relevanten nukleosomalen Komplexen durchgeführt werden können.
Die Kryo-EM entwickelt sich schnell zur Methode der Wahl, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Komplexen zu lösen, deren großflächige Vorbereitung einer homogenen Probe eine Herausforderung darstellt. Obwohl das Design und die Aufreinigung von NCPs, die mit einem DNA-Reparaturfaktor (NCP-DRF) komplexiert sind, wahrscheinlich eine maßgeschneiderte Optimierung erfordern wird, liefert das hier vorgestellte Verfahren zur Erzeugung und zum Einfrieren eines stabilen NCP-DRF-Komplexes Details zur Optimierung der Proben- und Kryo-EM-Gittervorbereitung. Zwei (sich nicht gegenseitig ausschließende) Workflows, die in Abbildung 1 dargestellt sind, und die spezifischen Details im Protokoll identifizieren kritische Schritte und bieten Strategien zur Optimierung dieser Schritte. Diese Arbeit wird das Chromatin- und DNA-Reparaturfeld in eine Richtung treiben, in der die Ergänzung biochemischer mit strukturellen Studien technisch möglich wird, um die molekularen Mechanismen der nukleosomalen DNA-Reparatur besser zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES; pH 7,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x FSME</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 </td><td>Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 Zentrifugalfilter (MW Cutoff 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z717185</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 Zentrifugalfilter (MW Cutoff 30 kDa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr><tr><td>AutoGrid Pinzette</td><td>Ted Pella</td><td>47000-600</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Tauchfroster</td><td>Leica</td><td>Leica EM GP</td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Touch-Thermocycler</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>C-Clips und Ringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>Clipstation</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>Dialysemembran (MW cufoff 6-8 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15370752</td><td></td></tr><tr><td>Diamantpinzette</td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>Integrierte DNA Technologien</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI Titan Krios</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>FPLC-Reinigungssystem</td><td>AKTA Pure</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Fraktionssammler Modell 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Glimmentladungsreinigungssystem</td><td>Ted Pella</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>Gitterboxen</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>Grid Storage Accessory Pack</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>Flüssiges Ethan</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 peristaltische Zweikopfpumpe</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16%, Tricin, 1,0 mm, Mini Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (VWR) Low Retention</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamid Gellösung (37,5:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>PURX35050</tr><tr><td>Aufgereinigter rekombinanter DNA-Reparaturfaktor</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1,2/1,3 Cu 300 mesh Gitter</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Histon-Oktamer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Feder-Clipping-Werkzeuge</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Säule 10/300</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Thermo Fisher</td><td>Talos Arctica 200 kV</td><td></td></tr><tr><td>Pinzettenbaugruppe für FEI Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mark IV System</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier (55 mM)</td><td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Cyanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Mikro-Spin-Entsalzungssäulen, 7K MWCO, 75 & Mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von nukleosomenkernpartikeln, die mit dna-reparaturfaktoren für die strukturbestimmung der kryo-elektronenmikroskopie komplexiert sind

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Die DNA-Reparatur im Zusammenhang mit Chromatin ist kaum verstanden. Biochemische Studien mit Nukleosomenkernpartikeln, der grundlegenden Wiederholungseinheit des Chromatins, zeigen, dass die meisten DNA-Reparaturenzyme DNA-Schäden im Vergleich zu freier DNA mit reduzierten Raten entfernen. Die molekularen Details darüber, wie Basen-Exzisionsreparatur-Enzyme (BER) DNA-Schäden in Nukleosomen erkennen und entfernen, wurden nicht aufgeklärt. Biochemische BER-Daten von nukleosomalen Substraten deuten jedoch darauf hin, dass das Nukleosom je nach Ort der DNA-Läsion und des Enzyms unterschiedliche strukturelle Barrieren aufweist. Dies deutet darauf hin, dass die Mechanismen, die von diesen Enzymen verwendet werden, um DNA-Schäden in freier DNA zu entfernen, sich von denen unterscheiden können, die in Nukleosomen verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass der Großteil der genomischen DNA zu Nukleosomen zusammengesetzt ist, werden strukturelle Informationen dieser Komplexe benötigt. Bis heute fehlen der wissenschaftlichen Gemeinschaft detaillierte Protokolle, um technisch machbare Strukturstudien dieser Komplexe durchzuführen. Hier stellen wir zwei Methoden zur Verfügung, um einen Komplex aus zwei genetisch fusionierten BER-Enzymen (Polymerase β und AP Endonuclease1) herzustellen, die an eine Einzelnukleotidlücke in der Nähe des Eintritts-Austritts des Nukleosoms gebunden sind, um die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu ermöglichen. Beide Methoden der Probenvorbereitung sind für die Verglasung von Qualitätsgittern durch Tauchgefrieren geeignet. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt für die Herstellung anderer nukleosomaler Komplexe mit verschiedenen BER-Faktoren, Pionier-Transkriptionsfaktoren und Chromatin-modifizierenden Enzymen verwendet werden.

Richtig zusammengesetzte NCPs (Abbildung 2) wurden verwendet, um einen Komplex mit einem rekombinanten Fusionsprotein aus MBP-Polβ-APE1 herzustellen (Abbildung 3). Um das Verhältnis von NCP zu MBP-Polβ-APE1 zur Bildung eines stabilen Komplexes zu bestimmen, führten wir elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) durch (Abbildung 4), die eine einfach verschobene Bande des NCP mit einem 5-fachen molaren Überschuss an MBP-P...

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Herstellung von Nukleosomalkomplexen unter Verwendung von zwei Methoden der Probenvorbereitung zum Einfrieren von TEM-Gittern.

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Strukturelle Informationen darüber, wie Basen-Exzisions-Reparaturenzyme DNA-Läsionen im Zusammenhang mit Chromatin entfernen, waren rar. Dies stellt eine erhebliche Lücke in unserem Verständnis der Mechanismen dar, die an der Ätiologie menschlicher Krankheiten beteiligt sind. Der Hauptvorteil unseres Protokolls besteht darin, dass wir die Probenvorbereitung mit Standard-Laborgeräten optimiert haben.Dies wird es anderen Biochemikern auf diesem Gebiet ermöglichen, ihre biochemische Arbeit durch technisch machbare Kryo-EM-Studien zu ergänzen. Unser Protokoll kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie andere Faktoren, einschließlich Pionier-Transkriptionsfaktoren, das Nukleosom beeinflussen. Dies ist ein Bereich, in dem auch die strukturellen Informationen begrenzt sind.Die Optimierung der Probenvorbereitung vor dem Übergang zu den Gefrierbedingungen war der Schlüssel, um unser Projekt voranzubringen, und dies geschieht am besten mit biochemischen Standardassays unter Substratdesign-, Bindungs- und Vernetzungsbedingungen. Inkubieren Sie zunächst das NCP und den interessierenden DNA-Reparaturfaktor 15 Minuten lang auf Eis mit einem optimalen Puffer für den spezifischen Komplex. Fügen Sie dann Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,005% hinzuNachdem es gut gemischt wurde, inkubieren Sie es 13 Minuten lang bei Raumtemperatur.Abschrecken mit einem molaren Tris-CL bis zu einer Endkonzentration von 20 millimolar Tris-CL mit pH 7,5. Konzentrieren Sie sich dann auf etwa 50 Mikroliter und tauschen Sie den Puffer mit einer Entsalzungskolonne gegen Gefrierpuffer aus. Als nächstes bestimmen Sie die Absorptionen bei einer optischen Dichte von 280 und 260 Nanometern und konzentrieren Sie sich bei Bedarf weiter, um 1,3 bis 3 Milligramm pro Milliliter basierend auf einer optischen Dichte von 280 Nanometern zu erreichen.Nachdem Sie den Dialyseknopf vorbereitet haben, legen Sie den Knopf mit der Probe mit der Membran nach unten auf ein Polyethylenglykolbett. Um die Reinigung durch Größenausschlusschromatographie durchzuführen, waschen und äquilibrieren Sie eine Größenausschlusssäule mit 60 Millilitern destilliertem Wasser, gefolgt von 80 Millilitern Gefrierpuffer über Nacht mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Millilitern pro Minute. Analysieren Sie dann sofort die Peakfraktionen und konzentrieren Sie die Fraktionen, die das Infusionsprotein MBP-PolBeta-APE1 des Histons enthalten.Elizabeth Viverette, eine Post-Baccalaureate-Auszubildende aus dem Kryo-EM-Kern hier in NIH, demonstriert die folgenden Verfahren. Nachdem Sie den Gefrierschrank eingeschaltet und den Luftbefeuchter mit 50 Millilitern destilliertem Wasser gefüllt haben, stellen Sie die Kammertemperatur auf 22 Grad Celsius und die Luftfeuchtigkeit auf 98% einDann stellen Sie den Ethanbecher und den Flüssigstickstoffbecher in die entsprechenden Raumhalter. Decken Sie anschließend den Ethanbecher mit dem Ethandeckelspender ab und gießen Sie vorsichtig flüssigen Stickstoff darüber, während Sie den Stickstoffbecher gleichzeitig mit flüssigem Stickstoff füllen.Wenn sich der Flüssigstickstoffgehalt stabilisiert hat und 100% erreicht und die Temperatur minus 180 Grad Celsius erreicht, öffnen Sie vorsichtig das Ethanventil und füllen Sie den Ethanbecher, bis er eine Blase auf dem durchsichtigen Deckel bildet. Entfernen Sie dann den Ethanspender. Legen Sie zwei Filterpapiere auf das Löschgerät und sichern Sie sie mit einem Metallring.Gehen Sie zum Setup und stellen Sie die Blotting-Parameter wie im Manuskript beschrieben ein, wählen Sie dann A-Plunge und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf dem Hauptbildschirm auf Pinzette laden und laden Sie sie mit einem Gitter mit der Carbon-Applikationsseite nach links. Kalibrieren Sie die Pinzette und stellen Sie die Z-Achse ein, um einen festen Fleck zu gewährleisten. Klicken Sie auf Untere Kammer und tragen Sie drei Mikroliter des Komplexes auf.Klicken Sie dann auf Blot A-Plunge, wodurch das Gitter von vorne gedreht und eingefroren wird. Lagern Sie das Gitter nach dem Umfüllen in der Gitterbox in der Flüssigstickstoffkammer. Wenn alle vier Gitter eingefroren und in die Gitterbox gelegt wurden, drehen Sie den Deckel in die neutrale Position, in der alle Gitter vom Deckel bedeckt sind, und ziehen Sie die Schraube fest.Bevor Sie die Proben in das Mikroskop laden, legen Sie die verglasten Gitter auf einen Ring und befestigen Sie ihn mit einem C-Clip unter flüssigem Stickstoff in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum, um eine Eiskontamination zu vermeiden. Legen Sie beim Einlegen des Mikroskops die Gitter in eine Kassette mit 12 Steckplätzen ein. Mischen Sie die Kassette in eine Nanocab-Kapsel und laden Sie sie in den Autoloader.Übertragen Sie dann das Gitter von der Kassette auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Tisch auf euzentrische Höhe ein, indem Sie den Tisch um 10 Grad wackeln und gleichzeitig die Z-Höhe verschieben, bis eine minimale planare Verschiebung in den Bildern beobachtet wird. Sobald die euzentrische Höhe erreicht ist, beginnen Sie mit der Bildgebung, indem Sie ein 3-mal-3-Montagebild des Gitters aufnehmen, in dem jede Montage mit 62-facher Vergrößerung aufgenommen wird, um den Atlas zu erhalten.Nachdem Sie drei Quadrate unterschiedlicher Größe ausgewählt und die euzentrische Höhe genommen haben, können Sie das Bild mit 210-facher Vergrößerung aufnehmen. Sobald ein Quadrat abgebildet ist, wählen Sie jeweils ein Loch von der Kante, in der Mitte und dazwischen innerhalb der Quadrate. Stellen Sie dann jedes Loch mit 2.600-facher Vergrößerung dar.Nehmen Sie das Bild mit hoher Vergrößerung aus der Mitte des Lochs mit 36.000-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 7,1 Sekunden, 60 Bildern, einer Größe von 1,18 Pixel und einer Defokussierung von drei Mikrometern auf. Sehen Sie sich repräsentative Bilder des Screenings an. Um das Verhältnis von NCP zu MBP-PolBeta-APE1 zur Bildung eines stabilen Komplexes zu bestimmen, wurden elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays durchgeführt, die eine einfach verschobene Bande des NCP mit einem fünffachen molaren Überschuss von MBP-PolBeta-APE1 zeigten.In kleineren Volumina zeigte die Assemblierung des Komplexes von NCP-PolBeta-APE1, dass die Probe übermäßig vernetzt war und zu Aggregaten ohne erkennbare Einzelkomplexe führte. Die zehnfache Verdünnung der NCPs führte jedoch zu einer signifikant reduzierten Aggregation und einer verbesserten Partikelstabilität. Die präparativen Gel- und Größenausschlussmethoden können kombiniert werden, wenn das präparative Gel die Qualität der NCPs verbessert, wenn sie eine signifikante Menge an hochmolekularen Aggregaten enthalten, gefolgt von der Reinigung des Komplexes durch Größenausschluss.Die Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden unabhängig voneinander zur Erzeugung stabiler Komplexe eingesetzt werden können. Darüber hinaus zeigen die von beiden Gittern gesammelten Daten nahezu identische zweidimensionale Klassen und dreidimensionale Karten mit einer Auflösung von etwa 3,2 Angström. Zuerst sollte ein optimales Verhältnis von NCP zu DNA-Reparaturfaktor bestimmt werden, dann sollte die Vernetzung des Komplexes mit Glutaraldehyd mindestens 10-mal verdünnter durchgeführt werden als die zum Einfrieren erforderliche Konzentration.Nach Erhalt einer Kryo-EM-3D-Karte des Komplexes ist eine weitere strukturelle Verfeinerung erforderlich, um zu bestimmen, wie der DNA-Reparaturfaktor gefunden wird, und um zu identifizieren, welche Regionen für diese Wechselwirkungen wichtig sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen.

Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

Dieser Artikel beschreibt die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode, die verwendet wird, um qualitativ hochwertige mikroskopische Bilder von Makromolekülen in ihrem nahezu nativen Zustand zu erhalten. Die Methode liefert Bilder, die sich für die weitere computergestützte Verarbeitung mit dem Einzelpartikelansatz eignen, der entwickelt wurde, um die 3D-Rekonstruktion eines Makromoleküls zu erzeugen.

Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. Synchrone Anbau, Überwachung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Cryo-Elektron Tomographie verwendet. Ein Protokoll für diese Methoden vorgestellt, und zukünftige Anwendungen und Entwicklungen diskutiert.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll stellt eine praktische Methode am Beispiel von Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) vor, um eine ungleichmäßige Partikelverteilung durch Optimierung der Probenvorbereitung zu beheben, und bietet Forschern eine Referenz zur effizienten Aufklärung makromolekularer Strukturen mittels kryogener Elektronenmikroskopie (Kryo-EM).

Optimierung der Probenvorbereitung für die kryogene Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Erfahren Sie die optimierte Präparation von Nukleosomenkernpartikeln mit DNA-Reparaturfaktoren für Kryo-EM-Studien. Dieses Protokoll ermöglicht strukturelle Analysen chromatinassoziierter Prozesse.

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind (Video) | JoVE Journal

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

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