Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Diese Methode beschreibt die chirurgische Beschaffung von drei vaskularisierten Schweinelappen und deren anschließende Perfusionsdezellularisierung. Diese Methode kann die Bemühungen zur Regeneration von Schweinelappen mithilfe eines Gewebedezellularisierungs- und Rezellularisierungsansatzes unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, um eine Profusionsdezellularisierung über eine Vielzahl von vaskularisierten Schweineklappen in einem einfach zu montierenden Bioreaktoraufbau zu erreichen.

Die hier beschriebene Technik kann breit auf andere vaskularisierte Lappen als mögliche Tissue-Engineering-Lösung unter Verwendung von Schweinelappen in der rekonstruktiven Chirurgie angewendet werden. Um zu beginnen, machen Sie einen Zu- und Abflussschlauch, indem Sie etwa 50 Zentimeter LS16 platinbeschichtete Silikonschläuche messen. Verbinden Sie ein Ende mit einem gelben 3-Stopp-Pumpenschlauch und das andere mit einer sterilen 2-Milliliter-serologischen Pipette, um Perfusat aus den Waschmittelreservoirs in die Bioreaktorkammer zu transportieren.

Autoklavieren Sie die Kammer und die Schläuche in einzeln verpackten sterilen Verpackungen. Für die omentale Lappenbeschaffung legen Sie ein 12 Wochen altes, betäubtes Yorkshire-Schwein in Rückenlage und bereiten dann den Bauch in der üblichen sterilen Weise vor. Führen Sie eine Xipho-Nabel-Laparotomie durch, um in den Bauch einzudringen und den Magenkopfschmerz zu mobilisieren, und legen Sie das Omentum in das Operationsfeld.

Beginnend am linken Aspekt der größeren Krümmung, wo die linke gastroepiploische Arterie mit der Milzarterie verbunden ist, skelettieren Sie die linke gastroepiploische Arterie und Vene mit einer geraden Stevens-Tenotomieschere. Dann ligieren und teilen Sie beide separat mit chirurgischen Bindungen oder Clips. Gehen Sie entlang der größeren Krümmung des Magens von links nach rechts, um die kurzen Gefäßäste, die aus dem Omentum hervorgehen, zu ligieren und zu teilen und die größere Krümmung des Magens zu versorgen.

Setzen Sie die Mobilisierung des größeren Omentums fort, bis die Verbindung der rechten gastroepiploischen Gefäße und der Arteria gastroduodenal angetroffen wird. Dann ligieren und teilen Sie die rechte gastroepiploische Arterie und Vene, um den omentalen Lappen zu befreien und später eine Lappenkanülierung zu ermöglichen. Für die Beschaffung von Tensorfaszien lata Klappen das Schwein in die seitliche Dekubitusposition bringen.

Markieren Sie die innere Lappengrenze von der vorderen oberen Beckenwirbelsäule oder ASIS in Richtung der lateralen Patella und eine hintere Grenze etwa 8 bis 10 Zentimeter kaudal. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen scharfen Schnitt am distalen Rand an der Patella zu machen. Vertiefen Sie den Schnitt durch das Unterhautgewebe, um die Faszie über dem Rectus femoris zu erreichen, und setzen Sie die Einschnitte in Richtung ASIS entlang der markierten Grenzen fort.

Um den Fasziallappen allein zu isolieren, entfernen Sie die darüber liegende Hautkomponente aus der darunter liegenden Faszienschicht. Dann ligieren oder kauterisieren Sie kleine Perforatorgefäße an die Haut. Kehren Sie zum distalen Rand der Klappe zurück und schneiden Sie die tiefe Faszie ein.

Mobilisieren Sie die Faszie vom darunter liegenden Musculus vastus lateralis in Richtung ASIS. Nachdem Sie den Stiel in Richtung der tiefen Femurgefäße verfolgt haben, skelettieren Sie die Arteria circumflexa circumflexa lateralis und die Vene, die den Fasziallappen versorgen. Dann ligieren und teilen Sie die Lappengefäße in der Nähe, wo sie sich mit den tiefen Femurgefäßen verbinden und eine spätere Kanülierung ermöglichen.

Für die Beschaffung von radialen Unterarmklappen markieren Sie ein Quadrat von 3 x 3 Zentimetern auf dem radialen Aspekt eines verlängerten Schweineunterarms. Zeichne eine Linie zwischen dem Mittelpunkt des proximalen Lappenrandes und der Fossa antecubitalis, um den ungefähren Verlauf des radialen Arterienstiels zu bezeichnen. Bestätigen Sie den arteriellen Verlauf mit Palpation.

Als nächstes schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell am distalen Aspekt mit einer Tiefe bis zur vorbrachialen Faszie. Stumpf mit einer Tenotomieschere sezieren, bis man auf die Arteria radialis distal und ihre Vena comitantes trifft. Dann ligieren und teilen Sie die Arterie und Venen mit chirurgischen Verbindungen oder Clips.

Setzen Sie die Hautschnitte am radialen und ulnaren Rand des markierten Hautquadrats fort. Mobilisieren Sie dann den Lappen vom darunter liegenden radialen Knochen mit einer chirurgischen Klinge oder Kauterisation, wobei Sie von einer ulnaren in radiale Richtung fortfahren, während Sie den Hautlappen proximal in Richtung der antekubitalen Fossa anheben. Mit einer Tenotomieschere skelettieren Sie die Arteria radialis und die Vena comitantes proximal an der Fossa antecubitalis, wo sie mit der Arteria brachialis bzw. den Venen verbunden sind.

Sezieren Sie die Gefäße aus dem umgebenden Fibrofettgewebe, um den Gefäßstiel zu isolieren. Dann ligieren und teilen Sie die Arterie und Vene separat, um den radialen Unterarmlappen freizugeben. Als nächstes kanülieren Sie die Pedikelgefäße mit 20 bis 24 Gauge Angiokatheter, die mit 3-0 Seidenbinden gesichert sind.

Spülen Sie die heparinisierte Kochsalzlösung in die arterielle Kanüle des Lappens, bis ein deutlicher venöser Abfluss beobachtet wird. Während Sie in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank arbeiten, legen Sie Klappen in die Bioreaktor-Gewebekammer. Prime Inflow Schlauch mit steriler heparinisierter Kochsalzlösung, um Restluft zu entfernen und Klappen anzuordnen, um eine Verbindung zwischen der Klappenarterienkanüle und dem männlichen Luer-Anschluss zu ermöglichen.

Verwenden Sie dann sterile Hämostaten, um die arterielle Kanüle auf den Konnektor zu schrauben. Spülen Sie dann die heparinisierte Kochsalzlösung durch den Absperrhahn, um zu überprüfen, ob die Luer-Verbindung keine Lecks aufweist und ob die Flops mit Anzeichen eines venösen Abflusses durchblutet werden können. Nach dem Schließen des Deckels der Gewebekammer verbinden Sie den Zulaufschlauch mit einem gelben 3-Stufen-Pumpenschlauch mit dem Zulaufhahn der Gewebekammer.

Befestigen Sie außerdem einen Inline-Drucksensoraufnehmer am 3-Wege-Absperrhahn für den Zufluss, um den Perfusionsdruck zu überwachen. Schalten Sie anschließend die Zulauf-Schlauchpumpe ein und wechseln Sie auf dem Startbildschirm mit dem Pfeil zur dritten Registerkarte, um die Schlauch-ID auf 1,85 Millimeter einzustellen. Stellen Sie dann die Perfusionsrate über die zweite Registerkarte ein.

Die Eingangsrate als Lieferart ist auf 2 Milliliter pro Minute eingestellt. Stellen Sie sicher, dass die Fließrichtung korrekt ist, wie auf dem Bildschirm angezeigt. Laden Sie den 3-Stufen-Pumpenschlauch mit einer kompatiblen Kassette in die Schlauchpumpe.

Stellen Sie die Einstellung der Ausströmpumpe auf eine Rate von 4 Milliliter pro Minute ein. Verbinden Sie den Auslaufschlauch mit einem gelben 3-Stufen-Pumpenschlauch mit dem Abflusshahn der Gewebekammer. Laden Sie dann den 3-Stufen-Pumpenschlauch in die Schlauchpumpe und starten Sie den Durchfluss für beide Pumpen, indem Sie den Netzschalter an jeder Pumpe drücken.

Beginnen Sie die Perfusionsdezellularisierung von Lappen mit heparinisierter Kochsalzlösung in der Gewebekammer für 15 Minuten, um alle zurückgehaltenen Blutgerinnsel zu entfernen. Ersetzen Sie nach Abschluss die restliche Kochsalzlösung durch 500 Milliliter Natriumdodecylsulfat oder SDS, Dezellularisierungslösung, um die Klappe einzutauchen. Als nächstes übertragen Sie den Zulaufschlauch in die SDS-Lösung und füllen das Gewebe.

Nach der SDS-Dezellularisierung saugen Sie das verbleibende SDS ab, bevor Sie die Klappe einen Tag lang mit PBS perfundiert. Nach der SDS-Perfusionsdezellularisierung die Klappen nacheinander zwei Stunden lang in DNA-Lösung und dann in PBS für einen Tag perfundieren, gefolgt von der Übertragung des Zuflussschlauchs in Peressigsäure und Ethanol in destilliertem Wasser, um die Klappen durch Perfusion für drei Stunden zu sterilisieren. Sobald Sie fertig sind, entfernen Sie die Klappen aseptisch und tauchen Sie sie für jeweils 15 Minuten in zwei PBS-Waschgänge mit 1% Antibiotika Antimykotika ein.

Lagern Sie die Klappen bei 4 Grad Celsius, bis sie für die Rezellularisierung bereit sind. Verwenden Sie ein 3 bis 10 Millimeter Stanzbiopsiewerkzeug, um Gewebeproben zur Beurteilung von dezellularisierten Klappen zu erhalten. Die isolierten dezellularisierten Lappen, die unter manueller Kontrolle gespült wurden, zeigten Hinweise auf einen Abfluss aus der frei entleerenden Venenkanüle von Omentum, Tensor fascia lata und radialem Unterarmlappen.

Die grobe Morphologie des nativen Omentums, der Tensorfaszie lata und der radialen Unterarmlappen erschien unmittelbar nach der Beschaffung rosafarben. Im Vergleich dazu waren dezellularisierte Gewebe charakteristisch weiß oder undurchsichtig im Aussehen. Die histologische Untersuchung von nativen Geweben mit Hämatoxylin und Eosin zeigte das Vorhandensein von blauen Kernen.

In dezellularisierten Klappen zeigte die histologische Färbung den Verlust von Zellmaterial ohne blaue Kernfärbung, was auf ein azelluläres Gewebegerüst hinweist. Eine zusätzliche Quantifizierung des DNA-Gehalts zeigte eine signifikante Abnahme der DNA in azellulären Gerüsten im Vergleich zu nativen Geweben. Die wichtigste Überlegung ist eine chirurgische Technik, die während der Beschaffung verwendet wird, um Schäden am Lappenstiel zu vermeiden, um eine spätere Perfusionsdezellularisierung zu ermöglichen.

Nach der Perfusionsdezellularisierung können die resultierenden Lappen mit gewebespezifischen Zellpopulationen rezellularisiert werden, um die nativen Gewebekompartimente zu regenerieren.