Name: Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Lernen Sie die Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem ex-vivo-Perfusions-Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation. Diese Methode reduziert die Immunogenität des Gewebes und ermöglicht Forschung an rekellularisierten Transplantaten.

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Abbildung 3A wurde BioRender.com erstellt.

Leichenförmige männliche Lewis-Ratten (300-430 g), die vom Toronto General Hospital Research Institute erhalten wurden, wurden für alle Experimente verwendet. Für alle chirurgischen Eingriffe wurden sterile Instrumente und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die aseptische Technik aufrechtzuerhalten (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care Committee am Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada) durchgeführt. Insgesamt vier Hinterbeine waren dezellularisiert.
1. Präoperative Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie 50 ml 5% heparinisierte Kochsalzlösung vor. Aus einem 50-ml-Kochsalzbeutel 2,5 ml Kochsalzlösung mit einer 5-ml-Spritze entnehmen und entsorgen. Geben Sie mit einer 5-ml-Spritze 2,5 ml Heparin in den Kochsalzbeutel. Drehen Sie den Kochsalzbeutel um, um den Inhalt zu mischen.</li>
	<li>Legen Sie eine Leichenratte in Rückenlage unter ein blaues Pad. Rasieren Sie die Hinterbeine und die Leistengegend umlaufend mit einem Elektrorasierer und entfernen Sie Haare.</li>
	<li>Bringen Sie die Ratte zur chirurgischen Station und tragen Sie Povidone Jodpeelinglösung mit einer Gaze auf die Hinterbeine und die Leistengegend auf. Anschließend 70% Isopropylalkohol auftragen, um die Peelinglösung mit Gaze abzuwischen.</li>
	<li>Entsorgen Sie das blaue Pad aus Schritt 1.2 und wechseln Sie in neue, sterile Handschuhe.</li>
</ol>2. Beschaffung der Hinterbeine der Ratte
<ol><li>Machen Sie einen Hautschnitt mit einer chirurgischen Klinge # 10 und einem Klingenläufer # 3 entlang der Leistenbandebene und bewegen Sie sich von einer lateralen in eine mediale Richtung (Abbildung 1A). Verwenden Sie Adson-Pinzetten, um die umgebende Haut zu halten, um einen glatten Schnitt zu gewährleisten.</li>
	<li>Wenn das darunter liegende Fett freigelegt ist, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Fett vorsichtig zu sezieren. Lokalisieren Sie die oberen epigastrischen Gefäße.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikroschere, um in der Nähe zu sezieren und den darunter liegenden Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene auf der Ebene des Leistenbandes freizulegen.</li>
	<li>Identifizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Femurgefäße und sezieren Sie Arterie und Vene proximal mit feinen Pinzetten, um eine ausreichende Länge von den Bifurkationspunkten des arteriellen Netzwerks zu erhalten (Abbildung 1B).</li>
	<li>Ligieren Sie die Oberschenkelarterie und die Vene separat mit 6-0-Nähten.</li>
	<li>Führen Sie eine umlaufende Dissektion um den Rest der Hinterbeine durch, ohne die ligierten Femurgefäße zu stören.</li>
	<li>Transektieren Sie den Oberschenkelknochen in der Mitte mit einem Knochenschneider.</li>
	<li>Um die Hinterbeine vollständig zu isolieren, transektieren Sie die ligierten Femurgefäße unterhalb der Ligaturen mit einer Mikroschere.</li>
	<li>Cannulatieren Sie die Oberschenkelarterie mit einem 24 G Angiokatheter unter dem Dissektionsmikroskop. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Kanüle vorsichtig einzuführen. Mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen, bis ein deutlicher Abfluss aus der Oberschenkelvene beobachtet wird.</li>
	<li>Sichern Sie die Kanüle, indem Sie eine Naht um das kanülierte Gefäß und eine andere Naht distal um die Kanüle selbst binden. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle proximal platziert ist, um eine Blockierung der Gabelungspunkte zu vermeiden.</li>
	<li>Tauchen Sie die beschafften Hinterbeine bis zur Dezellularisierung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig01.jpg"> Abbildung 1: Beschaffung der Hinterbeine der Ratte. (A) Markierung des Hautschnitts auf der Ebene des Leistenbandes von lateral nach medial. (B) Blick auf die Vena femoralis und die Arteria femoralis, die in der Nähe des Leistenbandes seziert wurden, angezeigt durch die gestrichelte Linie. Abkürzungen: L = lateral; M = medial; FV = Vena femoralis; FA = Arteria femoralis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
3. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>In einem 6-L-Glaskolben wird ein 5-L-Waschmittelreservoir mit 0,25%igem Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt, indem 12,5 g SDS-Pulver in 5 l hochreinem destilliertem Wasser gelöst werden. Decken Sie die Öffnung des Kolbens mit Parafilm ab, um ihn zu verschließen.</li>
	<li>In einem 1-l-Glasgefäß 1 l 0,25%ige SDS-Lösung separat vorbereiten, indem 2,5 g SDS in 1 L hochreines destilliertes Wasser gelöst werden. Fügen Sie einen Rührbalken hinzu, um die Lösung auf einem Magnetrührer zu mischen, bis sich das gesamte SDB aufgelöst hat.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 L 1x PBS-Waschlösung mit 1% iger Antibiotika-Antimykotikum (AA) -Lösung vor. In einem 1-L-Kolben werden 990 ml 1x PBS-Lösung und 10 ml AA hinzugefügt.</li>
	<li>Separat in einem 500-ml-Glasgefäß 1x PBS + 1% AA-Lösung erneut mit 495 ml 1x PBS-Lösung und 5 ml AA zubereiten.</li>
	<li>Bereiten Sie 200 ml 1% Peressigsäure (PAA)/4% Ethanol (EtOH) Lösung vor. Bereiten Sie diese Lösung unter einem Abzug vor.</li>
</ol>4. Aufbau von Bioreaktor und Perfusionskreislauf
HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie die Konfiguration des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs während der aufgeführten Schritte.
<ol><li>Bohren Sie in einer 500-ml-Kammer (Kunststoffbehälter) drei Löcher (1/4 Zoll) an den in Abbildung 2 gekennzeichneten Stellen: Anschluss A ist die Einlassleitung, Anschluss B ist die Nachfüllleitung und Anschluss C ist die Auslassleitung. Entfernen und entsorgen Sie überschüssiges Plastik. Besprühen und wischen Sie die Kammer mit 70% Ethanol ab.</li>
	<li>Schneiden Sie drei 5 cm lange Silikonschläuche ab und führen Sie einen halb in jeden Port der Kammer ein. Schließen Sie einen Luer-Stecker an der Öffnung von Port A zur Innenseite der Kammer und eine Luer-Buchse am anderen Ende der Röhre außerhalb der Kammer an.</li>
	<li>Schließen Sie eine Luer-Buchse an Port B und Port C an den Enden der Röhren an, die aus der Kammer zeigen.</li>
	<li>Bohren Sie in einem luftdichten Deckel für den Kunststoffbehälter ein Loch auf die Oberfläche des Deckels.</li>
	<li>Schneiden Sie einen 3 cm langen Silikonschlauch und führen Sie ihn in das Loch des Deckels ein. Stellen Sie sicher, dass sich etwa 2 cm des Röhrchens außerhalb des Deckels befinden, wie in Abbildung 2 dargestellt.</li>
	<li>Sterilisieren Sie sowohl die Kammer als auch den Deckel mit dem Schlauch.</li>
	<li>Schneiden Sie zwei 30 cm Silikonschläuche mit einer Schere ab. Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Anschluss an einem Ende jeder Röhre an einen 1/8-Zoll-Anschluss an.</li>
	<li>Schneiden Sie separat zwei 12 cm Silikonschläuche mit einer Schere ab. Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Anschluss an einen 1/8-Zoll-Stecker an einem Ende beider Röhren an. Schließen Sie einen Luer-Stecker am anderen Ende einer Röhre und eine Luer-Buchse an die andere Röhre an.</li>
	<li>Sterilisieren Sie das gesamte Schlauchmaterial aus Schritt 4.7 und Schritt 4.8. Schließen Sie zwei 3-Stufen-Pumpenschläuche (1,85 mm) in die Sterilisation ein.</li>
	<li>Bereiten Sie drei 3-Wege-Absperrhähne, einen Spritzenfilter, zwei serologische 1-ml-Pipetten und eine 10-ml-Spritze für den Dezellularisierungsaufbau vor. Entfernen Sie den Filter von den 1-ml-serologischen Pipetten.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig02.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung der Konstruktion des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs. Gezeigte Vorrichtung des Perfusionskreislaufs einschließlich (A) Schlauchpumpe und (B) entsprechender Kassetten für Einlass- und Auslassleitungen. (C, D) Silikonschläuche von 12 cm und 30 cm werden ebenfalls mit entsprechenden Verbindern gezeigt. (E) Schlauch für Schlauchpumpe (1,85 mm). Bioreaktorkammer mit beschrifteten Anschlüssen für (F) Zufluss, (G) Nachschuböffnung und (H) Abfluss. (I) Bioreaktordeckel mit Lüftungsöffnung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
5. Dezellularisierung der Hinterbeine von Ratten
<ol><li>Platzieren Sie die sterilisierte Kammer und schrauben Sie drei Einweg-3-Wege-Absperrhähne an den Einlass-, Auslass- und Nachfüllleitungen. Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn für den Nachschubanschluss an den verbleibenden zwei Anschlüssen verschlossen ist, um ein Auslaufen zu verhindern.</li>
	<li>Befestigen Sie die in Schritt 4.8 hergestellten Rohre an den Absperrhähnen an den Ein- und Auslassleitungen.</li>
	<li>Verbinden Sie den Schlauch mit den Schläuchen im obigen Schritt. Befestigen Sie die Kassette am Schlauch und legen Sie sie auf die Schlauchpumpe. Sichern Sie die Kassetten noch nicht mit einem Schlauch.</li>
	<li>Verbinden Sie ein Rohr von Schritt 4.7 mit dem Ende des Schlauchs der Auslassleitung aus dem obigen Schritt. Schließen Sie am anderen Ende eine 1-ml-serologische Pipette an. Hängen Sie das mit einer serologischen Pipette befestigte Ende in den Abfallbehälterkolben.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.7 für die Einlassleitung. Hängen Sie das Ende des Röhrchens, das an der serologischen Pipette befestigt ist, in den Waschmittelbehälter auf. Verschließen Sie die Öffnung des Waschmittelbehälterkolbens sofort mit Parafilm. Siehe Abbildung 3A,B für eine Übersicht über den Dezellularisierungskreislauf.</li>
	<li>0,25% SDS aus dem 1-Liter-Glas (Schritt 3.2) auf halber Höhe in die Bioreaktorkammer geben.</li>
	<li>Nehmen Sie das beschaffte Hinterbein mit einer Adson-Pinzette und hängen Sie es vorsichtig in die Bioreaktorkammer.</li>
	<li>Verwenden Sie zwei Paar Adson-Pinzetten, um den kanülierten Teil der Hinterbeine zur Einlasslinie zu führen. Während Sie die Kanüle mit einer Pinzette halten, verwenden Sie die andere Pinzette, um die Einlassleitung an der Kanüle zu drehen und zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht gezogen oder verdreht wird, um eine Dekanülierung zu verhindern.</li>
	<li>Nach dem Sichern fügen Sie weitere 0,25% SDS aus dem 1-Liter-Glasgefäß hinzu, um die Extremität nach Bedarf vollständig einzutauchen. Stellen Sie sicher, dass der Auslassanschluss ebenfalls in den Bioreaktorbehälter eingetaucht ist, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiger Abfluss aufrechterhalten wird (Abbildung 3C).</li>
	<li>Befestigen Sie einen Einwegspritzenfilter an der Belüftungsöffnung am Deckel der Bioreaktorkammer unter Bezugnahme auf Schritt 4.4 und Schritt 4.5.</li>
	<li>Befestigen Sie den Deckel am Bioreaktor, und stellen Sie sicher, dass die Kammer von allen Seiten abgedichtet ist (Abbildung 3B).</li>
	<li>Um Luft aus dem Schlauch zu entfernen und den Perfusionskreislauf anzusaugen, verwenden Sie eine neue 10-ml-Einwegspritze, um das Reinigungsmittel mit dem 3-Wege-Absperrhahn an der Einlassleitung aus dem Waschmittelbehälter zu ziehen.</li>
	<li>Verwenden Sie nach dem Ziehen die gleiche Flüssigkeit, um sie in den 3-Wege-Absperrhahn an der Auslassleitung einzuführen. Stellen Sie sicher, dass sich im gesamten Schlauch sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen Reinigungsmittel befindet.</li>
	<li>Drücken Sie die Kassetten nach unten und befestigen Sie sie mit dem Schlauch in der Schlauchpumpe. Schalten Sie die Schlauchpumpe mit dem Netzschalter ein.<ol><li>Fahren Sie auf dem Bildschirm der Schlauchpumpe mit der Pfeiltaste zur zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate für den ersten Kanal einzustellen. Eingangsdurchfluss als Lieferart und Einstellung der Perfusionsrate auf 1 ml/min. Stellen Sie sicher, dass die Strömungsrichtung entsprechend der Geräteeinrichtung korrekt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Kanal.</li>
		<li>Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsmenge, die durch die Einlassleitung abgegeben und/oder aus der Auslassleitung entnommen wird, mit einer konsistenten Rate zwischen den beiden fließt. Stellen Sie sicher, dass die Schlauch-ID auf 1,85 mm eingestellt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Beginnen Sie mit der Dezellularisierung über die Maschinenperfusion bei 1 ml / min sowohl für die Einlass- als auch für die Ausgangsleitungen, indem Sie den Netzschalter auf der Tastatur drücken. Überwachen und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen konsistent und kontinuierlich ist.</li>
	<li>Setzen Sie die Dezellularisierung fort und überwachen Sie sie täglich. Verwenden Sie den 1 L 0,25% SDS (Schritt 3.2), um das Bioreaktorreservoir nach Bedarf durch den Nachfüllanschluss aufzufüllen. Suchen Sie nach einem weißen, durchscheinenden Aussehen des Gewebes, das am Tag 5 erscheint, was auf eine Dezellularisierung der Hinterbeine der Ratte hinweist.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig03.jpg"> Abbildung 3: Überblick über den Perfusionsdezellularisierungs-Bioreaktorkreislauf der Rattenhinterbeine . (A) Schematische Darstellung des Bioreaktor-Perfusionskreislaufs. Blaue Pfeile zeigen die Richtung des Waschmittel- und Abfallflusses an. (B) Überblick über den Dezellularisierungskreislauf mit Bioreaktor mit Rattenhinterbein. Das SDS-Reservoir (linker Kolben) führt in die Schlauchpumpe und in den Einlassschlauch des Bioreaktors. Der Abfluss wird durch die Schlauchpumpe mit dem Abfallbehälter (rechter Kolben) verbunden. (C) (I) Bioreaktor mit Rattenhinterbein mit Einlassschläuchen, die mit der Kanülenarterie femoralisiert verbunden sind. (II) Auffüllen des Anschlusses in der Ecke für die Perfusion von Reinigungsmittel. (III) Abflussrohre, die im Aufhängungsbehälter aufgehängt sind. Abkürzung: SDS = Natriumdodecylsulfat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
6. Waschen und Sterilisieren nach der Dezellularisierung
<ol><li>Nach der Bestätigung der Dezellularisierung ersetzen Sie den Waschmittelbehälter durch den 1x PBS + 1% AA-Behälter. Die Öffnung des Kolbens wird mit Parafilm verschlossen. Beginnen Sie 1x PBS + 1% AA Perfusion bei 1 ml / min und fahren Sie für 2 Tage fort.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 1x PBS + 1% AA-Reservoir durch 200 ml 0,1% PAA/4% EtOH-Reservoir und beginnen Sie mit der Perfusion bei 1 ml/min für 2 h.</li>
	<li>Trennen Sie die Hinterbeine von der Einlassleitung mit zwei Paaren steriler Adson-Pinzetten, wobei eine Pinzette die Einlasslinie dreht und die andere die Kanüle hält. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht gezogen wird, um eine Dekanülierung zu verhindern.</li>
	<li>Lagern Sie die Extremität bis zur weiteren Verwendung in einem 500 ml Glasgefäß mit 1x PBS + 1% AA bei 4 °C.</li>
</ol>

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<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Rattenhinterbeine sind als experimentelle Modelle in VCA5 nützlich. Das Tissue Engineering von azellulären Gerüsten stellt den ersten Schritt dar, um die Mängel langfristiger Immunsuppressionsregime im Zusammenhang mit VCA zu beheben. Die Verwendung von Komposittransplantaten stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, da mehrere Gewebe vorhanden sind, von denen jedes einzigartige funktionelle, immunogene und strukturelle Eigenschaften aufweist. Das vorliegende Protokoll zeigt eine erfolgreiche M...

VCA ist eine neue Option für Patienten, die eine komplexe chirurgische Rekonstruktion benötigen. Traumatische Verletzungen oder Tumorresektionen führen zu einem volumetrischen Gewebeverlust, der schwer zu rekonstruieren ist. VCA bietet die Transplantation mehrerer Gewebe wie Haut, Knochen, Muskeln, Nerven und Gefäße als zusammengesetztes Transplantat von einem Spender an einen Empfängeran 1. Trotz seiner vielversprechenden Natur ist VCA aufgrund langfristiger immunsuppressiver Therapien begrenzt. Der lebenslange Gebrauch solcher Medikamente führt zu einem erhöhten Risiko für opportunistische Infektionen, Malignome und Endorgantoxizität 1,2,3. Um die Notwendigkeit einer Immunsuppression zu reduzieren und / oder zu eliminieren, sind Tissue-Engineering-Gerüste mit Dezellularisierungsansätzen für VCA vielversprechend.
Die Dezellularisierung des Gewebes beinhaltet die Beibehaltung der extrazellulären Matrixstruktur bei gleichzeitiger Entfernung des zellulären und nukleären Inhalts. Dieses dezellularisierte Gerüst kann mit patientenspezifischen Zellen wieder bevölkert werden4. Die Erhaltung des ECM-Netzwerks aus zusammengesetzten Geweben ist jedoch eine zusätzliche Herausforderung. Dies ist auf das Vorhandensein mehrerer Gewebetypen mit unterschiedlichen Gewebedichten, Architekturen und anatomischen Positionen innerhalb eines Gerüsts zurückzuführen. Das vorliegende Protokoll bietet eine Operationstechnik und eine Dezellularisierungsmethode für eine Rattenhinterbeine. Dies ist ein Proof-of-Concept-Modell für die Anwendung dieser Tissue-Engineering-Technik auf zusammengesetzte Gewebe. Dies kann auch zu nachfolgenden Bemühungen führen, Kompositgewebe durch Rezellularisierung zu regenerieren.

<table><tbody><tr><td>0,9 % Natriumchlorid-Injektion USP 50 mL</td><td>Baxter Corporation</td><td>JB1308M</td><td></td></tr><tr><td>1 mL serologische Einwegpipetten</td><td>VWR</td><td>75816-102</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Einwegspritzen</td><td></td><td></td><td>von der Forschungseinrichtung</td></tr><tr><td>erhalten 3-Wege-Absperrhahn</td><td></td><td></td><td>von der Forschungseinrichtung</td></tr><tr><td>5cc Einwegspritzen</td><td></td><td></td><td>Gewonnen von der Forschungseinrichtung</td></tr><tr><td>70% Isopropylalkohol</td><td></td><td></td><td>Gewonnen von der Forschungseinrichtung</td></tr><tr><td>Acrodisc Spritzenfilter 0,2 & Mikro; m</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>Adson-Pinzette, gerade</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Angiokatheter 24 G 19 mm (&frac34; &rdquo;)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>38112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-antimykotische Lösung (100x) 100 mL</td><td>Multicell</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>Knochenschneider</td><td>Fine Science Tools</td><td>12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Anschlüsse für 1/16" auf 1/8" Röhrchen</td><td>McMasterCarr</td><td>5117K52</td><td></td></tr><tr><td>Luer-auf-Widerhaken-Adapter (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K328</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette mit mikrostumpfen Spitzen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektion 10.000 IE/10 mL</td><td>LEO Pharma Inc.</td><td>006174-09</td><td></td></tr><tr><td>Luer-auf-Widerhaken-Adapter (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K322</td><td></td></tr><tr><td>Mikronadelhalter</td><td>WLorenz</td><td>04-4125</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>WLorenz</td><td>SP-4506</td><td></td></tr><tr><td>Peressigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>269336-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe, 3-Kanal</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-78001-68</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x 500 mL</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Chirurgische Peeling-Lösung</td><td></td><td></td>, gewonnen aus Pumpenschläuchen <td>der Forschungseinrichtung</td></tr><tr><td>, 3-Stopp, Tygon E-LFL</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td></td></tr><tr><td>Pumpenschlauch, platingehärtetes Silikon</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge - #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff - #3&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat Reagenz Qualität: Reinheit: >99%, 1 kg</td><td>Bioshop</td><td>SDS003.1</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Nahtmaterial #6-0</td><td>Covidien</td><td>VS889</td><td></td></tr></tbody></table>

beschaffung und dezellularisierung von rattenhinterbeinen mit einem ex-vivo-perfusions-basierten bioreaktor für die vaskularisierte komposit-allotransplantation

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patienten mit schweren traumatischen Verletzungen und Gewebeverlust benötigen eine komplexe chirurgische Rekonstruktion. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist ein sich entwickelnder rekonstruktiver Weg zum Transfer mehrerer Gewebe als zusammengesetzte Untereinheit. Trotz der vielversprechenden Natur von VCA sind die langfristigen immunsuppressiven Anforderungen aufgrund des erhöhten Risikos von Malignomen, Endorgantoxizität und opportunistischen Infektionen eine signifikante Einschränkung. Das Tissue Engineering von azellulären Kompositgerüsten ist eine mögliche Alternative zur Verringerung des Bedarfs an Immunsuppression. Hierin wird die Beschaffung eines Rattenhinterbeins und dessen anschließende Dezellularisierung unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) beschrieben. Die vorgestellte Beschaffungsstrategie basiert auf der Arteria femoralis. Ein maschinelles perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde konstruiert und zur ex vivo Dezellularisierung der Hinterbeine eingesetzt. Eine erfolgreiche Perfusionsdezellularisierung wurde durchgeführt, was zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen der Hinterbeine führte. Ein intaktes, perfusierbares, vaskuläres Netzwerk in der gesamten Hinterbeine wurde beobachtet. Histologische Analysen zeigten die Entfernung von Kerninhalten und die Erhaltung der Gewebearchitektur über alle Gewebekompartimente hinweg.

Das Beschaffungsprotokoll war erfolgreich bei der Isolierung und Kanülierung der gemeinsamen Oberschenkelarterien für nachfolgende Perfusionsschritte. Die repräsentativen Dissektionsbilder in Abbildung 1A,B zeigen die Inzisionslage und Exposition der Femurgefäße mit ausreichendem Abstand zu den Bifurkationspunkten. Abbildung 2 zeigt die Apparatur, die für die Vorbereitung des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs erforderlich ist. Der Endpunk...

Wir beschreiben die Operationstechnik und den Dezellularisierungsprozess für zusammengesetzte Rattenhinterbeine. Die Dezellularisierung erfolgt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat mit niedriger Konzentration durch ein Ex-vivo-Maschinenperfusionssystem.

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Wir haben ein Kleintiermodell für die Dezellularisierung einer Extremität etabliert. Dies ist nützlich, um die Proof-of-Concept-Forschung zur De- und Rezellularisierung von vaskularisierten Kompositgeweben zu erleichtern. Immunsuppressionsschemata sind eine der Haupteinschränkungen bei der vaskularisierten Komposit-Allotransplantation.Die Immunogenität des Gewebes kann durch Dezellularisierung reduziert werden. Um zu beginnen, machen Sie einen Hautschnitt mit einer chirurgischen Klinge Nummer 10 entlang des Leistenbandes, bewegen Sie sich von einer lateralen zu einer medialen Richtung, während Sie die umgebende Haut mit Adson Pinzette halten. Wenn das darunter liegende Fett freigelegt ist, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Fett sorgfältig zu sezieren und die oberen Oberbauchgefäße zu lokalisieren.Mit einer Mikroschere proximal sezieren und den darunter liegenden Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene auf Leistenbandebene freilegen. Identifizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Femurgefäße und sezieren Sie die Arterie und Vene proximal mit feinen Pinzetten, um eine ausreichende Länge von den Bifurkationspunkten des arteriellen Netzwerks zu erhalten. Dann ligieren Sie die Oberschenkelvene und die Arterie separat mit 6-0-Nähten.Als nächstes führen Sie eine umlaufende Dissektion um den Rest der Hinterbeine durch, ohne die ligierten Femurgefäße zu stören, und durchqueren Sie den Oberschenkelknochen in der Mitte mit einem Knochenschneider. Um die Hinterbeine vollständig zu isolieren, transektieren Sie die ligierten Femurgefäße distal zu den Ligaturen mit einer Mikroschere und kanülieren Sie die Oberschenkelarterie mit einem 24-Gauge-Angiokatheter unter dem Dissektionsmikroskop. Dann mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen, bis ein deutlicher Abfluss aus der Oberschenkelvene beobachtet wird.Sichern Sie die Kanüle, indem Sie eine Naht um das kanülierte Gefäß in einer anderen Naht distal um die Kanüle selbst binden und sicherstellen, dass die Kanüle in der Nähe platziert wird, um eine Blockierung der Gabelungspunkte zu verhindern. Danach tauchen Sie die beschafften Hinterbeine und PBS bis zur Dezellularisierung ein. Um den Bioreaktor zu konstruieren, platzieren Sie die sterilisierte Kammer und schrauben Sie drei Einweg-Dreiwege-Absperrhähne an den Einlass-, Auslass- und Nachschubleitungen, um sicherzustellen, dass der Absperrhahn für den Nachfüllanschluss an den verbleibenden zwei Anschlüssen verschlossen ist, um ein Auslaufen zu verhindern.Befestigen Sie die zuvor hergestellten Silikonschläuche an den Absperrhähnen an den Ein- und Auslassleitungen. Verbinden Sie dann den Schlauch mit den Silikonschläuchen. Nachdem Sie die Kassette auf dem Schlauch befestigt haben, legen Sie sie auf die Schlauchpumpe.Als nächstes verbinden Sie einen der Silikonschläuche mit dem Ende des Schlauchs der Auslassleitung aus dem obigen Schritt. Schließen Sie am anderen Ende eine serologische Ein-Milliliter-Pipette an und suspendieren Sie das Ende mit einer serologischen Pipette im Abfallbehälterkolben. Als nächstes hängen Sie das Ende des Röhrchens, das an der serologischen Pipette befestigt ist, in den Waschmittelbehälter und verschließen sofort die Öffnung des Waschmittelbehälterkolbens mit Parafilm.0,25% SDS aus dem Ein-Liter-Glasgefäß auf halber Höhe in die Bioreaktorkammer geben. Nehmen Sie dann das beschaffte Hinterbein mit einer Adson-Pinzette und hängen Sie es vorsichtig in die Bioreaktorkammer auf. Führen Sie den kanülierten Teil der Hinterbeine mit zwei Paar Adson-Pinzetten zur Einlasslinie, während Sie die Kanüle mit einer Pinzette halten.Verwenden Sie die andere Pinzette, um die Einlassleitung an der Kanüle zu drehen und zu befestigen. Fügen Sie nach dem Sichern weitere 0,25% SDS aus dem Ein-Liter-Glasgefäß hinzu, um die Extremität nach Bedarf vollständig einzutauchen, um sicherzustellen, dass der Auslassanschluss auch in das Bioreaktorreservoir eingetaucht ist und ein gleichmäßiger Abfluss aufrechterhalten wird. Befestigen Sie dann einen Einwegspritzenfilter an der Belüftungsöffnung am Deckel der Bioreaktorkammer und befestigen Sie den Deckel am Bioreaktor, um sicherzustellen, dass die Kammer von allen Seiten abgedichtet ist.Um Luft aus dem Schlauch zu entfernen und den Perfusionskreislauf anzusaugen, verwenden Sie eine neue 10-Milliliter-Einwegspritze, um Reinigungsmittel aus dem Waschmittelbehälter mit einem Dreiwegehahn an der Einlassleitung zu ziehen. Verwenden Sie nach dem Ziehen die gleiche Flüssigkeit, um sie in den Dreiwegehahn an der Auslassleitung einzuführen. Als nächstes drücken und befestigen Sie die Kassetten mit dem Schlauch in der Schlauchpumpe.Schalten Sie dann die Schlauchpumpe mit dem Netzschalter ein. Fahren Sie auf dem Bildschirm der Schlauchpumpe mit der Pfeiltaste zur zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate für den ersten Kanal mit der Eingangsdurchflussrate als Lieferart einzustellen, und stellen Sie die Perfusionsrate auf einen Milliliter pro Minute ein, um sicherzustellen, dass die Strömungsrichtung entsprechend der Gerätekonfiguration korrekt ist. Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsmenge, die durch die Einlassleitung geliefert wird, und/oder die aus der Auslassleitung entnommen wird, konsistent zwischen den beiden fließt, um sicherzustellen, dass die Schlauch-ID auf 1,85 Millimeter eingestellt ist.Beginnen Sie mit der Dezellularisierung über Maschinenperfusion bei einem Milliliter pro Minute sowohl für die Einlass- als auch für die Ausgangsleitungen, indem Sie den Netzschalter auf der Tastatur drücken. Überwachen und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen kontinuierlich ist. Verwenden Sie 1 Liter 0,25% STS, füllen Sie das Bioreaktorreservoir nach Bedarf durch den Nachfüllanschluss auf.Suchen Sie dann nach einem weißen, durchscheinenden Aussehen des Gewebes, das am fünften Tag erscheint, was auf eine Dezellularisierung der Hinterbeine der Ratte hinweist. Nach Bestätigung der Dezellularisierung ersetzen Sie das Waschmittelreservoir durch das PBS- und 1%Antibiotic-Antimycotic-Reservoir und verschließen die Öffnung des Kolbens mit Parafilm. Beginnen Sie PBS und 1% Antibiotika-Antimykotische Perfusion bei einem Milliliter pro Minute und fahren Sie zwei Tage lang fort.Ersetzen Sie das PBS- und 1%Antibiotika-Antimykotika-Reservoir durch 200 Milliliter 0,1%Parasitensäure, 4%Ethanolreservoir und beginnen Sie zwei Stunden lang mit der Perfusion bei einem Milliliter pro Minute. Trennen Sie die Hinterbeine unter einer Biosicherheitswerkbank von der Einlassleitung mit zwei Paaren steriler Adson-Pinzetten mit einer Pinzette, um die Einlassleitung zu drehen, und der anderen, die die Kanüle hält, um sicherzustellen, dass die Kanüle nicht gezogen wird, um eine Dekanülierung zu verhindern. Lagern Sie die Extremität in einem 500-Milliliter-Glasgefäß mit PBS und 1% Antibiotikum-Antimykotikum bei 4 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.Sowohl die dezellularisierte Oberschenkelarterie als auch die Vene zeigten einen Verlust des Kerngehalts in allen Schichten und im umgebenden Bindegewebe, da in den nativen Gefäßen keine blau gefärbten Kerne vorhanden waren. Die Tunica intima media und die Adventitia sowohl der Oberschenkelvene als auch der Arterien wurden in den dezellularisierten Gefäßen aufrechterhalten. Der Femurnerv zeigte eine Erhaltung der Gewebestruktur, einschließlich des Endoneuriums.Der Knochen zeigte eine allgemeine strukturelle Retention mit Verlust von gefärbten Kernen von Osteozyten und von umgebenden Endosteum- und Periostschichten nach der Dezellularisierung. Die Haut zeigte einen Zellverlust aus Epidermis und Dermis. Die Dermis zeigte zurückgehaltene Kollagenfasern, die nativem Hautgewebe ähnelten.Schließlich zeigte die Queransicht der Skelettmuskulatur den Verlust von Kernen, die sich sonst in den Peripherien des Endomysiums befinden. Der Myofibrillengehalt blieb nach der Dezellularisierung in den jeweiligen Faszikeln erhalten. Es wurde auch eine DNA-Quantifizierung mit PicoGreen durchgeführt, bei der der DNA-Gehalt über die Oberschenkelgefäße, Nerven, Haut, Muskeln und Knochen signifikant reduziert wurde.Nach diesem Protokoll kann die dezellularisierte Extremität weiter charakterisiert werden. Dies beinhaltet die Untersuchung der extrazellulären Matrix sowohl mit histologischen als auch mit biochemischen Methoden und die Beurteilung der vaskulären Matrix mittels Bildgebung. Der dezellularisierte Stamm kann auch mit gewebespezifischen Zellen rezellularisiert werden.

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Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (Video) | JoVE Journal

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

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