Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Wir haben ein Kleintiermodell für die Dezellularisierung einer Extremität etabliert. Dies ist nützlich, um die Proof-of-Concept-Forschung zur De- und Rezellularisierung von vaskularisierten Kompositgeweben zu erleichtern. Immunsuppressionsschemata sind eine der Haupteinschränkungen bei der vaskularisierten Komposit-Allotransplantation.

Die Immunogenität des Gewebes kann durch Dezellularisierung reduziert werden. Um zu beginnen, machen Sie einen Hautschnitt mit einer chirurgischen Klinge Nummer 10 entlang des Leistenbandes, bewegen Sie sich von einer lateralen zu einer medialen Richtung, während Sie die umgebende Haut mit Adson Pinzette halten. Wenn das darunter liegende Fett freigelegt ist, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Fett sorgfältig zu sezieren und die oberen Oberbauchgefäße zu lokalisieren.

Mit einer Mikroschere proximal sezieren und den darunter liegenden Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene auf Leistenbandebene freilegen. Identifizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Femurgefäße und sezieren Sie die Arterie und Vene proximal mit feinen Pinzetten, um eine ausreichende Länge von den Bifurkationspunkten des arteriellen Netzwerks zu erhalten. Dann ligieren Sie die Oberschenkelvene und die Arterie separat mit 6-0-Nähten.

Als nächstes führen Sie eine umlaufende Dissektion um den Rest der Hinterbeine durch, ohne die ligierten Femurgefäße zu stören, und durchqueren Sie den Oberschenkelknochen in der Mitte mit einem Knochenschneider. Um die Hinterbeine vollständig zu isolieren, transektieren Sie die ligierten Femurgefäße distal zu den Ligaturen mit einer Mikroschere und kanülieren Sie die Oberschenkelarterie mit einem 24-Gauge-Angiokatheter unter dem Dissektionsmikroskop. Dann mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen, bis ein deutlicher Abfluss aus der Oberschenkelvene beobachtet wird.

Sichern Sie die Kanüle, indem Sie eine Naht um das kanülierte Gefäß in einer anderen Naht distal um die Kanüle selbst binden und sicherstellen, dass die Kanüle in der Nähe platziert wird, um eine Blockierung der Gabelungspunkte zu verhindern. Danach tauchen Sie die beschafften Hinterbeine und PBS bis zur Dezellularisierung ein. Um den Bioreaktor zu konstruieren, platzieren Sie die sterilisierte Kammer und schrauben Sie drei Einweg-Dreiwege-Absperrhähne an den Einlass-, Auslass- und Nachschubleitungen, um sicherzustellen, dass der Absperrhahn für den Nachfüllanschluss an den verbleibenden zwei Anschlüssen verschlossen ist, um ein Auslaufen zu verhindern.

Befestigen Sie die zuvor hergestellten Silikonschläuche an den Absperrhähnen an den Ein- und Auslassleitungen. Verbinden Sie dann den Schlauch mit den Silikonschläuchen. Nachdem Sie die Kassette auf dem Schlauch befestigt haben, legen Sie sie auf die Schlauchpumpe.

Als nächstes verbinden Sie einen der Silikonschläuche mit dem Ende des Schlauchs der Auslassleitung aus dem obigen Schritt. Schließen Sie am anderen Ende eine serologische Ein-Milliliter-Pipette an und suspendieren Sie das Ende mit einer serologischen Pipette im Abfallbehälterkolben. Als nächstes hängen Sie das Ende des Röhrchens, das an der serologischen Pipette befestigt ist, in den Waschmittelbehälter und verschließen sofort die Öffnung des Waschmittelbehälterkolbens mit Parafilm.

0,25% SDS aus dem Ein-Liter-Glasgefäß auf halber Höhe in die Bioreaktorkammer geben. Nehmen Sie dann das beschaffte Hinterbein mit einer Adson-Pinzette und hängen Sie es vorsichtig in die Bioreaktorkammer auf. Führen Sie den kanülierten Teil der Hinterbeine mit zwei Paar Adson-Pinzetten zur Einlasslinie, während Sie die Kanüle mit einer Pinzette halten.

Verwenden Sie die andere Pinzette, um die Einlassleitung an der Kanüle zu drehen und zu befestigen. Fügen Sie nach dem Sichern weitere 0,25% SDS aus dem Ein-Liter-Glasgefäß hinzu, um die Extremität nach Bedarf vollständig einzutauchen, um sicherzustellen, dass der Auslassanschluss auch in das Bioreaktorreservoir eingetaucht ist und ein gleichmäßiger Abfluss aufrechterhalten wird. Befestigen Sie dann einen Einwegspritzenfilter an der Belüftungsöffnung am Deckel der Bioreaktorkammer und befestigen Sie den Deckel am Bioreaktor, um sicherzustellen, dass die Kammer von allen Seiten abgedichtet ist.

Um Luft aus dem Schlauch zu entfernen und den Perfusionskreislauf anzusaugen, verwenden Sie eine neue 10-Milliliter-Einwegspritze, um Reinigungsmittel aus dem Waschmittelbehälter mit einem Dreiwegehahn an der Einlassleitung zu ziehen. Verwenden Sie nach dem Ziehen die gleiche Flüssigkeit, um sie in den Dreiwegehahn an der Auslassleitung einzuführen. Als nächstes drücken und befestigen Sie die Kassetten mit dem Schlauch in der Schlauchpumpe.

Schalten Sie dann die Schlauchpumpe mit dem Netzschalter ein. Fahren Sie auf dem Bildschirm der Schlauchpumpe mit der Pfeiltaste zur zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate für den ersten Kanal mit der Eingangsdurchflussrate als Lieferart einzustellen, und stellen Sie die Perfusionsrate auf einen Milliliter pro Minute ein, um sicherzustellen, dass die Strömungsrichtung entsprechend der Gerätekonfiguration korrekt ist. Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsmenge, die durch die Einlassleitung geliefert wird, und/oder die aus der Auslassleitung entnommen wird, konsistent zwischen den beiden fließt, um sicherzustellen, dass die Schlauch-ID auf 1,85 Millimeter eingestellt ist.

Beginnen Sie mit der Dezellularisierung über Maschinenperfusion bei einem Milliliter pro Minute sowohl für die Einlass- als auch für die Ausgangsleitungen, indem Sie den Netzschalter auf der Tastatur drücken. Überwachen und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen kontinuierlich ist. Verwenden Sie 1 Liter 0,25% STS, füllen Sie das Bioreaktorreservoir nach Bedarf durch den Nachfüllanschluss auf.

Suchen Sie dann nach einem weißen, durchscheinenden Aussehen des Gewebes, das am fünften Tag erscheint, was auf eine Dezellularisierung der Hinterbeine der Ratte hinweist. Nach Bestätigung der Dezellularisierung ersetzen Sie das Waschmittelreservoir durch das PBS- und 1%Antibiotic-Antimycotic-Reservoir und verschließen die Öffnung des Kolbens mit Parafilm. Beginnen Sie PBS und 1% Antibiotika-Antimykotische Perfusion bei einem Milliliter pro Minute und fahren Sie zwei Tage lang fort.

Ersetzen Sie das PBS- und 1%Antibiotika-Antimykotika-Reservoir durch 200 Milliliter 0,1%Parasitensäure, 4%Ethanolreservoir und beginnen Sie zwei Stunden lang mit der Perfusion bei einem Milliliter pro Minute. Trennen Sie die Hinterbeine unter einer Biosicherheitswerkbank von der Einlassleitung mit zwei Paaren steriler Adson-Pinzetten mit einer Pinzette, um die Einlassleitung zu drehen, und der anderen, die die Kanüle hält, um sicherzustellen, dass die Kanüle nicht gezogen wird, um eine Dekanülierung zu verhindern. Lagern Sie die Extremität in einem 500-Milliliter-Glasgefäß mit PBS und 1% Antibiotikum-Antimykotikum bei 4 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.

Sowohl die dezellularisierte Oberschenkelarterie als auch die Vene zeigten einen Verlust des Kerngehalts in allen Schichten und im umgebenden Bindegewebe, da in den nativen Gefäßen keine blau gefärbten Kerne vorhanden waren. Die Tunica intima media und die Adventitia sowohl der Oberschenkelvene als auch der Arterien wurden in den dezellularisierten Gefäßen aufrechterhalten. Der Femurnerv zeigte eine Erhaltung der Gewebestruktur, einschließlich des Endoneuriums.

Der Knochen zeigte eine allgemeine strukturelle Retention mit Verlust von gefärbten Kernen von Osteozyten und von umgebenden Endosteum- und Periostschichten nach der Dezellularisierung. Die Haut zeigte einen Zellverlust aus Epidermis und Dermis. Die Dermis zeigte zurückgehaltene Kollagenfasern, die nativem Hautgewebe ähnelten.

Schließlich zeigte die Queransicht der Skelettmuskulatur den Verlust von Kernen, die sich sonst in den Peripherien des Endomysiums befinden. Der Myofibrillengehalt blieb nach der Dezellularisierung in den jeweiligen Faszikeln erhalten. Es wurde auch eine DNA-Quantifizierung mit PicoGreen durchgeführt, bei der der DNA-Gehalt über die Oberschenkelgefäße, Nerven, Haut, Muskeln und Knochen signifikant reduziert wurde.

Nach diesem Protokoll kann die dezellularisierte Extremität weiter charakterisiert werden. Dies beinhaltet die Untersuchung der extrazellulären Matrix sowohl mit histologischen als auch mit biochemischen Methoden und die Beurteilung der vaskulären Matrix mittels Bildgebung. Der dezellularisierte Stamm kann auch mit gewebespezifischen Zellen rezellularisiert werden.