Name: Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Erfahren Sie eine minimal-invasive Methode zur viralen Transgenexpression in Nagetierherzen mittels intramyokardialer Injektion unter Ultraschallführung. Diese Technik ermöglicht die Bewertung von Herzrhythmusstörungen im isolierten Langendorff-Herz.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Projektzuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (PJT-148918 und PJT-180533 an WL), den CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, an WL), das McDonald-Stipendium und den New Investigator Award der Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) (S-17-LI-0866, an WL), Studentenstipendien (an JW und YX) und ein Postdoc-Stipendium (an AL) von den Cardiac Endowment Funds der University of Ottawa am Heart Institute. Die Autoren danken Herrn Richard Seymour für seine technische Unterstützung. Abbildung 2 wurde mit Biorender.com mit genehmigten Lizenzen erstellt.

Alle beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom Animal Research Ethics Review Board an der University of Ottawa und dem Biosafety Review Committee am University of Ottawa Heart Institute genehmigt. Die entwickelten Sicherheitsprotokolle beinhalten, dass alle Verfahren, die sich mit rekombinantem Adenovirus oder Adeno-assoziiertem Virus (AAV) befassen, in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt wurden. Alle Gegenstände, die mit dem Virus in Berührung kamen, wurden nach dem Experiment gründlich dekontaminiert. Für die vorliegende Studie wurden Ctnnb1 flox/flox und αMHC-MerCreMer Mäuse (8-12 Wochen alt, beiderlei Geschlechts) und Sprague-Dawley-Ratten (200-250g, männlich) verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren, die mit Tieren zu tun haben, wurden von Mitarbeitern durchgeführt, die von den institutionellen Regelungsausschüssen geschult und genehmigt wurden. Bei allen Eingriffen wurde eine angemessene persönliche Schutzausrüstung verwendet.
1. Virale Transgenexpression in ventrikulären Geweben von Nagetieren
HINWEIS: Lagern Sie rekombinantes Adenovirus oder AAV, das das Zielgen und das entsprechende Kontrollvirus exprimiert, wie z. B. Ad-GFP (Titer von 1 x 10 10 PFU/ml) oder AAV9-GFP (Titer von 1 x 1013 GC/ml) (siehe Materialtabelle), in einem Gefrierschrank von -80 °C.
<ol><li>Am Tag der Virusinjektion tauen Sie das Virus auf Eis auf. Das Virus, das das Zielgen exprimiert, und das Kontrollvirus werden in zwei separate Spritzen (Volumen = 50 μL) mit 30 G 1/2 Nadeln abgesaugt und bis zur Verwendung auf Eis gehalten. HINWEIS: Alle Blasen in der Spritze und Nadel müssen sorgfältig entfernt werden.</li>
	<li>Verabreichung von Buprenorphin an Ratten oder Mäuse (0,05 mg/kg für Ratten, 0,1 mg/kg für Mäuse, subkutan), 1 h später eine Anästhesie mit 3% Isofluran induzieren und Isofluran bei 2% (in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,5-1,0 l/min) für das nachfolgende Verfahren halten.</li>
	<li>Kneifen Sie den Körper des Tieres (z. B. den Schwanz) vorsichtig mit einer Pinzette zusammen, und wenn das Tier nicht mit Körperbewegungen auf die Zwicke reagiert, wird eine ordnungsgemäße Anästhesie bestätigt.</li>
	<li>Halten Sie die Körpertemperatur mit einem elektrischen Heizkissen auf 37 °C. Rasieren Sie die Haare im Brustbereich mit einer Haarschneidemaschine. HINWEIS: Bei der Verwendung eines elektrischen Heizkissens ist Vorsicht geboten, da die Wärmeverteilung ungleichmäßig sein kann.</li>
	<li>Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.</li>
	<li>Halten Sie das Tier in Rückenlage und verwenden Sie ein präklinisches Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) für die Ultraschallbildgebung des Herzens des Tieres in der Kurzachsenausrichtung. HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt, die eine sterile Umgebung bietet. Es werden Standard-Sicherheitsverfahren, einschließlich solcher mit sicherer Nadelhandhabung, angewendet.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den linken unteren Brustbereich des Tieres mit abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis und Alkohol dreimal in kreisenden Bewegungen.</li>
	<li>Führen Sie unter Anleitung der Ultraschallbildgebung die 30 g 1/2 Nadel der Spritze mit dem Virus ein, wie in Schritt 1.1 hergestellt. über die linke untere Brustseite des Körpers in die Brust des Tieres.</li>
	<li>Nähern Sie sich der Nadelspitze in die linksventrikuläre vordere freie Wand und injizieren Sie langsam 10-15 μL des Virus. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion in Ultraschallbildern durch die erhöhte Helligkeit in der Nähe der Nadelspitze. HINWEIS: Die Menge an Virus, die an jeder Stelle injiziert wird, beträgt nicht mehr als 15 μl, um eine physische Schädigung des Myokardgewebes zu verhindern.</li>
	<li>Ziehen Sie die Nadel aus dem Herzen und führen Sie sie in andere Regionen des linken Ventrikels ein, um eine zweite und dritte Injektion der gleichen Virusmenge zu erhalten. ANMERKUNG: Die Gesamtzahl der Injektionsstellen wird durch das Versuchsdesign bestimmt. Wenn eine fokale Transgenexpression erforderlich ist, ist nur eine Injektion erforderlich. Wenn eine diffusivere Transgenexpression erforderlich ist, sind in der Regel mehrere Injektionsstellen (drei bis fünf) erforderlich.</li>
	<li>Nach Abschluss der Injektionen ist das Tier wieder in seinen Käfig zu bringen.</li>
	<li>Überwachen Sie das Tier sorgfältig, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brusthöhlenliegen aufrechtzuerhalten, und bringen Sie es in seinen Aufenthaltsraum zurück.</li>
	<li>Verabreichen Sie dem Tier in den folgenden 2 Tagen Buprenorphin HCl (0,1 mg/kg, zweimal täglich bei Mäusen, 0,05 mg/kg, zweimal täglich bei Ratten, subkutan). Bringen Sie die Tiere in das Vivarium zurück und überwachen Sie sie täglich auf ungewöhnliche Anzeichen von Schmerzen oder Leiden, und wenn sie gefunden werden, behandeln Sie die Tiere gemäß den Protokollen des Institutional Animal Care Committee.</li>
</ol>2. Beurteilung der Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen
HINWEIS: 4-6 Tage nach der Adenovirus-Injektion und 1-2 Wochen nach der AAV-Injektion ist die Anfälligkeit der Tierherzen für Herzrhythmusstörungen gemäß den Schritten 2.1.-2.2 zu beurteilen.
<ol><li>Führen Sie eine Langendorff-Perfusion des Ratten- oder Mausherzens durch.<ol><li>Bereiten Sie Tyrode-Lösung vor, indem Sie Folgendes in 1 l Wasser geben: NaCl, 7,9 g (final = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); und Glukose, 1,8 g (10 mM). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Die Lösung wird in den Schritten 2.1.6.-2.2.8 kontinuierlich mit einem 0,2-μm-Filter filtriert und mit 100%O2 aufgeblasen.</li>
		<li>Verabreichen Sie der Ratte oder Maus Heparin (500 E/kg, intraperitoneale Injektion) und betäuben Sie das Tier 10 Minuten später mit 3% Isofluran. Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie mit einer sanften Prise auf den Körper.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Skalpell, um einen vertikalen Schnitt von 1-1,5 cm in der Mitte des Schlüsselbeins für eine linke Thorakotomie zu machen und das Herz freizulegen.</li>
		<li>Sammeln Sie das Herz, indem Sie mit einer Schere auf Höhe des Aortenbogens schneiden und geben Sie das Herz sofort in eiskalte Tyrode-Lösung. HINWEIS: Es ist Vorsicht geboten, das Herz während der Herzentnahme nicht zu schädigen.</li>
		<li>Die Aorta des Herzens wird mit einer stumpfen Nadel (18 g für Ratten; 23 g für Mäuse) kantiert, die mit einem modifizierten Langendorff-Perfusionssystem (siehe Materialtabelle) im Modus mit konstanter Durchflussrate verbunden ist. Stellen Sie die Durchflussrate ein, um den Perfusionsdruck bei 70-80 mmHg zu halten. HINWEIS: Eventuelle Blasen in der Perfusionsnadel müssen vor der Aortenkanüle entfernt werden. Die Verwendung eines Präpariermikroskops erleichtert die Kanülierung.</li>
		<li>Das kanülierte Herz wird mit dem linken Ventrikel nach oben in einemit Silikonelastomer beschichtete 9,10 cm Kunststoffschale gegeben und das Herz 9,12 mit O2-Bubbled-Tyrode-Lösung bei 37 °C durchblutet.</li>
		<li>Überprüfen Sie die korrekte Aortenkanülation zu Beginn der Perfusion, indem Sie das Auswaschen von Blut aus dem Herzen während der ersten zwei bis drei Herzschläge und die Veränderung der Herzfarbe von rot zu blass beobachten.</li>
		<li>Platzieren Sie die Elektroden eines Kleintier-EKG-Systems (siehe Materialtabelle) um das Herz herum, indem Sie sie in die Silikonelastomerbeschichtung in der Schale einführen (Abbildung 1). Zeichnen Sie das EKG mit einer kompatiblen Software auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine adrenerge Rezeptorstimulation und eine programmierte elektrische Stimulation durch, um ventrikuläre Tachyarrhythmien zu induzieren.<ol><li>Nach erfolgreicher Aortenkanüle wird das Herz 20 Minuten lang mit Tyrode-Lösung durchblutet, um das Herzpräparat zu stabilisieren.</li>
		<li>1 μM Isoproterenol (siehe Materialtabelle) zu der Tyrode-Lösung geben, die in den Schritten 2.2.3.-2.2.8 für die Herzperfusion verwendet wird.</li>
		<li>Nach 10 Minuten Isoproterenol-Perfusion stimulieren Sie das Herz an der Spitze mit zwei Platinelektroden, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden sind (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Beginnen Sie mit dem Stimulationsverfahren (Abbildung 2), das 10 aufeinanderfolgende Stimuli (S1, 5 V, 100 ms-Intervalle) umfasst, denen ein zusätzlicher Stimulus (S2) mit einem Anfangsintervall von 80 ms folgt. Reduzieren Sie das S2-Intervall jedes Mal wiederholt um 2 ms, bis der Herzschlag nicht mehr erfasst werden kann (d. h. die effektive Refraktärperiode des Herzens erreicht wird, ERP)13.</li>
		<li>Überwachen Sie alle induzierten ventrikulären Tachyarrhythmien (einschließlich ventrikulärer Tachykardie und Flimmern) durch EKG.</li>
		<li>Wenn durch das obige Verfahren keine Arrhythmien induziert werden, fügen Sie nach S2 einen weiteren zusätzlichen Stimulus (S3) mit den gleichen Anfangs- (80 ms) und Dekrementintervallen (um 2 ms) hinzu, bis das ERP erreicht ist.</li>
		<li>Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden, fügen Sie nach S3 einen weiteren zusätzlichen Stimulus (S4) mit den gleichen Anfangs- und Dekrementintervallen hinzu, bis das ERP erreicht ist.</li>
		<li>Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden (wie es bei gesunden Kontrollherzen zu erwarten ist), stoppen Sie das elektrische Stimulationsprotokoll und betrachten Sie das Herz als nicht induzierbar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
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<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
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<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
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<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Langendorff-durchbluteten, isolierten Herzpräparation. Erstens ist es wichtig, eine Schädigung des Herzens während der Herzentnahme zu vermeiden (z.B. durch versehentliches Quetschen oder Schneiden mit der Schere). Zweitens ist es wichtig, das gesammelte Herz so schnell wie möglich in kalte Tyrode-Lösung zu geben, da dies den Herzschlag stoppt und den Sauerstoffverbrauch des Herzens reduziert. Drittens darf das Einführen der Nadel in die Aorta nicht zu tief sein – ide...

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und kostetenallein im Jahr 2017 18 Millionen Menschen das Leben1. Nagetiere, insbesondere Mäuse und Ratten, sind aufgrund der einfachen Handhabung und der Verfügbarkeit verschiedener transgener Überexpressions- oder Knockout-Linien zum am häufigsten verwendeten Modell in der kardiovaskulären Forschung geworden. Nagetiermodelle waren von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und für die Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Ziele bei Myokardinfarkt2, Bluthochdruck3, Herzinsuffizienz4 und Atherosklerose5. Die Verwendung von Nagetieren in Studien zu Herzrhythmusstörungen ist jedoch durch ihre geringe Herzgröße und schnellere Herzfrequenz im Vergleich zu menschlichen oder großen Tiermodellen begrenzt. Daher sind spontane letale Arrhythmien bei Mäusen oder Ratten nach Myokardinfarkt selten2. Die Forscher sind gezwungen, sich auf indirekte sekundäre Veränderungen zu konzentrieren, die ein pro-arrhythmisches Substrat wie Fibrose oder Genexpression widerspiegeln könnten, ohne signifikante Veränderungen der Arrhythmiebelastung oder pro-arrhythmischer Tendenzen zu zeigen. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird im vorliegenden Protokoll eine Methode beschrieben, die eine zuverlässige Beurteilung der Anfälligkeit von Mäuse- und Rattenherzen für ventrikuläre Tachyarrhythmien nach genetischer Veränderung 6,7 oder Myokardinfarkt2 ermöglicht. Diese Methode kombiniert die adrenerge Rezeptorstimulation mit der programmierten elektrischen Stimulation, um ventrikuläre Tachyarrhythmien in isolierten, Langendorff-perfundierten8 Maus- und Rattenherzen zu induzieren.
Standardansätze für den viralen Gentransfer in Nagetier-Myokardgewebe beinhalten häufig die Exposition des Herzens durch die Thorakotomie 9,10,11, die ein invasives Verfahren ist und mit einer verzögerten Genesung der Tiere nach dem Eingriff verbunden ist. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur direkten intramyokardialen Injektion von Viren unter Ultraschallbildgebung zur Überexpression von Transgenen. Dieses weniger invasive Verfahren ermöglicht im Vergleich zur Thorakotomie eine schnellere Genesung der Tiere nach der Virusinjektion und weniger Gewebeverletzungen, reduziert postoperative Schmerzen und Entzündungen beim Tier und ermöglicht somit eine bessere Beurteilung der Auswirkungen transgener Gene auf die Herzfunktion.

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide Nadel</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Adeno-assoziiertes Virus (AAV9-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus (Ad-GFP)</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank (Level II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>Modell #: BK-2-4</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Vetergesic</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Haarschneider</td><td>WAHL Clipper Corporation</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20701</td><td>705 LT, Volumen 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Life Brand</td><td>E12107</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fresenius Kabi</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Fresenius Kabi Ltd.</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenolhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 Software</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>Version 8.1.5</td><td>für EKG-Aufzeichnung</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse (Ctnnb1flox/flox)</td><td>Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse (&alpha; MHC-MerCreMer)Jackson</td> <td>Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>für Langendorff System</td></tr><tr><td>MS400 Schallkopf</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Salbe</td><td>Systane</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Druckmessgerät</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td><td>für Langendorff System</td></tr><tr><td>Pumpe</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td><td>für Langendorff System</td></tr><tr><td>Ratte (Sprague-Dawley, männlich)</td><td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>Down Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>für Langendorff-System</td></tr><tr><td>Kleintier-EKG-System</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Powerlab 8/35 und Tier Bio Amp</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 Präklinisches Bildgebungssystem</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

virale transgenexpression in nagetierherzen und die bewertung des risikos für herzrhythmusstörungen

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Herzerkrankungen sind weltweit die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität. Aufgrund der einfachen Handhabung und des Reichtums an transgenen Stämmen sind Nagetiere zu unverzichtbaren Modellen für die kardiovaskuläre Forschung geworden. Spontane letale Herzrhythmusstörungen, die bei Patienten mit Herzerkrankungen häufig zum Tod führen, sind jedoch in Nagetiermodellen für Herzerkrankungen selten. Dies ist in erster Linie auf die Unterschiede in den elektrischen Eigenschaften des Herzens zwischen Menschen und Nagetieren zurückzuführen und stellt eine Herausforderung für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen an Nagetieren dar. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um eine effiziente Transgenexpression im ventrikulären Myokard von Maus und Ratte unter Verwendung von echokardiografischen intramuskulären Injektionen von rekombinantem Virus (Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus) zu ermöglichen. Diese Arbeit skizziert auch eine Methode, die eine zuverlässige Beurteilung der kardialen Anfälligkeit für Arrhythmien unter Verwendung isolierter, Langendorff-perfundierter Maus- und Rattenherzen mit sowohl adrenergen als auch programmierten elektrischen Stimulationen ermöglicht. Diese Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Herzrhythmusstörungen, die mit einem nachteiligen kardialen Umbau nach Verletzungen wie Myokardinfarkt verbunden sind.

Bei Perfusion nach dem hier beschriebenen Protokoll (Abbildung 1) schlägt ein isoliertes Ratten- oder Mausherz mindestens 4 Stunden lang rhythmisch und stabil. Wenn das Versuchsdesign eine längere Dauer der Herzdurchblutung erfordert, ist es hilfreich, Albumin in die Perfusionslösung zu geben, um das Auftreten von Myokardödemen nach längerer Perfusionzu reduzieren 14. Die Aufnahme von Isoproterenol in die Perfusionslösung ahmt die Aktivierung des sympathischen Nervens...

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Dieses Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, eine effiziente Transgenexpression im ventrikulären Myokard zu erreichen, was Genexpressionsstudien zur Untersuchung von Herzrhythmusstörungen und Funktionen im ventrikulären Gewebe erleichtert. Die Technik zur viralen Transgenexpression ist für das Tier minimal-invasiv und verursacht weniger Schäden und kürzere Erholungszeiten als herkömmliche Ansätze, die eine Thorakotomie beinhalten. Die Technik zur Induktion von Arrhythmien in kleinen Nagetierherzen ist nützlich, um die Anfälligkeit für Arrhythmien in Kleintiermodellen für Herzerkrankungen zu beurteilen.Das Verfahren wird von Dr. Alice Lu, einer Postdoktorandin aus dem Labor, demonstriert. Sterilisieren Sie zunächst den linken unteren Brustbereich der anästhesierten Maus mit abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis in Alkohol, dreimal in kreisförmiger Bewegung. Führen Sie unter Anleitung der Ultraschallbildgebung die Nadel der Spritze mit dem Virus in die Brust des Tieres ein.Nähern Sie sich der Nadelspitze in die linksventrikuläre vordere freie Wand und injizieren Sie langsam 10 bis 15 Mikroliter des Virus. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion in Ultraschallbildern durch die erhöhte Helligkeit in der Nähe der Nadelspitze. Ziehen Sie die Nadel aus dem Herzen und führen Sie sie in andere Regionen des linken Ventrikels ein, um eine zweite und dritte Injektion der gleichen Virusmenge zu erhalten.Um eine Langendorff-Perfusion des Mausherzens durchzuführen, legen Sie das kanülierte Herz in eine mit Silikonelastomer beschichtete, 10 Zentimeter lange Kunststoffschale mit dem linken Ventrikel nach oben. Kanulieren Sie die Aorta des Herzens mit einer stumpfen Nadel, die mit einem modifizierten Langendorff-Profusionssystem im Modus mit konstanter Flussrate verbunden ist. Perfundiert Sie das Herz mit sauerstoffbeblasener Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius.Überprüfen Sie zu Beginn der Perfusion die korrekte Aortenkanülation, indem Sie die Auswaschung des Blutes aus dem Herzen während der ersten zwei bis drei Herzschläge beobachten und die Herzfarbe von rot zu blass ändern. Stellen Sie die Durchflussrate so ein, dass der Perfusionsdruck bei 70 bis 80 Millimeter Quecksilbersäule bleibt. Legen Sie nach der Bestätigung die Elektroden eines Kleintier-EKG-Systems um das Herz herum, indem Sie sie in die Silikon-Elastomer-Beschichtung in der Schale einführen.Zeichnen Sie dann das EKG mit einer kompatiblen Software auf. Als nächstes führen Sie eine adrenerge Rezeptorstimulation durch und perfundiert das Herz mit Isoproterenol und Tyrode-Lösung. Führen Sie nach 10 Minuten eine programmierte elektrische Stimulation durch, um ventrikuläre Tachyarrhythmien zu induzieren, indem Sie das Herz an der Spitze mit zwei Platinelektroden stimulieren, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden sind.Starten Sie den Stimulationsvorgang mit den ersten 10 aufeinanderfolgenden Stimuli S1, gefolgt von einem zusätzlichen Stimulus S2 mit einem Anfangsintervall von 80 Millisekunden. Reduzieren Sie dann das S2-Intervall jedes Mal wiederholt um zwei Millisekunden, bis der Herzschlag nicht mehr erfasst werden kann oder die effektive Refraktärperiode (ERP) des Herzens erreicht ist. Überwachen Sie alle induzierten ventrikulären Tachyarrhythmien, einschließlich ventrikulärer Tachykardie und Flimmern, durch EKG.Wenn keine Arrhythmien induziert werden. Fügen Sie nach S2 einen weiteren zusätzlichen Stimulus, S3, mit den gleichen Parametern hinzu, bis das ERP erreicht ist. Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden, stoppen Sie die elektrische Stimulation und betrachten Sie das Herz als nicht induzierbar.Während der programmierten elektrischen Stimulation wird das erfolgreiche Pacing des Herzens durch die Eins-zu-Eins-Erfassung des Herzschlags während der aufeinanderfolgenden S1-Stimuli und des verlängerten QRS-Komplexes während des S1-Pacings verifiziert. Diese kombinierten adrenergen und elektrischen Stimulationen induzierten keine ventrikulären Tachyarrhythmien bei gesunden, scheinoperierten Wildtyp-Mausherzen oder bei Kontroll-Adenovirus-GFP-injizierten Rattenherzen. Im Gegensatz dazu induzierte das gleiche Protokoll ventrikuläre Tachyarrhythmien bei 77 % der Wildtyp-Mäuseherzen nach Myokardinfarkt und bei drei von vier Ratten nach intramyokardialer Injektion von Ad-Wnt3a.Achten Sie beim Einführen der Nadel darauf, dass die Nadelspitze in die freie Wand und nicht in den Ventrikel eingebettet ist. Auch die Sicherung und Kanülierung der Aorta des Herzens ist der kritischste Schritt. Nach diesen Verfahren können Herzen für histologische Standardstudien oder molekularbiologische Tests verwendet werden.Alternativ können lebende Zellen isoliert werden, um einzellige elektrophysiologische Studien durchzuführen.

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Forschung

JoVE Journal

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Biologie

Telemetric EKG wurde als ein wesentliches Instrument bei der Beurteilung von Tiermodellen für Herzrhythmusstörungen und den plötzlichen Herztod entwickelt. Hier präsentieren wir eine schrittweise Anleitung zur telemetrischen EKG-Aufzeichnungen für den Einsatz in langfristige ambulante EKG-Überwachung in Mäusen.

Ambulante EKG-Aufzeichnung in Mäuse

Eine Methode des Gentransfers für die Behandlung von ischämischen Herzinsuffizienz wird anhand einer Schweinegrippe-Modell des Myokardinfarkts. Unsere einfache und reproduzierbare Methode ermöglicht es uns, leicht Beurteilung der Wirksamkeit verschiedener Gen-Transfers mit einer sehr einfachen und reproduzierbaren Art und Weise.

Gentransfer bei ischämischen Herzinsuffizienz in einem vorklinischen Modell

In diesem Video demonstrieren wir die rekombinante Adeno-assoziierte Virus-basierte Genabgabe im Maus-Welpen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung der Genexpression in den Zielzellen.

Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen mit primären neonatalen Kardiomyozyten von Ratten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Dies ermöglicht detaillierte Beobachtungen zellulärer Prozesse in lebenden Kardiomyozyten.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

In diesem Manuskript wird eine Methode zur Herstellung rekombinanter Adeno-assoziierter Virus 9 (rAAV9) Vektoren zur Manipulation der Genexpression im Mausherz beschrieben.

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und Lager Dynamik mit einem ex-Vivo Langendorff Setup.

Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System

Diese Arbeit berichtet über eine Methode zur Kontrolle des Herzrhythmus intakter muriner Herzen von transgenen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) Mäusen unter Verwendung lokaler Photostimulation mit einem Mikro-LED-Array und gleichzeitiger optischer Kartierung des Epikardialmembranpotentials.

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

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Großtiermodell zur Evaluierung der Wirksamkeit der Gentherapie beim ischämischen Herzen

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

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Erfahren Sie eine minimal-invasive Methode zur viralen Transgenexpression in Nagetierherzen mittels intramyokardialer Injektion unter Ultraschallführung. Diese Technik ermöglicht die Bewertung von Herzrhythmusstörungen im isolierten Langendorff-Herz.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

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