Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie
5. Juli 2022
Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.
Bei dieser Methode wird die Kraft direkt auf den Kern ausgeübt. Dadurch entkoppelt sich der Kraftübertragungseffekt von der Zellplasmamembran und dem Zytoskelett und enthüllt die molekularen Mechanismen der Kernmechanosensing. Die Kraft wird in den lebenden Zellen nicht-invasiv angewendet.
Im Vergleich zu optischen Pinzetten beeinflussen das Magnetfeld und die Magnetkraft die Zellfunktionen nicht und haben einen höheren Durchsatz. Beginnen Sie mit der Kultivierung der Zellen mit magnetischen Mikroperlen, indem Sie 0,2 Gramm Carbonyleisen-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von sieben Mikrometern wiegen. Die Mikrokügelchen werden mit einer Pipette in einem Milliliter RPMI 1640-Kulturmedium aufgehängt.
Dann bringen Sie die Petrischale mit B2B-Zellen zur Biosicherheitswerkbank und geben schnell 200 Mikroliter des Mediums mit Mikroperlen in die Petrischale. Legen Sie die Petrischale in einen Inkubator, bis Mikroperlen von den Zellen verinnerlicht sind. Öffnen Sie das inverse Mikroskop und bestimmen Sie mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzbildgebung alle sechs Stunden den optimalen Zeitpunkt für die Internalisierung der Zelllinien, indem Sie die Mikroperlen-, Kern- und Zellgrenze visualisieren.
Die internalisierten Mikrokügelchen werden innerhalb der Zellgrenze vorhanden sein. Öffnen Sie für die Anwendung kleiner Kräfte und die Bildgebung lebender Zellen die Softwareanwendung Elements. Um die magnetische Suche in der Konfiguration zu definieren, klicken Sie auf die Schaltfläche eins über zwei, um die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro zwei Sekunden einzustellen.
Stellen Sie die Lochgröße auf 1,2 Airy-Einheit ein. Überprüfen Sie nur den FITC-Kanal und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um den magnetischen YAP-Kern für die Konfiguration zu definieren, stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro vier Sekunden ein, indem Sie auf die Schaltfläche eins über vier klicken.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1.2 Airy-Einheit, um die Lochgröße auf 1.2 Airy-Einheit einzustellen und den FITC-Kanal zu überprüfen. Stellen Sie PMT HV auf 70, versetzt auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um die Kerngrenze und die Intensität der Kernfärbung abzubilden, überprüfen Sie den Cyanin-5-Kanal.
Klicken Sie nicht auf die Taste 1.2 Airy Unit und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null und Laserintensität auf 10 ein. Die Pinhole-Größe wird für die dreidimensionale YES-assoziierte Proteinbildgebung optimiert. Aktivieren Sie als Nächstes die DIA über Elemente.
Öffnen Sie die Spin-Ansicht, verwenden Sie ein Hellfeld und passen Sie den Fokus des Objekts an, um ein klares Bild der Zellen im Fokus zu erhalten. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv, um mehrere einzelne Zellen unter drei Bedingungen zu finden, z. B. eine Zelle mit einer einzelnen Mikroperle im Inneren, mit mehreren Mikroperlen im Inneren und ohne Mikroperle im Inneren. Wechseln Sie dann zum 40X-Objektiv und benennen Sie diese Position mit der entsprechenden Positionsnummer.
Öffnen Sie Elemente, klicken Sie auf Magnetsuche, entfernen Sie die Verriegelung, scannen Sie dann Registerkarten und wählen Sie dann die oberen und unteren Tasten, um die Z-Position der Fokusebene anzupassen, um die untere und obere Grenze für den Z-Stapel der ausgewählten Zellen festzulegen. Beenden Sie den Scanvorgang, indem Sie erneut auf Scan klicken. Wechseln Sie zur magnetischen YAP-Kernkonfiguration und setzen Sie den Dateinamen auf before_small_force.nd2.
Klicken Sie auf den Run-Button mit dem aufgezeichneten Z-Stack. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie die Spin-Ansicht und klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche.
Bewegen Sie den Magneten auf 46 Millimeter über dem Petrischalenboden, indem Sie den Knopf der Magnetbewegungsvorrichtung drehen. Speichern und überprüfen Sie das Video, um die durch Magnetkraft induzierte Mikroperlenverschiebung zu bestätigen. Wiederholen Sie den Scanvorgang, indem Sie den Dateinamen auf after_small_force.nd2 festlegen.
Wechseln Sie anschließend zum rechten Lichtpfad, schalten Sie DIA ein und öffnen Sie die Spin-Ansicht, bevor Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken. Drehen Sie den Magnet-Moving-Device-Knopf bis zu 120 Millimeter über dem Petrischalenboden und speichern Sie eine Hellfeld-Bildsequenz oder ein Video. Wiederholen Sie die Schritte zum Scannen, indem Sie den Dateinamen auf before_large_force.nd2 setzen.
Die Mikrokügelchen können unter Laseranregung im FITC- oder Cyanin-5-Kanal keine Fluoreszenz emittieren. So wurden die internalisierten Mikrokügelchen durch die dunkle Mulde identifiziert, die sich in der konfokalen Bildgebung der Fluoreszenz von YES-assoziiertem Protein und Zellkern befindet. Die Kernzirkularität zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrollzellen und Zellen mit Mikroperleninternalisierung.
Das YES-assoziierte Proteinzellkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis von Kontrollzellen, die mit Mikroperlen, aber ohne Internalisierung kokultiviert wurden, und Zellen mit Mikroperleninternalisierung zeigten ebenfalls keinen signifikanten Unterschied. Die Kernverformung und Depolymerisation von Aktin wurde durch die Kompressionskraft verursacht, die von den Mikroperlen in zytoskeletthaltigen Zellen ausgeübt wird. Die Kalibrierkurve der quantitativen Bildanalyse, die durch die quantitative AFM-Kraftverschiebungsbeziehung bereitgestellt wird.
Basierend auf dieser Beziehung wurde die aufgebrachte Kraft der Perlen geschätzt. Die Kernverformung und die YES-assoziierte Proteintranslokation wurden bei Anwendung oder Freisetzung der magnetischen Kraft beobachtet. Die Intensitätsänderungen des YES-assoziierten Proteins im grünen Kanal und keine Änderung der Kernfärbung im roten Kanal bestätigten, dass die durch die Magnetkraft induzierte Kernverformung durch die YES-assoziierte Proteintranslokation ausgelöst wurde.
Die Quantifizierung der Nettoänderung des YES-assoziierten Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses innerhalb von zwei Gruppen bestätigte, dass die Magnetkraft, die auf die Mikroperlen innerhalb des Zytoplasmas ausgeübt wird, die YES-assoziierte Proteintranslokation induzierte und das YES-assoziierte Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis veränderte. Bevor Sie Kraft und Bildgebung anwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen die magnetischen Mikroperlen verinnerlicht haben und sich die Perlen innerhalb der Zellgrenze befinden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht ein neues Protokoll zur direkten Anwendung mechanischer Kraft auf den Zellkern mithilfe magnetischer Mikroperlen in lebenden Zellen, das gleichzeitig die fluoreszenzbasierte Bildgebung an lebenden Zellen ermöglicht. Diese Technik liefert Erkenntnisse über Mechanosensorik-Mechanismen des Zellkerns, die funktionieren, ohne zelluläre Prozesse zu stören.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Mechanobiologie
- Abbildungstechniken
Hintergrund
- Das Verständnis der nukleären Mechanosensorik ist entscheidend für die zelluläre Funktion.
- Bisherige Techniken wie optische Pinzetten sind invasiv und weniger effizient.
- Magnetische Mikroperlen bieten eine nicht-invasive Methode, um diese Mechanismen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Anwendung mechanischer Kraft mittels magnetischer Mikroperlen.
- Live-Cell-Bildgebung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.
- Quantitative Bildanalyse zur Messung kraftinduzierter Kerndeformation.
Hauptergebnisse
- Die Kraftanwendung durch Mikroperlen führte zu einer Verformung des Zellkerns und zur Translokation des mit YES assoziierten Proteins.
- Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Kernrundheit zwischen Kontrollzellen und Zellen mit Mikroperlen-Internalisierung beobachtet.
- Die Studie bestätigt, dass magnetische Kräfte die mechanotransduktiven Signalwege des Zellkerns beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll vertieft das Verständnis des nukleären Mechanosensings.
- Es bietet einen nicht-invasiven Ansatz zur Untersuchung zellulärer Mechanik und Signalwege.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die direkte mechanische Untersuchung des Zellkerns mithilfe von 3D-Magnetkraft-Aktuatoren und Live-Cell-Fluoreszenzbildgebung ermöglicht eine präzise, nichtinvasive Analyse der nukleären Mechanotransduktion. Dieser Ansatz schließt eine entscheidende Wissenslücke beim Verständnis, wie die Mechanik des Zellkerns zelluläre Signalwege beeinflusst, und stärkt die Vorhersagekraft in der frühen Entdeckung und Zielvalidierung. Die quantitativen Ergebnisse und Echtzeit-Auslesungen des Verfahrens machen es zu einem strategischen Instrument für die mechanistische Entlastung von Risiken und die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Überprüfung von Hypothesen zur nukleären Mechanosensorik unabhängig von Störungen durch Membran und Zytoskelett.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Mechanotransduktionswegen durch Quantifizierung der Dynamik des mit YES assoziierten Proteins (YAP) als Reaktion auf kontrollierte nukleäre Verformung.
- Bietet eine mechanistische Entlastung, indem nukleäre Beiträge zur zellulären Signalübertragung isoliert werden, was die Zielidentifikation und -priorisierung unterstützt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung validierter, lebender Zellsysteme für nachgeschaltete Mechanobiologie-Assays.
- Liefert reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten für YAP-Translokation und nukleäre Deformationsparameter.
- Ermöglicht die Standardisierung von Kraftanwendung und Bildgebungsparametern und unterstützt die Skalierbarkeit des Assays sowie die Wiederverwendung der Plattform.
Translationale und präklinische Forschung
- Erfasst krankheitsrelevante Mechanobiologie, indem nukleäre Reaktionen auf mechanische Belastung in modifizierten Zelllinien modelliert werden.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem quantitative Biomarker der nukleären Mechanotransduktion bereitgestellt werden.
- Verringert das Übersetzungsrisiko, indem die Rolle der nukleären Mechanik bei der Zellfunktion und Pathologie geklärt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine direkte, quantitative Beurteilung der nukleären Mechanotransduktion ermöglicht und sowohl hypothesengetriebene Forschung als auch die Entwicklung von Assays unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur nukleären Mechanosensorik und die Aufklärung von Signalwegen, indem nukleäre und zytoplasmatische Effekte voneinander entkoppelt werden.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Bildgebungsdaten für den vergleichenden Analysen mechanosensitiver Reaktionen.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen der nukleären Deformation und der YAP-Translokation für eine robuste statistische Auswertung.
- Translationale Forschung: Ermöglicht mechanistische Einblicke, die für Krankheitsmodelle relevant sind, bei denen die nukleäre Mechanik eine Rolle spielt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für Studien zur Mechanobiologie über verschiedene Zelltypen und experimentelle Bedingungen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem nukleäre Mechanotransduktionsmechanismen isoliert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Mechanobiologie-Assays.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verringert biologische Risiken in späteren Stadien durch quantitative, echtzeitfähige Messungen.
- Portfolio-Wirkung: Fördert die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung mechanosensitiver Targets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung, der Anwendung magnetischer Kräfte und der quantitativen Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und magnetischen Aktuatorgeräten.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Kraftrückführung und den Bildgebungsprotokollen voraus.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Zelltypen oder mechanosensitive Signalwege erforderlich.
- Die Durchsatzkapazität und der Kraftbereich sind durch die Effizienz der Mikroperlen-Internalisierung und die Bildgeschwindigkeit begrenzt.
