Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie
July 5th, 2022
Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.
Bei dieser Methode wird die Kraft direkt auf den Kern ausgeübt. Dadurch entkoppelt sich der Kraftübertragungseffekt von der Zellplasmamembran und dem Zytoskelett und enthüllt die molekularen Mechanismen der Kernmechanosensing. Die Kraft wird in den lebenden Zellen nicht-invasiv angewendet.
Im Vergleich zu optischen Pinzetten beeinflussen das Magnetfeld und die Magnetkraft die Zellfunktionen nicht und haben einen höheren Durchsatz. Beginnen Sie mit der Kultivierung der Zellen mit magnetischen Mikroperlen, indem Sie 0,2 Gramm Carbonyleisen-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von sieben Mikrometern wiegen. Die Mikrokügelchen werden mit einer Pipette in einem Milliliter RPMI 1640-Kulturmedium aufgehängt.
Dann bringen Sie die Petrischale mit B2B-Zellen zur Biosicherheitswerkbank und geben schnell 200 Mikroliter des Mediums mit Mikroperlen in die Petrischale. Legen Sie die Petrischale in einen Inkubator, bis Mikroperlen von den Zellen verinnerlicht sind. Öffnen Sie das inverse Mikroskop und bestimmen Sie mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzbildgebung alle sechs Stunden den optimalen Zeitpunkt für die Internalisierung der Zelllinien, indem Sie die Mikroperlen-, Kern- und Zellgrenze visualisieren.
Die internalisierten Mikrokügelchen werden innerhalb der Zellgrenze vorhanden sein. Öffnen Sie für die Anwendung kleiner Kräfte und die Bildgebung lebender Zellen die Softwareanwendung Elements. Um die magnetische Suche in der Konfiguration zu definieren, klicken Sie auf die Schaltfläche eins über zwei, um die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro zwei Sekunden einzustellen.
Stellen Sie die Lochgröße auf 1,2 Airy-Einheit ein. Überprüfen Sie nur den FITC-Kanal und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um den magnetischen YAP-Kern für die Konfiguration zu definieren, stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro vier Sekunden ein, indem Sie auf die Schaltfläche eins über vier klicken.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1.2 Airy-Einheit, um die Lochgröße auf 1.2 Airy-Einheit einzustellen und den FITC-Kanal zu überprüfen. Stellen Sie PMT HV auf 70, versetzt auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um die Kerngrenze und die Intensität der Kernfärbung abzubilden, überprüfen Sie den Cyanin-5-Kanal.
Klicken Sie nicht auf die Taste 1.2 Airy Unit und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null und Laserintensität auf 10 ein. Die Pinhole-Größe wird für die dreidimensionale YES-assoziierte Proteinbildgebung optimiert. Aktivieren Sie als Nächstes die DIA über Elemente.
Öffnen Sie die Spin-Ansicht, verwenden Sie ein Hellfeld und passen Sie den Fokus des Objekts an, um ein klares Bild der Zellen im Fokus zu erhalten. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv, um mehrere einzelne Zellen unter drei Bedingungen zu finden, z. B. eine Zelle mit einer einzelnen Mikroperle im Inneren, mit mehreren Mikroperlen im Inneren und ohne Mikroperle im Inneren. Wechseln Sie dann zum 40X-Objektiv und benennen Sie diese Position mit der entsprechenden Positionsnummer.
Öffnen Sie Elemente, klicken Sie auf Magnetsuche, entfernen Sie die Verriegelung, scannen Sie dann Registerkarten und wählen Sie dann die oberen und unteren Tasten, um die Z-Position der Fokusebene anzupassen, um die untere und obere Grenze für den Z-Stapel der ausgewählten Zellen festzulegen. Beenden Sie den Scanvorgang, indem Sie erneut auf Scan klicken. Wechseln Sie zur magnetischen YAP-Kernkonfiguration und setzen Sie den Dateinamen auf before_small_force.nd2.
Klicken Sie auf den Run-Button mit dem aufgezeichneten Z-Stack. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie die Spin-Ansicht und klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche.
Bewegen Sie den Magneten auf 46 Millimeter über dem Petrischalenboden, indem Sie den Knopf der Magnetbewegungsvorrichtung drehen. Speichern und überprüfen Sie das Video, um die durch Magnetkraft induzierte Mikroperlenverschiebung zu bestätigen. Wiederholen Sie den Scanvorgang, indem Sie den Dateinamen auf after_small_force.nd2 festlegen.
Wechseln Sie anschließend zum rechten Lichtpfad, schalten Sie DIA ein und öffnen Sie die Spin-Ansicht, bevor Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken. Drehen Sie den Magnet-Moving-Device-Knopf bis zu 120 Millimeter über dem Petrischalenboden und speichern Sie eine Hellfeld-Bildsequenz oder ein Video. Wiederholen Sie die Schritte zum Scannen, indem Sie den Dateinamen auf before_large_force.nd2 setzen.
Die Mikrokügelchen können unter Laseranregung im FITC- oder Cyanin-5-Kanal keine Fluoreszenz emittieren. So wurden die internalisierten Mikrokügelchen durch die dunkle Mulde identifiziert, die sich in der konfokalen Bildgebung der Fluoreszenz von YES-assoziiertem Protein und Zellkern befindet. Die Kernzirkularität zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrollzellen und Zellen mit Mikroperleninternalisierung.
Das YES-assoziierte Proteinzellkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis von Kontrollzellen, die mit Mikroperlen, aber ohne Internalisierung kokultiviert wurden, und Zellen mit Mikroperleninternalisierung zeigten ebenfalls keinen signifikanten Unterschied. Die Kernverformung und Depolymerisation von Aktin wurde durch die Kompressionskraft verursacht, die von den Mikroperlen in zytoskeletthaltigen Zellen ausgeübt wird. Die Kalibrierkurve der quantitativen Bildanalyse, die durch die quantitative AFM-Kraftverschiebungsbeziehung bereitgestellt wird.
Basierend auf dieser Beziehung wurde die aufgebrachte Kraft der Perlen geschätzt. Die Kernverformung und die YES-assoziierte Proteintranslokation wurden bei Anwendung oder Freisetzung der magnetischen Kraft beobachtet. Die Intensitätsänderungen des YES-assoziierten Proteins im grünen Kanal und keine Änderung der Kernfärbung im roten Kanal bestätigten, dass die durch die Magnetkraft induzierte Kernverformung durch die YES-assoziierte Proteintranslokation ausgelöst wurde.
Die Quantifizierung der Nettoänderung des YES-assoziierten Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses innerhalb von zwei Gruppen bestätigte, dass die Magnetkraft, die auf die Mikroperlen innerhalb des Zytoplasmas ausgeübt wird, die YES-assoziierte Proteintranslokation induzierte und das YES-assoziierte Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis veränderte. Bevor Sie Kraft und Bildgebung anwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen die magnetischen Mikroperlen verinnerlicht haben und sich die Perlen innerhalb der Zellgrenze befinden.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Diese Studie untersucht ein neues Protokoll zur direkten Anwendung mechanischer Kraft auf den Zellkern unter Verwendung magnetischer Mikroperlen in lebenden Zellen, während eine fluoreszente Bildgebung lebender Zellen ermöglicht wird. Diese Technik offenbart Einblicke in nukleare Mechanosensierungsmechanismen und funktioniert ohne Störung zellulärer Prozesse.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Mechanobiologie
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Das Verständnis der nuklearen Mechanosensierung ist entscheidend für die zelluläre Funktion.
- Bestehende Techniken wie optische Pinzetten sind invasiv und weniger effizient.
- Magnetische Mikroperlen bieten eine nicht-invasive Methode, um diese Mechanismen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Anwendung mechanischer Kraft unter Verwendung magnetischer Mikroperlen.
- Bildgebung lebender Zellen mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.
- Quantitative Bildanalyse zur Messung der kraftinduzierten nuklearen Deformation.
Hauptergebnisse
- Die Kraftanwendung durch Mikroperlen führte zu nuklearer Deformation und Translokation von YES-assoziiertem Protein.
- Keine signifikanten Unterschiede in der nuklearen Rundungsgrad zwischen Kontrollzellen und solchen mit Mikroperlen-Internalisierung.
- Die Studie bestätigt, dass magnetische Kraft nukleare Mechanotransduktionswege beeinflusst.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll verbessert das Verständnis der nuklearen Mechanosensierung.
- Es bietet einen nicht-invasiven Ansatz zur Untersuchung zellulärer Mechanik und Signalwege.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Direct mechanical interrogation of the cell nucleus using 3D magnetic force actuators and live-cell fluorescence imaging enables precise, non-invasive analysis of nuclear mechanotransduction. This approach addresses a critical gap in understanding how nuclear mechanics influence cellular signaling, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The method's quantitative outputs and real-time readouts position it as a strategic asset for mechanistic de-risking and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of nuclear mechanosensing hypotheses independent of membrane and cytoskeletal confounders.
- Supports functional validation of mechanotransduction pathways by quantifying YES-associated protein (YAP) dynamics in response to controlled nuclear deformation.
- Provides mechanistic de-risking by isolating nuclear contributions to cellular signaling, informing target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, live-cell systems for downstream mechanobiology assays.
- Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for YAP translocation and nuclear deformation metrics.
- Enables standardization of force application and imaging parameters, supporting assay scalability and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanobiology by modeling nuclear responses to mechanical stress in engineered cell lines.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing quantitative biomarkers of nuclear mechanotransduction.
- Reduces translational risk by clarifying the role of nuclear mechanics in cell function and pathology.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct, quantitative assessment of nuclear mechanotransduction, supporting both hypothesis-driven research and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nuclear mechanosensing and pathway clarification by decoupling nuclear and cytoplasmic effects.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of mechanosensitive responses.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of nuclear deformation and YAP translocation for robust statistical analysis.
- Translational Research: Offers mechanistic insights relevant to disease models where nuclear mechanics are implicated.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanobiology studies across diverse cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating nuclear mechanotransduction mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through quantitative, real-time readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanosensitive targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, magnetic force application, and quantitative image analysis.
- Needs access to confocal fluorescence microscopy and magnetic actuator instrumentation.
- Demands cross-team standardization of force calibration and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or mechanosensitive pathways.
- Throughput and force range are limited by microbead internalization efficiency and imaging speed.
