Name: Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Konstruktion eines Organ-on-a-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta. Diese Methode ermöglicht die präzise Simulation biomechanischer Dehnungen für Arzneimittelscreening und personalisierte Medizin bei Aortenerkrankungen.

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Die Autoren bestätigen, dass diese Arbeit durch Zuschüsse der Science and Technology Commission der Stadtverwaltung Shanghai (20ZR1411700), der National Natural Science Foundation of China (81771971) und des Shanghai Sailing Program (22YF1406600) unterstützt wurde.

Menschliche Aortenproben wurden für die primäre HASMC-Isolierung unter Genehmigung des Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortenproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer aufsteigenden Aortenoperation im Zhongshan Hospital der Fudan-Universität unterzogen. Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
1. Primäre Isolierung der glatten Muskelmuskulatur des Menschen
<ol><li>Waschen Sie die rechte laterale Region der aufsteigenden Aorta mit sterilem PBS, 1x-2x.</li>
	<li>Entfernen Sie die Intima- und Adventitiaschichten des Gewebes mit zwei Augenzangen und behalten Sie die Medienschicht bei, um die Zellen zu ernten.</li>
	<li>Legen Sie die Medienschicht auf eine 10 cm große Kulturschale und schneiden Sie sie mit einer Schere in kleine Stücke (2-3 mm). Fügen Sie 5 ml glattes Muskelzellkulturmedium (SMCM) hinzu, das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.</li>
	<li>Bewegen Sie das kleine Gewebe mit einer sterilen Pipette in die Kulturflasche und verteilen Sie das Gewebe gleichmäßig. Entsorgen Sie das Kulturmedium so weit wie möglich und drehen Sie die Flasche dann verkehrt um.</li>
	<li>2 ml SMCM in die invertierte Kulturflasche geben und bei 37 °C für 1-2 h in den Inkubator (5%CO2) stellen, dann langsam auf die rechte Seite drehen und weitere 2 mL SMCM hinzufügen.</li>
	<li>Nach 5-7 Tagen Inkubation das SMCM gegen 4 ml frisches SMCM austauschen. Im Allgemeinen klettern sporadische glatte Muskelzellen in etwa 2 Wochen heraus.</li>
	<li>Verwerfen Sie das SMCM langsam und fügen Sie es langsam hinzu, wenn Sie das Medium wechseln. Transportieren Sie die Kulturflasche langsam, wenn Sie sich zu einer Mikroskopstation bewegen. Andernfalls schwimmen die Gewebe und die Zellen wachsen langsam.</li>
	<li>Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz erreicht haben, waschen Sie mit 2 ml PBS, verdauen Sie sie mit 2 ml 0,25% Trypsin und teilen Sie sie in zwei neue Kulturflaschen mit 4 ml frischem SMCM.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Zellen durch eine Immunfluoreszenzanalyse von vier verschiedenen spezifischen Markern für glatte Muskelzellen (CNN1, SM22)14.</li>
</ol>2. Vorbereitung des PDMS-Chips
<ol><li>Um PDMS zu polymerisieren, fügen Sie Härter (B-Komponente) zur Basis (A-Komponente) mit einem Gewichtsverhältnis von A: B = 10: 1 w/w hinzu und mischen Sie den Komplex vollständig für 5 min; Das Volumen hängt von der Notwendigkeit der Studie ab.</li>
	<li>Das vorbereitete PDMS-Gel für 30-60 min in einen Vakuumextraktionstank geben und den Druck unter -0,8 mPa halten. HINWEIS: Hoher Druck führt zu einer unzureichenden Extraktion kleiner Blasen im PDMS-Gel, die den nächsten Schritt der Chipherstellung beeinträchtigen.</li>
	<li>Entwerfen Sie die Form mithilfe einer CAD-Software (Computer Aided Design) mit einer 100 mm × 40 mm × 8 mm Außenrahmenstruktur und einem 70 mm × 6 mm × 4 mm Kanal.</li>
	<li>Maßgeschneiderte Herstellung der Formen der drei Schichten mit einer hochpräzisen numerisch gesteuerten Graviermaschine. Schneiden Sie den Rahmen der Formen und die Mikrokanäle mit Polymethylmethacrylat (PMMA) -Platten heraus und kleben Sie sie dann auf eine andere PMMA-Platte.</li>
	<li>Gießen Sie das vorbereitete PDMS-Gel auf eine Form mit einem 100 mm × 40 mm × 6 mm Außenrahmen und 70 mm × 6 mm × 4 mm Kanal und vernetzen Sie dann bei 70 °C für 1-2 h.</li>
	<li>Die vernetzten PDMS-Platten aus der Form abziehen und die kommerzialisierten PDMS-Membranen in 100 mm × 40 mm Abschnitte schneiden.</li>
	<li>Behandeln Sie die drei vorbereiteten PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen 5 min lang mit Sauerstoffplasma zur PDMS-Oberflächenaktivierung. Wenden Sie die folgenden spezifischen Einstellungen an: Raumluft als Prozessgas; Druck eingestellt auf -100 kPa; Strom auf 180--200 Ma eingestellt; Spannung auf 200 V eingestellt; Prozesszeit bis 5 min.</li>
	<li>Stanzen Sie Löcher auf den drei PDMS-Platten mit einem 1-mm-Locher, um den Ein- und Auslass von Luft und mittleren Mikrokanälen auf dem PDMS-Chip herzustellen.</li>
	<li>Verbinden Sie drei PDMS-Platten und zwei PDMS-Membranen in der Reihenfolge: Luftkanal-PDMS-Platte (oberste Schicht) - PDMS-Membran - Mittelkanal-PDMS-Platte (mittlere Schicht) - PDMS-Membran- Luftkanal-PDMS-Platte (untere Schicht). Führen Sie diesen Schritt unter einem stereoskopischen Mikroskop bei 4x durch, um die Luftmikrokanäle vollständig mit den mittleren Mikrokanälen zu überlappen.</li>
	<li>Legen Sie den bestückten PDMS-Chip für 1 h in einen 70 °C Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie mehrere 1 mm Innendurchmesser und 3 cm lange Latexschläuche vor. Führen Sie eine 1 mm Außendurchmesser und eine 1 cm lange Edelstahlnadel in ein Ende des vorbereiteten Schlauchs ein und führen Sie dann einen Luer in das andere Ende des Schlauchs ein, um das Rohr zu erzeugen, das mit den Luft- und mittleren Mikrokanälen des PDMS-Chips verbunden ist.</li>
	<li>Stecken Sie die vorbereiteten Röhrchen in die Aus- und Einlässe der Luft- und Medienmikrokanäle auf dem PDMS-Chip.</li>
</ol>3. PDMS-Chip-Oberflächenbehandlung und Sterilisation
<ol><li>Infusion von 2 ml 80 mg/ml Mauskollagen in den mittleren Mikrokanal des PDMS-Chips mit einer 2-ml-Spritze und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation das Kollagen aus dem Kanal und sammeln Sie es mit einer 2-ml-Spritze. Legen Sie die kollagenbeschichteten PDMS-Chips über Nacht in einen 60 °C heißen Inkubator.</li>
	<li>Legen Sie die PDMS-Chips für mehr als 1 h in einen UV-Sterilisator. Legen Sie die sterilisierten PDMS-Chips zur Vorbereitung auf das Zellexperiment auf eine ultrareine Bank.</li>
</ol>4. Zellaussaat auf dem PDMS-Chip und Zelldehnungsprozess
<ol><li>Kultur 4 x 10 5 primäre menschliche glatte Muskelzellen (HASMCs) von Patienten, die glattes Muskelzellmedium (SMCM) mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin in einem5 %CO2-Inkubator bei 37 °C verwenden.</li>
	<li>Wenn die HASMC-Dichte 80% erreicht, verwerfen Sie die SMCM und waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS.</li>
	<li>Die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin für 2 min verdauen und bei 100 x g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem SMCM. Verwenden Sie 8 ml SMCM, um die Zellen auf einer 10 cm großen Kulturschale zu kultivieren.</li>
	<li>Berechnen Sie die Zellzahl mit einem Zytometer und verwenden Sie die Zellen in einer Endkonzentration von 2 x 105 Zellen/ml.</li>
	<li>Gießen Sie langsam 2 ml PBS in den kollagenbeschichteten und sterilisierten PDMS-Chip-Mikrokanal und entsorgen Sie ihn später mit einer 2-ml-Spritze.</li>
	<li>Gießen Sie langsam insgesamt 2 mL 2 x 105 Zellen/ml HASMC-Suspension mit einer 2-ml-Spritze in den mittleren Mikrokanal des PDMS-Chips. Schließen Sie dann den Luer am Ein- und Ausgang des PDMS-Chips. Legen Sie den PDMS-Chip für 1 Tag bei 37 °C in einen Inkubator (5%CO2).</li>
	<li>Nachdem die Zellen an der PDMS-Membran im PDMS-Chip befestigt sind, verbinden Sie fast nach 24 h den Auslass des Luftmikrokanals auf dem PDMS-Chip mit dem Vakuum-Controller-System. Wenn die Zelle befestigt ist, kann eine längliche, normale Zellform unter dem Mikroskop gesehen werden, im Gegensatz zu den suspendierten runden Zellen.</li>
	<li>Schalten Sie das Magnetventil und die Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie den Vakuumregler und stellen Sie das Druckniveau auf 10 kPa für 7,18 ± 0,44% Dehnung und 15 kPa für 17,28 ± 0,91% Dehnung ein.</li>
	<li>Nachdem die Parameter der Steuerung eingestellt sind, legen Sie die PDMS-Chips in einen Inkubator (5% CO2) bei 37 °C und dehnen sie für 24 h.</li>
</ol>5. Vorbereitung der mechanischen Steuerung
<ol><li>Bereiten Sie mehrere Magnetventile, Vakuumfilter, Vakuumregler, eine Vakuumpumpe, eine Schlauchpumpe und eine speicherprogrammierbare Steuerung (SPS) vor, die das Magnetventil steuert.</li>
	<li>Programmieren Sie die SPS-Steuerung und stellen Sie das Ein-/Aus-Zeitintervall auf 1 Hz ein. Verbinden Sie die Magnetventile mit der programmierten Steuerung.</li>
	<li>Verbinden Sie den Einlass der Vakuumpumpe mit den Vakuumfiltern und dann den Ausgang der Vakuumfilter mit den Vakuumreglern. Verbinden Sie den Ausgang der Vakuumregler mit Magnetventilen und schließlich den Ausgang der Magnetventile mit den Auslässen der Luftmikrokanäle der PDMS-Chips.</li>
	<li>Verbinden Sie den Ausgang der Schlauchpumpe mit dem Einlass des mittleren Mikrokanals des PDMS-Chips und den Einlass der Schlauchpumpe mit dem Ausgang des mittleren Mikrokanal-PDMS-Chips für den Austausch des Kulturmediums und die Handhabung von Medikamenten.</li>
	<li>Stellen Sie die Amplitude der Dehnung durch den Regler und die Dehnungsfrequenz durch den Mikrocontroller ein.</li>
</ol>

<ol><li>Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection%3A+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14%2C000+cases+from+1987+to+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li>
<li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+arterial+remodeling%3A+lessons+from+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li>
<li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP%2FTAZ+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li>
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<li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans%3F+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902(2018).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organs-on-chips+for+disease+modelling%2C+drug+development+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li>
<li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li>
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<li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301(2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mit der rasanten Entwicklung der mikrofluidischen Technologie sind in den letzten Jahren OOC-Modelle entstanden, die die biologische Funktion und Struktur eines oder mehrerer Organe in vitro für Anwendungen in Biologie, Medizin und Pharmakologie replizieren können15. OOC kann Schlüsselfunktionen der menschlichen physiologischen Mikroumgebung simulieren, die für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Förderung der präklinischen Arzneimitteltranslation unerlässlich sind<sup class...

Thoraxaortenaneurysma und -dissektion (TAAD) ist eine lokalisierte Dilatation oder Delaminierung der Aortenwand, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht1. Menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs) spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von TAAD. HASMCs sind keine terminalen differenzierten Zellen, und HASMCs behalten eine hohe Plastizität, so dass sie den Phänotyp als Reaktion auf verschiedene Reize wechseln können2. HASMCs werden hauptsächlich in vivo rhythmischen Zugbelastungen ausgesetzt, was einer der Schlüsselfaktoren ist, die morphologische Veränderungen, Differenzierung und physiologische Funktionen der glatten Muskulatur regulieren 3,4. Daher kann die Rolle der zyklischen Belastung bei der Untersuchung von HASMCs nicht ignoriert werden. Herkömmliche 2D-Zellkulturen können jedoch die biomechanische Stimulation zyklischer Belastungen, die HASMCs in vivo erfahren, nicht replizieren. Darüber hinaus ist die Konstruktion eines Tier-TAAD-Modells für einige Arten von TAAD nicht geeignet, wie z. B. BICUSPIDAL-Aortenklappe (BAV)-bezogene TAAD. Darüber hinaus kann die Artenlücke zwischen klinischen Humanstudien und Tierversuchen nicht ignoriert werden. Es behindert die pharmazeutische Übersetzung in der klinischen Praxis. Daher besteht ein dringender Bedarf an komplexeren und physiologischen Systemen, um die biomechanische Umgebung in vivo bei der Erforschung von Aortenerkrankungen zu simulieren.
Tierversuche, die in der biomedizinischen Forschung und Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden, sind kostspielig, zeitaufwendig und ethisch fragwürdig. Darüber hinaus können die Ergebnisse aus Tierstudien häufig nicht die Ergebnisse vorhersagen, die in klinischen Studien am Menschen erzielt wurden 5,6. Der Mangel an präklinischen Modellen am Menschen und die hohe Ausfallrate in klinischen Studien haben zu wenigen wirksamen Medikamenten für die Klinik geführt, was die Gesundheitskosten erhöht hat7. Daher ist es dringend notwendig, andere experimentelle Modelle zu finden, die Tiermodelle ergänzen. Mikrofabrikation und mikrofluidische Techniken haben sich in den letzten Jahren stark entwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die Nachteile traditioneller 2D-Zellkulturtechniken beheben und ein realistischeres, kostengünstigeres und effizienteres In-vitro-Modell für physiologische Studien und Arzneimittelentwicklung etablieren. Mit Hilfe mikrofluidischer Geräte werden Organe-on-Chips etabliert, um lebende Zellen in mikrometergroßen Kammern mit unterschiedlichen Reizen zu kultivieren, um die Schlüsselfunktionen eines Gewebes oder Organs zu replizieren. Das System besteht aus einzelnen oder mehreren mikrofluidischen Mikrokanälen, wobei entweder eine Zellart in einer perfundierten Kammer kultiviert wird, die Funktionen eines Gewebetyps repliziert, oder verschiedene Zelltypen, die auf porösen Membranen kultiviert werden, um Grenzflächen zwischen verschiedenen Geweben nachzubilden. Mikrofluidische Organoide in Kombination mit patientenbasierten Zellen haben den einzigartigen Vorteil, den großen Artenunterschied zwischen Maus- und Humankrankheitsmodellen zu überbrücken und die Nachteile der traditionellen 2D-Zellkultur für die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Wirkstoffforschung zu überwinden. Mit der rasanten Entwicklung der Mikrofluidik in den letzten Jahren haben Forscher die Nützlichkeit von In-vitro-Organ-on-a-Chip (OOC)-Modellen erkannt, die komplexe biologische In-vivo-Parameter replizieren8. Diese mikrofluidischen Organoide simulieren biomechanische In-vitro-Umgebungen wie zyklische Dehnung, Scherspannung und Flüssigkeitsdruck und bieten eine dreidimensionale (3D) Zellkulturumgebung. Bis heute wurden mehrere OOC-Modelle etabliert, um biomechanische Reize in Organen wie Lunge9, Niere 10, Leber11, Darm12 und Herz13 zu simulieren, aber diese wurden nicht weit verbreitet auf die Untersuchung menschlicher Aortenerkrankungen angewendet.
In dieser Studie präsentieren wir ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) für glatte Aortenmuskelzellen, das die biomimetischen mechanischen Kräfte und Rhythmen steuern kann, die auf von TAAD-Patienten abgeleitete primäre HASMCs angewendet werden. Der Chip besteht aus dreischichtigen, dicken Platten aus Polydimethylsiloxan (PDMS), die mit Kanälen geätzt sind, und zwei kommerzialisierten hochflexiblen PDMS-Membranen. HASMCs werden auf den PDMS-Membranen kultiviert. Der Kanal in der Mitte des Chips ist mit einem Kulturmedium für die Zellkultur gefüllt. Die oberen und unteren Kanäle des Chips sind mit einem Vakuumdruckversorgungssystem verbunden, das den Rhythmus und die Frequenz der mechanischen Zugdehnung der PDMS-Membranen steuern kann. Rhythmische Belastungen, denen HASMCs ausgesetzt sind, können in HASMC-OOC simuliert werden, wodurch die biomechanische Mikroumgebung von Gewebe oder Organen repliziert wird, die mit herkömmlichen 2D-Kultursystemen nicht funktionell erreichbar ist. Mit dem Vorteil der hochauflösenden Echtzeit-Bildgebung und der biomechanischen Mikroumgebung können die biochemischen, genetischen und metabolischen Aktivitäten lebender Zellen für Gewebeentwicklung, Organphysiologie, Krankheitsätiologie, molekulare Mechanismen und Biomarkeridentifizierung, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Aortenerkrankungen untersucht werden. In Kombination mit gewebespezifischen und Patientenzellen kann dieses System für Medikamentenscreenings, personalisierte Medizin und Toxizitätstests eingesetzt werden. Dieses HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform zur Untersuchung der Pathogenese der Aortenerkrankung.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Beyotime</td><td>P0099-100ml</td><td>Wird zur Zellimmobilisierung</td></tr><tr><td>verwendet Alexa Fluor 350-markierte Ziege Anti-Kaninchen</td><td>IgG Beyotime</td><td>A0408</td><td>Antikörper zur Immunfärbung von</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Beyotime</td><td>ST025-20g</td><td></td></tr><tr><td>Calcium AM/PI</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab46794</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielle flexible PDMS-Membran</td><td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td><td>KYQ-200</td><td></td></tr><tr><td>F-Aktin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>M8318</td><td></td></tr><tr><td>Schläuche</td><td>Runze Fluid</td><td>96410</td><td>1 mm Innendurchmesser; 3 mm Außendurchmesser; 1 mm Wandstärke; Offizielle Website-Adresse: https://www.runzefluidsystem.com</td></tr><tr><td>Menschliche Aorten-Glatt -Muskelzelllinie CRL1999</td><td>ATCC</td><td>Chargennummer: 70019189</td><td></td></tr><tr><td>Bild J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Kostenloser Download: https://fiji.sc</td><td>Bildgebungsplattform, die zur Identifizierung der Fluoreszenzintensität verwendet wird</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Stellt sicher, dass die Temperatur, Luftfeuchtigkeit und die Lichteinwirkung während des gesamten Experiments < /> genau gleich sind.</td></tr><tr><td>Luer</td><td>Runze Fluid</td><td>RH-M016</td><td>Offizielle Website-Adresse: https://www.runzefluidsystem.com.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Kollagen</td><td>Sigma</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffplasma&nbsp;</td><td>Changzhou Hongming Instrument</td><td>HM-Plasma5L</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beyotime</td><td>C0221A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antibiodics zur Verhinderung einer bakteriellen Kontamination von Zellen während der Kultur.</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Kamoer</td><td>F01A-STP-B046</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>SPS-Steuerung</td><td>Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC-Fabrik</td><td>BR010-11T8X2M</td><td>Die detaillierte Programmeinstellung finden Sie in der Ergänzung. Offizielle Website-Adresse: files.http://www.btcnc.net</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>SMCM</td><td>ScienCell</td><td>Cat 1101</td><td></td></tr><tr><td>Magnetventil</td><td>SMC (China)</td><td>VQZ300</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300841</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Beyotime</td><td>ST795</td><td>Zum Durchdringen von Zellmembranen</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>10296010</td><td>Wird für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Trypsin verwendet</td><td>Sigma</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfilter</td><td>SMC (China)</td><td>ZFC5-6</td><td>Offizielle Website-Adresse: https://www.smc.com.cn</td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Kamoer</td><td>KVP15-KL-S</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumregler</td><td>AirTAC</td><td>GVR-200-06</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Name</td><td>Vorwärts (5' bis 3')</td><td>Rückwärtsgang (5' bis 3')</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td><td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td><td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td><td></td></tr></tbody></table>

konstruktion eines organ-on-a-chip-modells für glatte muskelzellen der menschlichen aorta zur rekapitulation biomechanischer dehnungen in der aortenwand

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Konventionelle zweidimensionale Zellkulturtechniken und Tiermodelle wurden bei der Untersuchung des menschlichen Thoraxaortenaneurysmas und der Dissektion (TAAD) verwendet. Menschliche TAAD kann jedoch manchmal nicht durch Tiermodelle charakterisiert werden. Es gibt eine offensichtliche Artenlücke zwischen klinischen Studien am Menschen und Tierversuchen, die die Entdeckung therapeutischer Medikamente behindern kann. Im Gegensatz dazu ist das konventionelle Zellkulturmodell nicht in der Lage, biomechanische Reize in vivo zu simulieren. Zu diesem Zweck haben sich Mikrofabrikations- und mikrofluidische Techniken in den letzten Jahren stark weiterentwickelt und bieten neuartige Techniken zur Etablierung von Organoid-on-a-Chip-Modellen, die die biomechanische Mikroumgebung nachbilden. In dieser Studie wurde ein humanes Organ-on-a-Chip-Modell (HASMC-OOC) entwickelt, um die pathophysiologischen Parameter der Aortenbiomechanik zu simulieren, einschließlich der Amplitude und Häufigkeit der zyklischen Belastung durch menschliche glatte Aortenmuskelzellen (HASMCs), die eine wichtige Rolle bei TAAD spielen. In diesem Modell wurde die Morphologie der HASMCs länglich, senkrecht zur Dehnungsrichtung ausgerichtet und zeigte unter Dehnungsbedingungen einen kontraktileren Phänotyp als unter statischen konventionellen Bedingungen. Dies stimmte mit der Zellorientierung und dem Phänotyp in nativen menschlichen Aortenwänden überein. Darüber hinaus haben wir unter Verwendung von bikuspidalen Aortenklappen-bezogenen TAAD (BAV-TAAD) und Trikuspidal-Aortenklappen-bezogenen TAAD (TAV-TAAD) patientenabgeleiteten primären HASMCs BAV-TAAD- und TAV-TAAD-Krankheitsmodelle etabliert, die HASMC-Eigenschaften in TAAD replizieren. Das HASMC-OOC-Modell bietet eine neuartige In-vitro-Plattform , die Tiermodelle ergänzt, um die Pathogenese von TAAD weiter zu erforschen und therapeutische Ziele zu entdecken.

Das HASMC-OOC-Modell besteht aus einem Vakuumsteuerungssystem, einem Umlaufsystem und PDMS-Chips sowie dem schematischen Aufbau des HASMC-OOC-Modells (Abbildung 1). Die Vakuumsteuerung besteht aus einer Vakuumpumpe, Magnetventilen und einer SPS-Steuerung. Als Kreislaufsystem wurde eine Schlauchpumpe verwendet, um das Zellkulturmedium aufzufrischen und Medikamente hinzuzufügen. Der PDMS-Chip bestand aus zwei Vakuumkammern und einer mittleren Kammer, die mit SMCM für das Zellwachstum gefüllt w...

Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Dieses Modell stimuliert biomechanische Reize, die glatte Muskelzellen in der menschlichen Aorta erfahren. In Kombination mit Patientenzellen kann dieses System für das Arzneimittelscreening und die personalisierte Medizin von Aortenerkrankungen verwendet werden. Dieses Modell kann die bloßen mechanischen Parameter der glatten Muskelzellen in der menschlichen Aorta nachahmen und präzise steuern, was eine neuartige In-vitro-Plattform für die Untersuchung und Pathogenese von Aortenerkrankungen bietet.Mieradilijiang Abudubat, ein Posterdoktor aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie mit dem Waschen der rechten lateralen Region der aufsteigenden Aorta mit sterilen pbs, ein- oder zweimal. Entfernen Sie die Intima- und eine Adventitiaschicht des Gewebes mit zwei Augenzangen und behalten Sie die Medienschicht, um die Zellen zu ernten.Legen Sie die Medienschicht auf eine 10 Zentimeter große Schale und schneiden Sie sie in zwei bis drei Millimeter große Stücke. Dann fügen Sie fünf Milliliter SMCM mit 10% fbs und 1% Penicillin Streptomycin zu den Gewebeproben hinzu. Bewegen Sie das kleine Gewebe mit einer sterilen Pipette in die Kulturflasche und verteilen Sie das Gewebe g

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Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden.

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Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

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In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

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Restenose nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein wichtiges Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Eine ideale Therapie würde die Proliferation der glatten Muskelzelle (VSMC) hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Wir beschreiben ein Modell zur gleichzeitigen Beurteilung der VSMC-Proliferation und Endothelfunktion in vivo.

Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

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Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

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Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

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Erzeugung von 3D-kollagen-eingebetteten A549/MRC-5 Alveolarorganoiden mit einem mechanischen Zellstreckungs-Bioreaktor

Erfahren Sie die Konstruktion eines Organ-on-a-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta. Diese Methode ermöglicht die präzise Simulation biomechanischer Dehnungen für Arzneimittelscreening und personalisierte Medizin bei Aortenerkrankungen.

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand (Video) | JoVE Journal

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

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