In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Dieses Protokoll beschreibt, wie DNA-Aptamere ausgewählt werden, die infektiöse Viren von nicht-infektiösen Viren unterscheiden können, um Sensormoleküle zu erhalten, die in der Lage sind, die Infektiosität von klinischen oder Umweltproben zu bestimmen. Diese Technik kann angewendet werden, um selektive Aptamere für viele andere Viren, einschließlich neu auftretender Viren, zu erhalten, da sie keine Vorkenntnisse über die Strukturen oder Sequenzen des Virus erfordert. Diese Technik ermöglicht die Entwicklung von Aptamer-Sensoren für die klinische Diagnostik und Umweltüberwachung infektiöser Viren, um zu erkennen, ob jemand ansteckend ist oder ob eine Umgebungsdesinfektionsmethode wie vorgesehen funktioniert.

Die Auswahl kann ein schwieriger Prozess sein, insbesondere für diejenigen, die neu darin sind. Es ist wichtig, die PCR-Bedingungen zu optimieren und den Fortschritt der Selektion mit qPCR zu überwachen. Das Verfahren wird Marcos Gramajo, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren.

Entwerfen Sie zunächst die anfängliche einzelsträngige oder SS-DNA-Bibliothek und die Primer. Beziehen Sie die DNA-Oligos aus kommerziellen Quellen mit Standard-Entsalzungsreinigung. Reinigen Sie die SS-DNA-Bibliothek und die Primer mit einer 10%igen denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Ethanolfällung.

Als nächstes besorgen Sie sich eine Stammlösung aus infektiösen und nicht-infektiösen Viren oder bereiten Sie sie wie im Textmanuskript beschrieben zu. Zur Denaturierung der SS-DNA-Bibliothek mischen Sie 10 Mikroliter der 100-Mikromolaren SS-DNA-Bibliothek mit 240 Mikrolitern SELEX-Puffer. Erhitzen Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einem Trockenbad und stellen Sie das Röhrchen dann für 15 Minuten auf Eis.

Mischen Sie 250 Mikroliter der SS-DNA-Bibliothek im SELEX-Puffer mit 50 Mikrolitern infektiösem Virus für eine positive Selektion. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie dann 400 Mikroliter einer millimolaren T20-Sequenz in einen 0,5-Milliliter-Filter, um die unspezifischen Stellen zu blockieren.

Inkubieren Sie die Filter 30 Minuten lang. Zentrifugieren Sie den Filter 10 Minuten lang bei 14.000 G, um die T20-Lösung zu entfernen. Waschen Sie den Filter anschließend dreimal mit SELEX-Puffer, um überschüssige T20-Sequenzen zu entfernen.

Als nächstes geben Sie die infektiöse Virusmischung der SS-DNA-Bibliothek in den verstopften 100-Kilodalton-Filter und die Zentrifuge, um ungebundene Sequenzen zu waschen. Waschen Sie den Filter dreimal, indem Sie 400 Mikroliter SELEX-Puffer hinzufügen und zentrifugieren. Lassen Sie die Fraktion im Filter und verwerfen Sie den Durchfluss.

Um gebundene Sequenzen zu eluieren, wechseln Sie das Auffangröhrchen des Zentrifugenfilters und geben Sie 300 Mikroliter SELEX-Puffer mit acht molaren Harnstoff in den Filter. Erhitzen Sie den Filter 15 Minuten lang auf 95 Grad Celsius und zentrifugieren Sie dann, um den Durchfluss mit den eluierten Sequenzen aufzufangen. Wenn Sie fertig sind, waschen Sie die Materialien mit 10%Bleichmittel.

Als nächstes wird die im vorherigen Schritt gesammelte infektiöse SS-DNA-Viruslösung in einen verstopften 10-Kilodalton-Filter gegeben, 15 Minuten lang bei 14.000 G zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Waschen Sie den Filter dreimal mit 300 Mikrolitern SELEX-Puffer, um den Harnstoff durch Zentrifugation zu entfernen, und verwerfen Sie den Durchfluss. Gewinnen Sie die Lösung im Filter zurück, indem Sie sie in einem sauberen Auffangröhrchen auf den Kopf stellen und fünf Minuten lang zentrifugieren.

Messen Sie das endgültige Volumen der gewonnenen Lösung mit einer Pipette und kennzeichnen Sie sie als Runde 1A-Probe. Nehmen Sie in der ersten Runde 90 % der Probe der Runde 1A als Vorlage und führen Sie die PCR unter optimierten Bedingungen durch. Um SS-DNA mit Streptavidin-modifizierten magnetischen Beads oder MB zu gewinnen, teilen Sie das Produkt in 50-Mikroliter-Aliquots auf und geben Sie diese in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern MB. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur.

Legen Sie dann das Röhrchen auf das magnetische Gestell, um den MB zu isolieren, und entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Waschen Sie den MB zweimal, indem Sie 200 Mikroliter Binde- und Waschpuffer in die Tube geben. Nehmen Sie dann das Röhrchen aus dem Magnetgestell und klopfen Sie darauf, bevor Sie das MB durch Pipettieren wieder in eine homogene Lösung bringen.

Legen Sie das Röhrchen wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand. Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie den MB in 100 Mikroliter SELEX-Puffer und erhitzen Sie die Lösung 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Legen Sie das Röhrchen sofort in das Magnetgestell und sammeln Sie den Überstand mit dem SS-DNA-Pool auf.

Wiederholen Sie diesen Wiederherstellungsschritt und fügen Sie 50 Mikroliter SELEX-Puffer hinzu. Messen Sie das Endvolumen der zurückgewonnenen Fraktion und bezeichnen Sie es als Runde 1X. Zur Denaturierung des SS-DNA-Pools werden 60 % der Round 1X-Probe entnommen und mit 50 Mikrolitern SELEX-Puffer vermischt.

Erhitzen Sie die Probe in einem Trockenbad und legen Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang auf Eis. Als nächstes wird der denaturierte SS-DNA-Pool in SELEX-Puffer mit 50 Mikrolitern jedes Virus als Gegenselektionsschritt gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Blockieren der unspezifischen Stellen in Zentrifugenfiltern wird der mit einer Viruslösung inkubierte denaturierte SS-DNA-Pool in einen verstopften 100-Kilodalton-Filter gegeben.

Zentrifugieren Sie den Filter bei 14.000 G für 10 Minuten und fangen Sie den Durchfluss auf. Nehmen Sie 300 Mikroliter Fraktion und mischen Sie sie mit 50 Mikrolitern infektiösem Virus, das 100 Millionen Kopien pro Milliliter enthält. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Bereiten Sie einen Standard-qPCR-Mastermix und Verdünnungen der gereinigten SS-DNA-Bibliothek vor, wie im Text beschrieben. Führen Sie die qPCR aus, um den Schwellenwertzyklus zu bestimmen. Verwenden Sie nach dem Lauf eine Standardkurve, um die Menge an SS-DNA in Runde 1A und Runde 1X zu quantifizieren.

Berechnen Sie dann die Elutionsausbeute als gebundene DNA-Menge geteilt durch die ursprüngliche DNA-Menge und tragen Sie die Elutionsausbeute über die runde Zahl auf. Zum Schluss zeichnen Sie die Schmelzkurven für verschiedene Runden. Wählen Sie für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz ein geeignetes, kommerziell erhältliches Kit aus.

Bereiten Sie mehrere Pools von Auswahlrunden vor, die eine hohe, mittlere und niedrige Anreicherung darstellen, sowie den endgültigen Pool mit einem anderen Indexpaar in den Adaptern für jeden Pool. Senden Sie dann die vorbereitete endgültige Bibliothek an die Sequenzierungseinrichtung. Für die Sequenzierungsanalyse wurden die Sequenzen von der Sequenzieranlage demultiplext.

Entfernen Sie die Sequenzadapter und Selektionsprimer mit dem Kommandozeilenprogramm Cutadapt. Verwenden Sie dann das FASTX-Toolkit-Programm, um Sequenzen mit geringer Qualität zu entfernen. Führen Sie dann die Sequenzdateien in umgekehrter Richtung mit denen in Vorwärtsrichtung zusammen, indem Sie das FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ Komplementfunktion für die Dateien in umgekehrter Richtung verwenden.

Verwenden Sie dann das integrierte CAT-Programm, um die Dateien zu einer einzigen Datei zusammenzuführen. Verwenden Sie das Analyse-Toolkit FASTAptamer, um die Anreicherung von Sequenzen über verschiedene Auswahlpools hinweg zu analysieren. Erstens, um die Clusterfunktionen FASTAptamer count und FASTAptamer zu verwenden, um ähnliche Sequenzen in Clustern zu gruppieren.

Verwenden Sie als Nächstes die Anreicherungsfunktion FASTAptamer, um Informationen zur Anreicherung von Sequenzen und Clustern abzurufen. Identifizieren Sie die Kandidaten-Aptamer-Sequenzen anhand der durch die Sequenzanalyse erhaltenen Anreicherungsinformationen. Wählen Sie mehrere Aptamersequenzen aus und führen Sie ein erstes Screening mit einem Bindungsassay durch.

In dieser Analyse wurde die qPCR verwendet, um den Verlauf von SELEX von infektiösen SARS-CoV-2-spezifischen Aptameren zu überwachen. Die Elutionsausbeute stieg zunächst mit jeder Runde von SELEX und pendelte sich in den Runden acht und neun ein. Durch den Vergleich der Schmelzkurven wurde eine Verschiebung vom Peak bei hoher Schmelztemperatur von 77 auf 79 Grad Celsius beobachtet.

Darüber hinaus wurde in den letzten beiden Runden ein Peak bei niedriger Schmelztemperatur beobachtet. Die relative Häufigkeit in Reads per Million für das sequenzierte SARS2 AR10, das über aufeinanderfolgende Auswahlrunden erhalten wurde, wird gezeigt. Die vorhergesagte Struktur von SARS2 AR10 zeigte eine strukturierte Sekundärstruktur, die eine Stammschleifenregion enthielt, die an der Erkennung des Virus beteiligt sein könnte.

Sobald Aptamere gewonnen wurden, können sie in elektrische Optiken, eine andere Art von Sensoren, eingebaut werden, um Portal- und Schnelltests zum Virusnachweis zu entwickeln, die die Infektiosität des Virus bestimmen können. Wir stellen uns vor, dass Aptamer, die für verschiedene Virusvarianten oder Stereotypen spezifisch sind, gewonnen werden können, was eine schnelle Überwachung von Varianten ermöglicht, die die größte Bedrohung für die Gesellschaft darstellen.