Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Unsere Protokolle helfen bei der Entwicklung genetisch veränderter Mäuse, die fortschrittliche In-vivo-Experimente mit Mäusen erfordern, wie z. B. die Visualisierung der Genexpression, die genetische Vermenschlichung und den bedingten Gen-Knockout. Die hier vorgestellte Technik der Genom-Editierung von Mauszygoten ermöglicht eine hocheffiziente, schnelle und einfache Induktion fortgeschrittener genetischer Modifikationen, wie z.B. Genkassetten-Knock-In und Flox. Da gentechnisch veränderte Mäuse in verschiedenen Forschungsbereichen wie Neurologie, Immunologie, Stoffwechsel, Fortpflanzung und Infektionskrankheiten eingesetzt werden, unterstützt unsere hier vorgestellte Technologie dieses breite Forschungsfeld grundlegend.

Natsumi Iki, Miyuki Ishida und Yoko Tanimoto, technische Mitarbeiter meines Labors, werden das Verfahren vorführen. Bereiten Sie zunächst zwei 35-Millimeter-Petrischalen für die Zygotenkultur vor und stellen Sie sie bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator. Sammeln Sie die Eileiter und legen Sie sie in einen 20-Mikroliter-Tropfen M2-Medium mit 0,75 Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase auf den Deckel der Petrischale.

Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette einen Eileiter auf und durchbluten Sie etwa 50 Mikroliter M2-Medium mit Hyaluronidase durch die Fimbrien. Nehmen Sie nach 30 Sekunden mit einer Glaskapillare morphologisch normale Zygoten mit einer kleinen Menge Medium auf und waschen Sie sie, indem Sie sie in frische M16-Medium-Tröpfchen übertragen. Geben Sie dann die gewaschenen Zygoten in eine Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zygoten gewonnen sind.

Ziehen Sie mit dem programmierbaren Pipettenzieher einige Glaspipetten heraus. Brechen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel, indem Sie auf die Glaskugel schlagen, die an der Spitze der Mikroschmiede befestigt ist. Überprüfen Sie die Spitzengröße unter dem Mikroskop bei 1.000-facher Vergrößerung und stellen Sie sicher, dass die Spitzengröße der Mikroinjektionsnadel einen Durchmesser von etwa einem Mikrometer hat.

Verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Mikroinjektionsnadel etwa zwei bis drei Millimeter von der Spitze entfernt zu biegen. Injizieren Sie 1 bis 1,5 Zentimeter der Betriebsflüssigkeit in die Mitte der Mikroinjektionsnadel und befestigen Sie diese mit dem Piezoaktor an der manuellen Mikroinjektorhalterung. Befestigen Sie als Nächstes die Haltenadel an der gegenüberliegenden manuellen Mikroinjektorhalterung und bewegen Sie die Betriebsflüssigkeit mit allmählichem Druck zur Mikroinjektionsnadelspitze.

Befestigen Sie die manuellen Mikroinjektorhalter am Mikromanipulator. Bereiten Sie eine Injektionskammer mit drei Tröpfchen vor. Erstens mit 10 Mikrolitern M2-Medium, zweitens mit fünf Mikrolitern 12%Polyvinylpyrrolidon in M2-Medium und drittens mit fünf Mikrolitern Gemisch aus crRNA, tracrRNA, Cas9-Protein und der Spender-DNA-Lösung.

Bedecken Sie die Tröpfchen mit Mineralöl und stellen Sie die Injektionskammer auf den inversen Mikroskoptisch. Senken Sie die Mikroinjektionspipette unter dem inversen Mikroskop bei einer 50-fachen Vergrößerung in den 12%PVP-Tropfen. Saugen Sie 12 % PVP ab und geben Sie es ab, um das Innere der Mikroinjektionsnadelspitze zu reinigen und auf das RNPD-Tröpfchen zu übertragen.

Setzen Sie den manuellen Mikroinjektor unter Unterdruck. Saugen Sie die RNPD-Lösung in die Mikroinjektionsnadel und warten Sie, bis ein ausreichendes Volumen abgesaugt ist. Füllen Sie unter 50-facher Vergrößerung das gesamte Innere der Mikroinjektionsnadel mit Flüssigkeit.

Stoppen Sie dann die Aufnahme und lassen Sie die RNPD-Lösung allmählich ausstoßen, indem Sie den manuellen Mikroinjektor auf Überdruck einstellen. Führen Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel in das Öl. Geben Sie 50 Zygoten in das M2-Tröpfchen und senken Sie die Haltepipette vorsichtig in dasselbe Tröpfchen.

Übertragen Sie die Mikroinjektionsnadel in den M2-Tropfen mit den Zygoten. Wechseln Sie zu einem 20-fachen Objektiv und konzentrieren Sie sich auf die Spitze der Mikroinjektionspipette. Nachdem Sie eine Zygote gehalten haben, konzentrieren Sie sich auf den Vorkern, indem Sie den Mikromanipulator bewegen.

Führen Sie die Mikroinjektionsnadel in die Zygote ein und bringen Sie die Spitze in die Nähe des Vorkerns. Sobald die Spitze die Vorkernmembran erreicht hat, wenden Sie den Piezoimpuls zum Durchstechen an. Wenn die Mikroinjektionsnadel den Vorkern durchsticht, injizieren Sie die RNPD-Lösung und beobachten Sie die Schwellung des Vorkerns.

Sobald der Vorkern vollständig aufgeblasen ist, ziehen Sie schnell die Nadel heraus und führen Sie den gleichen Vorgang sowohl am weiblichen als auch am männlichen Vorkern durch. Unterscheiden Sie die Zygoten vor und nach der Injektion, indem Sie die injizierte Zygote an eine andere Stelle innerhalb des M2-Tröpfchens verschieben, und injizieren Sie weiterhin alle Zygoten, die im M2-Tröpfchen vorhanden sind. Nach der Injektion die Zygoten in eine frische M16-Schale geben.

Wählen Sie die überlebenden Zygoten 10 Minuten nach der Injektion aus. Entfernen Sie die durch die Injektion beschädigten lysierten Zygoten und verteilen Sie die überlebenden Zygoten auf jedes Tröpfchen in der M16-Schale. Geben Sie eine kleine Menge Nährmedium, einige Luftblasen als Marker und die Zygoten in eine Pipette zum Übertragen.

Machen Sie mit einer Mikroschere einen Schnitt zwischen der Ampulle und den Fimbrien des Eileiters. Führen Sie die Zygoten in den Einschnitt ein und bestätigen Sie gleichzeitig, dass die Luftblase eingeführt wurde. Die mediane Produktionseffizienz von 13 unabhängigen Genkassetten-Knock-in-Mäusen betrug 20,8 % mit einem Maximum von 39,5 % und einem Minimum von 7,9 %Die mediane Geburtenrate unter dieser nicht-letalen Gen-Targeting-Bedingung betrug 34,0 % mit einem Maximum von 43,3 % und einem Minimum von 15,9 %Die mediane Produktionseffizienz der 10 unabhängigen Flox-Mäuse betrug 7,7 % mit einem Maximum von 20,7 % und einem Minimum von 2,1 %Obwohl die Funktionen mehrerer Zielgene unbekannt, die mittlere Geburtenrate betrug 30,2 % mit einem Maximum von 43,8 % und einem Minimum von 17,3 %Der Spitzendurchmesser der Injektionsnadel sollte nicht zu dünn sein, und der Druck des manuellen Injektors sollte angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Lösung in die Nadel injiziert und der Vorkern langsam aufgeblasen wird.